Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Okluzja / niedociśnienie 2-naczyniowe: szczurzy model globalnego niedokrwienia mózgu

19.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50173

⸱

22 czerwca 2013

 , 
1Department of Emergency Medicine, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Department of Physiology, Wayne State University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Obustronna niedrożność tętnicy szyjnej w połączeniu z niedociśnieniem ogólnoustrojowym powoduje globalne niedokrwienie mózgu u szczura, powodując uszkodzenie hipokampa z powtarzalnym nasileniem. Zwierzęta są upośledzone z przewidywalnymi wzorcami uszkodzeń mózgu, szybko wracają do zdrowia, a wskaźniki śmiertelności są stosunkowo niskie.

Streszczenie

Zatrzymanie akcji serca, po którym następuje resuscytacja, często prowadzi do dramatycznego uszkodzenia mózgu spowodowanego niedokrwieniem i późniejszą reperfuzją mózgu. Globalne niedokrwienie mózgu powoduje uszkodzenie określonych obszarów mózgu, które okazały się bardzo wrażliwe na niedokrwienie 1. Neurony hipokampa mają wyższą wrażliwość na uszkodzenia niedokrwienne w porównaniu z innymi populacjami komórek, a w szczególności region CA1 hipokampa jest szczególnie podatny na niedokrwienie/reperfuzję 2.

Projektowanie interwencji terapeutycznych, czyli badanie mechanizmów związanych z uszkodzeniem mózgu, wymaga modelu, który powoduje uszkodzenia podobne do stanu klinicznego i w powtarzalny sposób. Obustronna niedrożność naczynia szyjnego z niedociśnieniem (2VOH) to model, który powoduje odwracalne niedokrwienie przodomózgowia, naśladując zdarzenia mózgowe, które mogą wystąpić podczas zatrzymania akcji serca i resuscytacji. Opisujemy model zmodyfikowany z Smith et al. (1984) 2, po raz pierwszy przedstawiony w obecnej formie w Sanderson, et al. (2008) 3, który powoduje powtarzalne uszkodzenie selektywnie wrażliwych obszarów mózgu 3-6. Niezawodność tego modelu podyktowana jest precyzyjną kontrolą ogólnoustrojowego ciśnienia krwi podczas stosowanego niedociśnienia, czasem trwania niedokrwienia, ścisłą kontrolą temperatury, specyficznym schematem znieczulenia oraz staranną opieką pooperacyjną. 8-minutowe urazy niedokrwienne powoduje śmierć komórek neuronów hipokampa CA1, która postępuje w ciągu 6 do 24 godzin reperfuzji, podczas gdy mniej wrażliwe obszary mózgu są oszczędzane. Ta postępująca śmierć komórki jest łatwa do oszacowania po 7-14 dniach reperfuzji, ponieważ w tym czasie widoczna jest prawie całkowita utrata neuronów CA1.

Oprócz tego modelu uszkodzenia mózgu, prezentujemy metodę kwantyfikacji uszkodzeń CA1 przy użyciu prostej, ale dokładnej metodologii. Co ważne, kwantyfikacja może być realizowana za pomocą prostego mikroskopu zamontowanego na kamerze i bezpłatnej wtyczki oprogramowania ImageJ (NIH), co eliminuje potrzebę stosowania zbyt kosztownych programów do badań geologicznych i zmotoryzowanego stolika mikroskopowego do oceny uszkodzeń.

Wprowadzenie

Uszkodzenie mózgu w wyniku zatrzymania akcji serca i udaru mózgu jest główną przyczyną śmierci i długotrwałej niepełnosprawności. Podczas gdy resuscytacja krążeniowo-oddechowa u ofiar zatrzymania krążenia skutecznie przywraca spontaniczne krążenie u około 70 000 pacjentów rocznie w USA, 7,8 co najmniej 60% tych pacjentów umiera następnie w szpitalu w wyniku rozległego uszkodzenia mózgu, a tylko 3-10% reanimowanych pacjentów może powrócić do poprzedniego stylu życia9,10 . Nie ulega wątpliwości, że zrozumienie mechanizmów, które prowadzą do uszkodzenia mózgu w następstwie globalnego niedokrwienia mózgu i zaprojektowanie interwencji terapeutycznych w celu zminimalizowania urazu neurologicznego ma kluczowe znaczenie.

Niedokrwienie mózgu można modelować za pomocą wielu metod. Najczęściej niedokrwienie mózgu jest wytwarzane u gryzoni poprzez zamknięcie głównego naczynia krwionośnego w mózgu, środkowej tętnicy mózgowej, powodując w ten sposób ogniskowy udar niedokrwienny 11,12 . Chociaż jest to klinicznie ważne, ogniskowe niedokrwienie mózgu nie jest dokładną metodą badania uszkodzeń mózgu spowodowanych zatrzymaniem krążenia/resuscytacją. Aby modelować ten paradygmat kliniczny, cały mózg musi zostać doprowadzony do stanu niedokrwienia, a następnie ponownie wprowadzony przepływ krwi. Aby dokładnie naśladować ten obraz kliniczny, badacze eksperymentalnie wywołują zatrzymanie krążenia, a następnie resuscytację za pomocą RKO i defibrylacji 13,14 . Model ten jest istotny klinicznie, jednak nieprzewidywalny czas resuscytacji może zwiększyć zmienność i utrudnić interpretację danych. Ponadto model ten wiąże się z wysoką śmiertelnością, co dodatkowo zwiększa liczbę zwierząt niezbędnych do przetestowania hipotezy. Preferowane może być badanie reakcji mózgu na globalne niedokrwienie i/lub reperfuzję w bardziej powtarzalnej, spójnej i możliwej do przeżycia zniewadze.

Globalne niedokrwienie może być wywołane w mózgu, przy jednoczesnym zachowaniu części przepływu krwi w sposób ogólnoustrojowy. Zmniejsza to śmiertelność, a jednocześnie umożliwia badanie mechanizmów uszkodzenia tkanek w mózgu 2. Aby wywołać globalne niedokrwienie mózgu, konieczne jest przerwanie lub znaczne ograniczenie przepływu we wszystkich czterech naczyniach zaopatrujących mózg, tętnicach szyjnych wewnętrznych i tętnicach kręgowych. Naczynia te zaopatrują mózg w przepływ krwi przez strukturę naczyniową zwaną kołem Willisa, która tworzy pętlę zespolenia. Ta architektura naczyniowa pozwala mózgowi zachować perfuzję w przypadku bliższej niedrożności naczyń. Dlatego, aby wywołać całkowite niedokrwienie mózgu, musi nastąpić przepływ krwi przez wszystkie naczynia składowe. Niedrożność tętnicy szyjnej można osiągnąć za pomocą minimalnie inwazyjnego wycięcia brzusznej szyi i zastosowania klipsów do tętniaków na pożądany okres. Przerwanie przepływu krwi przez tętnice kręgowe może być trudne, ponieważ są one zamknięte w otworze poprzecznym kręgosłupa. Badacze rozwiązali ten problem poprzez elektrokoagulację tętnic kręgowych 24-48 godzin przed niedrożnością tętnic szyjnych i niedokrwieniem mózgu (model 4VO) 15. W przeciwieństwie do tego podejścia, Smith i in. opracowali metodę wywoływania globalnego niedokrwienia mózgu poprzez systemowe obniżanie średniego ciśnienia tętniczego krwi (MAP) do 40 mmHg w celu zmniejszenia perfuzji przez tętnice kręgowe do punktu, w którym przepływ krwi jest utracony lub znacznie zmniejszony 2. W połączeniu z niedrożnością tętnicy szyjnej, metoda ta powoduje niedokrwienie w całym przodomózgowiu, co skutkuje wzorcem uszkodzenia mózgu, który ściśle naśladuje u osób, które przeżyły zatrzymanie krążenia. W dalszym udoskonalaniu tej metody, prezentowany przez nas model wymaga ścisłej regulacji MAP na poziomie 30 mmHg ± 1mHg przez całe 8 minut niedokrwienia. Odkryliśmy, że ta zmiana poprawia odtwarzalność uszkodzeń mózgu wywołanych przez ten model, przy jednoczesnym zachowaniu niskiego wskaźnika śmiertelności oryginalnej techniki zaprojektowanej przez Smitha i wsp.

Dokładny fenotyp śmierci komórki i ogólny zakres uszkodzeń tkanek spowodowanych przez prezentowany tutaj model są bezpośrednio zależne od czasu trwania niedokrwienia 16. Po 8 minutach niedokrwienia neurony CA1 wykazują opóźnioną śmierć komórki, co sugeruje, że istnieje okno czasowe na interwencję terapeutyczną podczas fazy reperfuzji 15,17 . Na początku reperfuzji neurony szybko odzyskują funkcję i nie wykrywa się natychmiastowej śmierci komórki 18. Jednak ta zniewaga powoduje indukcję kaskad śmierci komórkowej (apoptozy), których kulminacją jest uwolnienie białek apoptogennych z mitochondriów, w tym cytochromu c, między 4-6 godzinami reperfuzji 3,19. Między 6 a 24 godziną reperfuzji neurony hipokampa CA1 zobowiązały się do śmierci komórki, a program apoptotycznej śmierci komórki jest wykonywany 19. Należy zauważyć, że fenotyp śmierci komórki odpowiedzialny za uszkodzenie niedokrwienne jest wysoce kontrowersyjny. Wczesne badania sugerowały, że martwica jest pierwotnym fenotypem śmierci komórki 20,21 , podczas gdy inne inne podają apoptozę jako główny mechanizm 22,23 . Ogólnie rzecz biorąc, obecne dowody sugerują, że komórki umierają z powodu spektrum fenotypów śmierci komórkowej, od klasycznej apoptozy po martwicę. Specyficzny tryb śmierci komórki zależy od wielu czynników, przy czym stopień udziału każdego fenotypu zależy między innymi od nasilenia zniewagi 24,25. Po 24 godzinach reperfuzji umierające komórki posiadają jądra piknotyczne, skondensowany cytozol z wyraźnymi dowodami na zagregowaną zawartość komórkową i utratę funkcjonalnej morfologii mitochondriów. Martwe komórki są dalej rozkładane, pochłaniane przez komórki odpornościowe, takie jak makrofagi i/lub mikroglej, i usuwane z regionu hipokampa CA1. Po 4-7 dniach reperfuzji martwe komórki są usuwane, a wszystko, co pozostaje, to komórki zapalne i aktywowane komórki glejowe 17,26 . Dlatego 7 dni reperfuzji stanowi optymalny czas, w którym śmierć neuronów w hipokampie CA1 można określić ilościowo za pomocą prostych, niespecyficznych barwników komórkowych, w tym fioletu krezylowego lub hemotoksyliny-eozyny, i policzyć na podstawie kryteriów włączenia morfologicznego. Komórki pozostające w tym późnym interwale reperfuzji można policzyć jako komórki, które przeżyły, zapewniając w ten sposób wskaźnik uszkodzenia mózgu.

Jeśli ten model ma być wykorzystany do testowania interwencji terapeutycznych, sugeruje się, aby projekt eksperymentalny był zgodny z kryteriami STAIR (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) 27. Wytyczne te powinny być przestrzegane podczas projektowania i przeprowadzania badania, jednak nie są one tutaj omawiane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach muszą być zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i muszą zostać zatwierdzone przez odpowiedni komitet opieki nad zwierzętami przed ich rozpoczęciem. Wszystkie przedstawione tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Wayne i są zgodne z wytycznymi dotyczącymi etycznego traktowania zwierząt, określonymi w Przewodniku dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz w Zasadach rządu Stanów Zjednoczonych dotyczących wykorzystania i opieki nad kręgowcami wykorzystywanymi w testach, Badania naukowe i szkolenia. Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować niezbędny materiał chirurgiczny oraz klatkę do rehabilitacji po operacji. Zabieg ten jest operacją przetrwania i dlatego konieczne jest ćwiczenie techniki sterylnej.

  1. Aby wykonać cewnik naczyniowy, wytnij rurkę z polietylenu 50 (PE50) o długości 8 cali i włóż igłę o rozmiarze 23 do jednego końca. Cewniki można kupić pojedynczo, wstępnie wysterylizowane lub kupić luzem, a następnie w razie potrzeby wysterylizować glikolem etylenowym.
  2. Przymocuj tę igłę do jednego portu trójdrożnego kranu i umieść kolejny trójdrożny kran na przeciwległym porcie. Heparynizuje krany i cewnik, przepuszczając przez nie roztwór soli fizjologicznej heparyny. Podłączyć strzykawkę z solą fizjologiczną o pojemności 10 ml do kranu prostopadle i dystalnie do cewnika. Podłączyć dystalny kran do cewnika do rurki przetwornika ciśnienia, napełnić układ solą fizjologiczną i usunąć pęcherzyki powietrza.
  3. Ustaw klatkę regeneracyjną zgodnie z przepisami dotyczącymi użytkowania zwierząt. Sala pooperacyjna powinna być cicha i mieć mały ruch. ważny: Włącz stół zstępujący lub podobny system oczyszczania gazu przed rozpoczęciem operacji w celu przefiltrowania odparowanego izofluranu.

2. Przygotowanie chirurgiczne

Szczury Sprague-Dawley (300-350 g) są używane w modelu 2VOH globalnego niedokrwienia przodomózgowia. Znieczulenie jest indukowane i utrzymywane za pomocą izofluranu i uzupełniane subdysocjacyjną dawką ketaminy. Zaobserwowaliśmy, że znieczulenie podtrzymywane przez sam izofluran powoduje zwiększone występowanie napadów padaczkowych podczas rekonwalescencji pooperacyjnej. Napady mogą przyczyniać się do uszkodzenia neuronów i śmiertelności, co wpłynie na odtwarzalność tego modelu. Uzupełnienie znieczulenia ketaminą pozwala znacznie mniejszej dawce izofluranu osiągnąć stopień znieczulenia chirurgicznego. Korzystanie z homeostatycznego koca termicznego pozwala na ścisłą regulację temperatury rdzenia. Zabieg chirurgiczny polega na przecięciu i odizolowaniu tętnicy szyjnej oraz przecięciu i kaniulacji tętnicy udowej.

Uwaga: Ważne jest, aby prowadzić szczegółowe zapiski podczas każdego indywidualnego zabiegu chirurgicznego. Zmiany temperatury głębokiej, ciśnienia krwi lub innych zmiennych fizjologicznych, które występują przed lub w trakcie operacji, mogą drastycznie zmienić wyniki, a zapisy mogą być analizowane w celu zapewnienia spójności proceduralnej między osobami i grupami. Spójność parametrów fizjologicznych zwierzęcia można poprawić, poszcząc zwierzęta przed operacją. Eksperymentatorzy są zachęcani do określenia metody, która skutkuje najbardziej spójną wstępnie operowaną hemodynamiką i stężeniem glukozy w surowicy dla ich badań.

  1. Wywołaj znieczulenie, umieszczając szczura w komorze indukcyjnej i napełnij mieszaniną 30% tlenu i 70% podtlenku azotu o stężeniu 5% izofluranu. Zaintubować cewnikiem o rozmiarze 12 G za pomocą laryngoskopu dla gryzoni i przewietrzyć mieszaniną 30% tlenu/70% podtlenku azotu z 2,5% izofluranem. Szybkość wentylacji powinna wynosić 80 oddechów na minutę przy 2,5 ml na oddech.
  2. Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (20 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej i zmniejszyć stężenie izofluranu do 1,5%. ważny: Konieczne jest monitorowanie poziomu znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu, aby zapewnić odpowiednią płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego. Aby sprawdzić głębokość znieczulenia, ściśnij między palcami kończyn tylnych, monitorując odruch pedałowania. Jeśli odruch jest nieobecny, znieczulenie jest odpowiednie. Po kaniulacji tętnicy udowej ciśnienie krwi można wykorzystać jako wskaźnik poziomu znieczulenia. Utrzymuj dawkę izofluranu na jak najniższym poziomie, zachowując chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia napadów poniedokrwiennych.
  3. Nacięcia zostaną wykonane na szyi i w okolicy miednicy. Ogol szyję i prawą miednicę, gdzie udo styka się z brzuchem. Ustaw szczura w pozycji leżącej na homeostatycznym kocu termicznym i włóż termometr doodbytniczy za pomocą lubrykantu chirurgicznego. Zastosuj ochronny lubrykant do oczu. Żarówka o mocy 60 W może pomóc w regulacji temperatury. Żarówka nigdy nie powinna znajdować się bliżej niż 8 cali od zwierzęcia. ważny: Temperatury powyżej lub poniżej normalnej temperatury fizjologicznej (37 °C) mogą mieć duży wpływ na końcowe uszkodzenia neurologiczne. Utrzymuj temperaturę rdzenia na poziomie 37 °C ± 0,5 °C.
  4. Wyszoruj miejsca nacięć betadyną i spłucz 70% etanolem. Powtórz to jeszcze dwa razy. Umieść pole operacyjne nad szczurem i wytnij otwory, aby odsłonić obszary nacięcia. ważny: Tętnice szyjne i udowe można izolować bez powodowania urazów otaczających mięśni, co poprawi regenerację i zminimalizuje późniejszą potrzebę znieczulenia pooperacyjnego.
  5. W oczekiwaniu na odpowiednie znieczulenie, użyj skalpela nr 10, aby wykonać nacięcie w linii środkowej wzdłuż szyi, a następnie, używając hemostatów, tępo rozetnij między gruczołami ślinowymi, aż dotrzesz do mięśnia mostkowo-gnykowego, wydatnej grupy mięśni linii środkowej pokrywającej tchawicę. Ponownie, stosując ostrożną technikę sekcji, oddziel główne grupy mięśni mostka gnykowo-gnykowego od mostkowo-sutkowego, obustronnie. Te dwie grupy mięśni tworzą trójkątne wgłębienie, które może służyć jako punkt orientacyjny do zlokalizowania wiązki nerwowo-naczyniowej zawierającej tętnicę szyjną. Wspólna tętnica szyjna rozgałęzia się na tętnice szyjne wewnętrzne i zewnętrzne. Wyizoluj wspólną tętnicę szyjną proksymalnie do rozwidlenia.
  6. Delikatnie oddziel te dwa mięśnie i zlokalizuj tętnicę szyjną. Aby pomóc zidentyfikować to naczynie, poszukaj pulsu. Odizoluj tętnice szyjne po obu stronach, przepuszczając pod naczyniem jedwabny szew 3-0 o długości ~5 cali. Usuń powięź z naczyń. ostrożność: Nerw błędny i łańcuchy współczulne są zawarte w pęczku nerwowo-naczyniowym szyjki macicy i należy zachować ostrożność, aby nie spowodować jego uszkodzenia podczas izolowania tętnicy szyjnej.
  7. Użyj nożyczek, aby wykonać drugie nacięcie w pachwinie, wzdłuż wgłębienia, w którym mięśnie ud kończyn tylnych stykają się z brzuchem. Wypreparuj pod mięśniem brzucha, wzdłuż mięśni ud, aż dotrzesz do więzadła pachwinowego. Spowoduje to odsłonięcie pęczka nerwowo-naczyniowego kości udowej. Ostrożnie odizoluj tętnicę udową, wprowadzając pod naczynie jedwabny szew 3-0 o długości ~ 5 cali. Oczyść powięź, pozostawiając 5-7 mm odsłoniętego naczynia.
  8. Zawiąż stały węzeł na dystalnym końcu odsłoniętej tętnicy. nuta: Węzły stałe powinny zaczynać się węzłem ciernym, po którym następuje węzeł kwadratowy (w sumie dwa węzły). Ta zasada obejmuje węzły szwów. Umieść kolejny jedwabny szew 3-0 wokół bliższego końca tętnicy i zawiąż luźny węzeł.
  9. Zastosuj trakcję na szew na bliższym końcu tętnicy, aby zablokować przepływ krwi, pociągając za nauczone szwy. Wykonaj małe nacięcie w poprzek górnej części naczynia za pomocą nożyczek okulistycznych. Niewystarczająca przyczepność na naczyniu spowoduje krwawienie, które można zatamować, stosując większą przyczepność. Zamknąć cewnik na zaworze odcinającym.
  10. Za pomocą wprowadzacza naczyniowego wprowadź rurkę cewnika do naczynia, 7-9 mm za nacięciem naczynia i w kierunku linii środkowej. Po umieszczeniu cewnika w żądanej odległości zawiąż luźny węzeł wokół naczynia i cewnika, aby zabezpieczyć go na miejscu. Usuń trakcję z naczynia i pozwól mu leżeć naturalnie.
  11. Podawać dożylnie 0,3 ml heparyny (100 j./ml w soli fizjologicznej). Wypłucz krew z cewnika niewielką ilością soli fizjologicznej, aby zapobiec zakrzepom. Włącz monitor ciśnienia i skalibruj sprzęt. Otwórz zawory odcinające, aby umożliwić przetwornikowi wykrycie ciśnienia krwi. Aby uzyskać precyzyjne pomiary ciśnienia krwi, nie należy zmieniać położenia systemu po kalibracji.
  12. Dawkę izofluranu należy dostosować tak, aby średnie ciśnienie tętnicze krwi (MAP) wynosiło od 110 mmHg do 130 mmHg. Ten MAP powinien wskazywać na odpowiednią płaszczyznę znieczulenia operacyjnego.

3. Protokół niedokrwienia

Jak wspomniano wcześniej, cztery naczynia dostarczają perfuzję do mózgu. Bliższe zamknięcie dwóch tętnic szyjnych nie spowoduje niedokrwienia mózgu, ponieważ tętnice kręgowe skompensują to przez koło Willisa. Wykazano, że niedrożność tętnicy szyjnej, w połączeniu z indukowanym niedociśnieniem ogólnoustrojowym, ograniczy perfuzję przez tętnice kręgowe, powodując niedokrwienie mózgu. Tutaj opisujemy protokół pobierania krwi w celu wytworzenia niedociśnienia i zaciskania tętnic szyjnych w celu wytworzenia kontrolowanego, odwracalnego niedokrwienia. Zobacz rysunek 1.

Tlen we krwi i dwutlenek węgla, stężenie glukozy i pH mogą różnić się między osobami w grupie próbki i powodować różnice w urazie. Monitorowanie tych zmiennych fizjologicznych może zmniejszyć zmienność zawału. Jak wspomniano, temperatura jest kolejnym parametrem, który należy regulować, jednak temperatura mózgu może nie odpowiadać temperaturze rdzenia, ponieważ perfuzja jest znacznie ograniczona podczas eksperymentalnego niedokrwienia28. Nasza specyficzna konfiguracja chirurgiczna powoduje zmiany temperatury w mózgu, które odzwierciedlają zmiany temperatury rdzenia podczas niedokrwienia. Jednak ważne jest, aby eksperymentator określił to empirycznie, monitorując temperaturę mózgu za pomocą termopar lub w inny sposób standaryzując procedurę. Jeśli temperatura ciała nie odzwierciedla temperatury mózgu, ważne jest, aby podczas całego zabiegu utrzymać temperaturę mózgu na poziomie normotermicznym, niezależnie od temperatury głębokiej.

Randomizacja nakazuje, aby chirurg losowo przydzielił zwierzę do grupy kontrolnej z niedokrwieniem lub pozorowaną operacją w tym momencie. Operacja pozorowana przebiega zgodnie ze wszystkimi procedurami dokładnie tak samo, jak u zwierząt niedokrwiennych, z wyłączeniem obniżenia ciśnienia krwi i niedrożności tętnicy szyjnej. Ważne jest, aby kontrole operowane pozorami były poddawane tej samej dawce znieczulenia przez czas odpowiadający okresowi zwierząt niedokrwiennych. Jeśli uwzględniona jest grupa leczona, która wymaga znieczulenia przed lub po niedokrwieniu, grupy pozorowane i nieleczone niedokrwienie powinny być zgodne z dawką znieczulenia i czasem trwania grupy leczonej.

  1. Gotowe klipsy hemostatyczne i aplikator do klipsów. Klipsy powinny całkowicie zasłaniać naczynie, nie powodując żadnego urazu. Niedokrwienie można wywołać, gdy hemodynamika stała się spójna. Podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml z heparyną do kranu prostopadle i proksymalnie do cewnika. Wewnątrz strzykawki powinno znajdować się 0,3 ml (30 jednostek) heparynizowanej soli fizjologicznej, aby zapobiec krzepnięciu pobranej krwi.
  2. Ustaw minutnik na 1 minutę i otwórz kran do strzykawki z heparyną, aby można było pobrać krew.
  3. Pobrać krew, pociągając za tłok strzykawki. Jeśli zostanie zastosowane zbyt duże ssanie, naczynie zapadnie się lub uszczelni przy otworze cewnika i krew nie zostanie pobrana. Powinno być możliwe usunięcie 7-9 ml krwi w ciągu 1 minuty. Jeśli tak nie jest, wsuń cewnik głębiej w tętnicę i spróbuj ponownie. Okazuje się, że należy usunąć 7-9 ml krwi, aby obniżyć MAP w pobliżu 30 mmHg, docelowego ciśnienia krwi do osiągnięcia niedokrwienia. ważny: Upewnij się, że pobrana krew jest przechowywana w temperaturze 37 °C, aby uniknąć wychłodzenia podczas reinfuzji krwi.
  4. Po jednominutowym pobraniu krwi (należy pobrać 7-9 ml krwi) przyłóż klipsy hemostatyczne do tętnic szyjnych i rozpocznij odliczanie na 8 minut. Natychmiast sprawdź ciśnienie krwi. Jeśli MAP nie wynosi 30 mmHg, powoli wlewaj lub pobieraj krew, aby osiągnąć 30 mmHg ± 1 mmHg. Kontynuuj tę praktykę przez cały czas niedokrwienia, aby utrzymać MAP na poziomie 30 mmHg. ważny: Rejestruj ciśnienie krwi przez cały protokół niedokrwienia. Brak obniżenia ciśnienia krwi do 30 mmHg może ograniczyć niedokrwienie. Podczas reinfuzji należy uważnie monitorować temperaturę rdzenia i/lub mózgu, ponieważ wzrost lub spadek temperatury może wpływać na uszkodzenie mózgu.
  5. Po upływie 8 minut rozpocznij reperfuzję, usuwając klipsy hemostatyczne i powoli wlewając krew, 2 ml na minutę.
  6. Po ponownym wlaniu krwi kaniulę można usunąć z tętnicy udowej. Aby uniknąć krwawienia po operacji, przymocuj dwa oddzielne węzły proksymalnie do nacięcia na tętnicy.
  7. Zszyć nacięcia nieciągłym wzorem za pomocą odwróconej igły tnącej, szwem 5-0 VICRYL. Ten szew się rozpuści, więc nie będzie wymagał usunięcia. nuta: W trakcie zabiegu, jeśli nie można osiągnąć wystarczającego znieczulenia przy niższym poziomie izofluranu, należy podać dodatkową dawkę ketaminy.

4. Analgezja i rekonwalescencja

Dobrostan zwierząt jest priorytetem zarówno podczas rekonwalescencji, jak i zabiegu chirurgicznego. Opieka pooperacyjna powinna być zgodna ze szczegółowymi wytycznymi instytucji. Zwierzęta, które przechodzą globalne niedokrwienie mózgu, są podatne na napady padaczkowe. Aby zminimalizować występowanie napadów, ważne jest, aby sala pooperacyjna miała minimalną stymulację, tj. hałasy i zaburzenia widzenia. Zgodnie z naszym protokołem wykorzystania zwierząt trzymamy zwierzęta pooperacyjne przez 72 godziny w zacisznym pomieszczeniu w tym celu.

  1. Po zszyciu nacięć szczur może zostać odłączony od respiratora. Wyłącz izofluran i kontynuuj wentylację przy 30% tlenu/70% podtlenku azotu, aż szczur zacznie oddychać wbrew respiratorowi.
  2. Podawać 0,5 mg/kg butorfanolu w 5 ml soli fizjologicznej, podskórnie między łopatki.
  3. Szybkie ponowne wlewanie krwi może zwiększyć obciążenie wstępne prawej komory. Zwiększa to ciśnienie w krążeniu płucnym i może powodować obrzęk płuc. Oznaki tego to ciężkie oddychanie i trzaski podczas oddychania. Zastosowanie dodatniego końcowego ciśnienia wydechowego pomoże poprawić obrzęk płuc.
    4. Po odzyskaniu
  4. dobrowolnej kontroli nad oddychaniem należy dokonać ekstubacji, wyjąć termometr i wyłączyć koc grzewczy. W tym momencie zwierzę można umieścić w klatce ratunkowej. Klatka reperfuzji powinna być umieszczona w taki sposób, aby połowa klatki znajdowała się na kocu cyrkulacyjnym wody (34 °C) przez pierwsze 24 godziny reperfuzji. Umieść zwierzę na części podłogi klatki nad kocem grzewczym, aby pomóc w utrzymaniu temperatury. Gdy zwierzę zacznie dochodzić do siebie po znieczuleniu i znieczuleniu, będzie poruszać się po klatce, aby się termoregulować. Zwierzęta będą trzymane oddzielnie w okresie pooperacyjnym.
  5. Zwierzę powinno mieć nieograniczony dostęp do wody. Przez dwa dni po operacji woda ta powinna zawierać 4 mg/kg płynnego roztworu Tylenolu. Oprócz karmy dla gryzoni, w klatce znajdują się słodzone płatki śniadaniowe, które stymulują jedzenie i zapobiegają utracie wagi.
  6. Przykryj połowę klatki serwetą i uważnie monitoruj rekonwalescencję pooperacyjną.
  7. Gdy zwierzę wraca do zdrowia po znieczuleniu, ważne jest, aby monitorować oznaki niepokoju. Utrudniony lub niespójny oddech może być oznaką niepokoju, prawdopodobnie spowodowanego obrzękiem płuc lub podrażnieniem dróg oddechowych podczas intubacji. Butorfenol uspokaja zwierzę, zmniejszając aktywność, jednak łagodna aktywność powinna zostać przywrócona w ciągu 1 godziny. Okazuje się, że zwierzęta zaczną jeść smakołyki i pić w ciągu 4 godzin od ekstubacji. Do 12 godzin należy wznowić normalne zachowanie i aktywność karmienia. Inną oznaką niepokoju jest utrata wagi; Zwierzę nie powinno stracić więcej niż 20% pierwotnej masy ciała w ciągu 48 godzin, jeśli zaobserwuje się nadmierną utratę wagi, zwierzę powinno zostać poddane eutanazji.
  8. W przypadku wystąpienia napadów konieczna jest humanitarna interwencja. Ten rodzaj aktywności napadowej jest zwykle obserwowany od 24 do 48 godzin po reperfuzji. Napady mogą powodować zwiększone uszkodzenie mózgu, które jest niezależne od urazu niedokrwiennego jako takiego, dlatego aktywność napadowa powinna być traktowana jako kryterium wyłączenia ustalone przed rozpoczęciem badania 29. Napady mogą wystąpić, gdy nikogo nie ma, dlatego ważne jest, aby rozpoznać objawy. Ściółka zostanie naruszona i ewentualnie wydalona z klatki. Szczur postictal będzie miał ospałe usposobienie z szybkim, ciężkim oddechem i/lub będzie miał posiniaczony lub krwawiący nos.

Uwaga: Wszelkie oznaki bólu lub niepokoju są natychmiast łagodzone za pomocą leków przeciwbólowych. Jeśli sympotomy nie zostaną złagodzone jedną dawką leków przeciwbólowych lub utrzymają się po czwartej kolejnej dawce analgezji, zwierzę zostanie poddane eutanazji i wykluczone z badania. Rany chirurgiczne należy sprawdzać pod kątem prawidłowego gojenia przez osiem dni po operacji.

5. Pobieranie i przetwarzanie tkanek

Mózg jest unieruchamiany przez przezsercową infuzję paraformaldehydu. Po grubym podziale i krioprotekcji zatrzaskujemy mózg i kroimy na kriostacie. Te sekcje mózgu są barwione fioletem krezylowym i obrazowane pod mikroskopem świetlnym.

  1. Wywołaj znieczulenie, umieszczając zwierzę w komorze indukcyjnej i wypełniając 30% tlenu / 70% podtlenku azotu 5% izofluranem. Zaintubuj zwierzę i przewietrz je przy 30% tlenu / 70% podtlenku azotu z 5% izofluranem.
  2. Przygotuj materiał do zabiegu perfuzji. Napełnić jedną zlewkę 100 ml 1 soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C, a jedną zlewkę 100 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C. Mózg jest przepłukiwany PBS, a następnie PFA, przez pompę perfuzyjną. Rurki zostaną umieszczone w każdej zlewce i połączone trójdrożnym kurkiem, aby umożliwić płynne przejście z PBS do perfuzji PFA. Umieść igłę o rozmiarze 18 na rurce i napełnij linię PBS. Upewnij się, że w igle i rurkach nie ma pęcherzyków, ponieważ powietrze może tworzyć zator powodujący perfuzję. Przygotuj również mały pojemnik z PFA do zanurzenia mózgu.
  3. Użyj tacki na płyny o pojemności wystarczającej do pomieszczenia co najmniej 200 ml płynu. W tym momencie zwierzę powinno być wentylowane izofluranem przez wystarczająco długo (co najmniej 3 minuty), aby osiągnąć głębokie znieczulenie.
  4. Ważne: Upewnij się, że osiągnięta została chirurgiczna płaszczyzna znieczulenia.
  5. Kontynuuj, wykonując nacięcie, aby uzyskać dostęp do jamy piersiowej przez brzuch. Zacisnąć aortę zstępującą. Kiedy serce jest odsłonięte, włóż igłę o rozmiarze 18 przez wierzchołek serca do aorty. Wykonaj małe nacięcie w prawej małżowinie usznej, aby umożliwić perfuzatowi opuszczenie zwierzęcia.
  6. Włączyć pompę z prędkością 50 ml/min, zaczynając od PBS. Po przepompowaniu 100 ml PBS przełączyć kran na perfuzję 100 ml PFA.
  7. Usuń mózg, uważając, aby nie uszkodzić tkanki.
  8. Umieść mózg w macierzy tkankowej i przetnij między móżdżkiem a mózgiem. Przekrój przodomózgowia; ~ 3 milimetry od przodu i tyłu kory mózgowej. W ten sposób powstaną trzy sekcje, środkowa część będzie zawierać hipokamp.
  9. Umieść skrawki mózgu w słoiku z wystarczającą ilością PFA, aby całkowicie zanurzyć. Zanurzenie utrwala mózg dokładnie na 2 godziny.
  10. Aby chronić tkankę przed uszkodzeniami spowodowanymi zamarzaniem, mózg jest krioprotekcjonowany poprzez zastąpienie PFA 30% sacharozą w PBS. Krioprotekcja jest kompletna z zatopieniem próbek tkanek w roztworze sacharozy (~24-48 godzin).
  11. Aby zatrzasnąć sekcje mózgu, umieść zlewkę w suchym lodzie i napełnij 2-metylobutanolem na dziesięć minut. Umieścić plastry mózgu w metylobutanolu na 5 minut, a następnie przenieść do zamykanego pojemnika i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu podziału na sekcje.
  12. Kriostat przeciął mózg na 20 μm, zbierając co najmniej 3 sekcje na 3 współrzędnych atlasu mózgu (The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Paxinos i Watson, przekroje płyt 29, 31, 33 lub Bregma -2,8 mm, -3,3 mm i -3,8 mm). Skrawki umieszcza się na naładowanych szkiełkach mikroskopowych i pozostawia do wyschnięcia przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.
  13. Fiolet krezylowy (0,1% przy pH 3,5) barwi 9 sekcji mózgu, po 3 na każdej współrzędnej atlasu mózgu.
  14. Zobrazuj obszar CA1 hipokampa pod kątem 40x za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie i wstaw pasek skali 300 μm równolegle do płaszczyzny neuronalnej CA1. Zapisywanie obrazów jako plików TIFF.

6. Kwantyfikacja uszkodzeń mózgu

ImageJ, darmowy program oferowany przez National Institute of Health, może być używany do liczenia i ilościowego określania żywotnych neuronów, które będą reprezentować zakres uszkodzenia mózgu.

  1. Otwórz obrazy TIFF mikroskopu za pomocą wtyczki "licznik komórek" programu ImageJ. Wybierz kolor oznaczenia i policz neurony w granicach podziałki skali. Neurony są liczone na podstawie prostych kryteriów włączenia opartych na morfologii neuronów (duży, piramidalny kształt) lub kryteriach wykluczenia dla morfologii mikrogleju/astrocytów (mały okrągły lub długi kształt rurkowy).
    ważny: Bądź konsekwentny z kryteriami włączania/wykluczania między slajdami i osobami podczas liczenia neuronów.
  2. Rejestruj liczbę neuronów i zapisz okno licznika komórek.
  3. Zliczanie neuronów powinno być wykonywane przez dwie oddzielne osoby, aby uzyskać spójne, dokładne zliczanie neuronów.
  4. Średnia ze wszystkich 9 obrazów z każdego zwierzęcia zapewni pojedynczą średnią "liczbę neuronów", która jest ilościową miarą uszkodzenia hipokampa CA1, która ma być wykorzystana w analizie statystycznej. Grupy mogą być porównywane statycznie za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, po której następuje test HSD Tukeya do analizy post hoc lub, jeśli test normalności nie powiedzie się, jednoczynnikowa ANOVA Kruskala-Wallisa na rangach, a następnie analiza post hoc Dunna w celu statystycznej oceny różnic między grupami. Szczegółowa analiza statystyczna powinna być podyktowana indywidualnym projektem badania, ten przedstawiony tutaj może nie być odpowiedni dla konkretnych testowanych hipotez.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Model 2VOH globalnego niedokrwienia i reperfuzji mózgu powoduje śmierć neuronów w obszarze CA1 hipokampa. Rysunek 2 przedstawia uszkodzenie wywołane 8 min globalnego niedokrwienia mózgu, analizowane 14 dni po reperfuzji. Rysunki 2A i 2B porównują hipokampy z mózgów grupy pozorowanej oraz grupy po niedokrwieniu, barwione fioletem krezylowym. Rysunek 2A pokazuje hipokamp szczura z grupy pozorowanej, który wykazuje prawidłową morfologię, w tym nienaruszony ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj model powoduje niedokrwienne uszkodzenie mózgu, które może wystąpić w wyniku zatrzymania akcji serca i resuscytacji, powodując uraz podobny do tego, który występuje u ludzi. Ta metoda wytwarzania globalnego niedokrwienia mózgu jest jednym z wielu protokołów. Korzystamy z tego protokołu przede wszystkim ze względu na jego porównywalnie niską śmiertelność, szybki powrót do zdrowia i powtarzalne wyniki. Model zatrzymania krążenia/resuscytacji jest prawdopodobnie najbardziej istotny klinicznie, jednak techniczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa materiału
5-0 Szew VICRYL, odwrotne cięcie EthiconJ391H
Skalpel, nr 10Swann-Morton6601
Gąbki z gazyFisher22-362-178
18G x 1 ½ w igleBD305201
23G x 1 w igleBD305145
Igła 26 G x 3/8 calaBD305110
18 G x 1 ¼ cewnikEXEL26735
Strzykawka 1 mlBD309659
Strzykawka 10 mlBD309604
Strzykawka 60 mlBD309653
SurgilubeHenry Schein1152666,9
% sól fizjologiczna, tworzywo sztuczne IV torbaHenry Schein1537468
Szew 3-0 JedwabHenry Schein1007842
Puralube Maść okulistycznaHenry Schein3390017
BetadineHenry Schein6903564
sterylna serweta na ręcznikMoore Medical14170
Rurka polietylenowa, 50Intramedic427411
Zawór odcinający, 3-drożnySmithsMedical MX9311L
Nazwa leku
AERRANE (izofluran)Henry Schein2091966
Mapap Liquid (Tylenol)Major Pharmaceuticals1556
Kedavet (ketamina)Ketathesia ButneyNDC 50989-996-06
Butorphic (butorfanol)Lloyd Labs4881
HeparynaAPP Pharmaceuticals504011
Nazwa chemiczna
Paraformaldehyde prillsMikroskopia Elecron Sci.19202
2-metylobutanSigma270342
octan fioletu krezylowegoSigmaC5042
SacharozaSigmaS9378
Software
ImageJNIH

Bibliografia

  1. Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
  2. Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
  3. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
  4. Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
  5. Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
  6. Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
  7. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
  8. Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
  9. Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
  10. Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
  12. Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978(2011).
  13. Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
  14. Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. , (2012).
  15. Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
  16. Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
  17. Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
  18. Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
  19. Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39(1999).
  20. Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
  21. Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
  22. Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
  23. Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
  24. Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
  25. Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
  26. Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
  27. Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
  28. Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
  29. Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
  30. Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
  31. Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
  32. Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zaciemnienie tętnicy szyjnejkaniulacja tętnicy udowejhipotensja systemicznaneurony obszaru CA1 hipokampakwantyfikacja uszkodzeń neuronalnychImageJ Cell Countermonitorowanie hemodynamicznereperfuzja po niedokrwieniu
Okluzja / niedociśnienie 2-naczyniowe: szczurzy model globalnego niedokrwienia mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.