Pokazujemy nowy model podwiązania tętniczego w mięśniu rdzeniowo-trapezowym myszy, w tym procedurę krok po kroku i opis wymaganego oprzyrządowania. Opisujemy operację i istotne pomiary wyników związane z przebudową sieci naczyniowej i funkcjonalnym rozszerzeniem naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii przyżyciowej i konfokalnej.
Artykuł metodologiczny
Mysi model rdzeniowo-trapezowy do oceny wpływu podwiązania tętniczek na funkcję i przebudowę mikrokrążenia
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysi spinotrapezius to cienki, powierzchowny mięsień podporowy szkieletu, który rozciąga się od T3 do L4 i jest łatwo dostępny przez grzbietowe nacięcie skóry. Jego unikalna anatomia sprawia, że spinotrapezius jest przydatny do badania uszkodzeń niedokrwiennych i późniejszej przebudowy mikrokrążenia. Tutaj pokazujemy model podwiązania tętniczek w mysim mięśniu rdzeniowo-trapezowym, który został opracowany przez nasz zespół badawczy i wcześniej opublikowany1-3. W przypadku niektórych wrażliwych szczepów myszy, takich jak mysz Balb/c, ta operacja podwiązania niezawodnie powoduje niedokrwienie mięśni szkieletowych i służy jako platforma do badania terapii stymulujących rewaskularyzację. Zademonstrowano również metody oceny, w tym zastosowanie mikroskopii przyżyciowej i konfokalnej. Spinotrapezius dobrze nadaje się do takich badań obrazowych ze względu na swoją dostępność (powierzchowna anatomia grzbietowa) i względną cienkość (60-200 μm). Mięsień rdzeniowo-trapezowy może być montowany en face, co ułatwia obrazowanie sieci mikronaczyniowych całych mięśni bez sekcji histologicznej. Opisujemy zastosowanie mikroskopii przyżyciowej do pozyskiwania metryk po procedurze funkcjonalnego rozszerzenia naczyń krwionośnych; W szczególności wzrost średnicy tętniczki w wyniku skurczu mięśni. Pokazujemy również procedury pobierania i utrwalania tkanek, które są niezbędnym wstępem do badań barwienia immunologicznego i zastosowania mikroskopii konfokalnej.
Wprowadzenie
Modele zwierzęce przewlekłego niedokrwienia są cennymi narzędziami do badania patofizjologii chorób niedokrwiennych, takich jak choroba tętnic obwodowych, choroba wieńcowa i choroba naczyń mózgowych. U gryzoni, podobnie jak u ludzi, niedrożność tętnic prowadzi do strukturalnej przebudowy sieci naczyniowej, w tym arteriogenezy i angiogenezy. U zdrowych i młodszych pacjentów ta przebudowa może być wystarczająca, aby uratować tkankę przed uszkodzeniem spowodowanym niedokrwieniem, ale choroby współistniejące, takie jak cukrzyca, mogą poważnie zagrozić przebudowie i rekonwalescencji. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń przebudowy naczyń krwionośnych jest niezbędne do opracowania terapii, które stymulują te endogenne procesy rewaskularyzacji.
Obecnie, podwiązanie lub resekcja tętnicy udowej w kończynie tylnej jest standardową techniką badania przewlekłej przebudowy naczyń krwionośnych wywołanej niedokrwieniem u małych zwierząt4,5. Analiza średnicy, połączenia i reaktywności mikronaczyń tworzących sieć naczyniową poniżej podwiązanej tętnicy udowej jest jednak trudna ze względu na grubość mięśni. Opracowaliśmy model podwiązania tętniczek w mięśniu rdzeniowo-trapezowym myszy: jednostronne podwiązanie bocznej tętnicy zasilającej w tym stabilizującym mięśniu grzbietowym1. Stosunkowo cienki spinotrapezius (60-200 μm) jest podatny na barwienie immunologiczne en face w celu oceny całej topologii sieci z rozdzielczością pojedynczej komórki, co pozwala na szczegółowe badanie zdarzeń przebudowy naczyń w całej tkance. Rdzeń rdzeniowo-rdzeniowy jest również powierzchowny i dostępny, a zatem jego naczynia są łatwo obserwowalne za pomocą mikroskopii przyżyciowej, w celu skutecznego scharakteryzowania wpływu przebudowy i podwiązania tętniczek na reaktywność naczyniową.
W tym raporcie szczegółowo opisujemy i demonstrujemy model podwiązania tętniczek rdzeniowo-trapezowych myszy. Opisano zarówno metody oceny in vivo, jak i ex vivo po operacji, w tym pomiar funkcjonalnego rozszerzenia naczyń krwionośnych, które, jak wykazano, jest upośledzone w warunkach niedokrwiennych6 oraz obrazowanie immunofluorescencyjne sieci mikronaczyniowych całych mięśni. Dołączamy również wyniki dwóch oddzielnych badań pilotażowych, aby zademonstrować użyteczność modelu. Po pierwsze, wykorzystaliśmy model podwiązania tętnic, aby wywołać statystycznie istotny wzrost krętości naczyń u myszy C57BL / 6 (Figura 2B). Skrętność wzrasta podczas arteriogenezy w tętniczkach pobocznych. W innych szczepach myszy, które są bardziej podatne na niedokrwienie ze względu na brak tętniczek pobocznych (np. Balb/c), obserwuje się tętnicę kapilarową10. Tętnica włośniczkowa jest wykrywana przez zwiększenie średnic i rozwój reaktywności aktyny α mięśni gładkich. Po drugie, funkcjonalna stymulacja elektryczna mięśnia prowadzi do rozszerzenia naczyń krwionośnych w końcowych tętniczkach rdzenia trójbocznego (ryc. 3B).
Protokół
1. Operacja podwiązania tętnicy krwionośnej
- Znieczulić mysz przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. W strzykawce o pojemności 0,5 ml sformułować:
0,06 ml 100 mg/ml ketaminy
0,03 ml 20,0 mg/ml Ksylazyna
0,01 ml 0,4 mg/ml atropiny
0,30 ml 0,9% soli fizjologicznej.
Dawka: 0,01 ml* na gram masy ciała, i.p.
*Dawka zmienna w zależności od szczepu myszy i zapasu, dostosuj odpowiednio, aby powrót myszy do zdrowia nastąpił w ciągu godziny od indukcji.
- Zastosuj standardową maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Usuń włosy z tyłu za pomocą maszynki do przycinania, a następnie nałóż krótki krem do depilacji.
- Zdezynfekuj pole operacyjne chlorheksydyną lub jodowidonem. Trzykrotnie naprzemiennie jodon z etanolem, kończąc na jodowidonie.
- Przenieś mysz na wcześniej przygotowaną powierzchnię roboczą chirurgiczną, z założoną poduszką grzewczą i sterylną serwetą.
- Wykonać liniowe nacięcie (3-5 mm) przez skórę grzbietową około 5 mm ogonowo do kostnego wypukłości łopatki za pomocą nożyczek tęczówki i kleszczyków o standardowym wzorze (np. FST, 11271-30), napinając tkankę i przecinając równolegle do kręgosłupa. Docelowe miejsce nacięcia można zidentyfikować poprzez przezskórną wizualizację grzbietowej poduszeczki tłuszczowej, jeśli pozwala na to pigmentacja skóry; Przeciąć na ogonowej granicy poduszeczki tłuszczowej. W razie potrzeby rozszerz nacięcie i przeciągnij przez wtórne warstwy skóry za pomocą nożyczek sprężynowych.
- Uwaga anatomiczna - Mięsień rdzeniowo-trapezowy leży grzbietowo i rozciąga się od T4 do L3 po obu stronach kręgosłupa. Przednia granica rozciąga się bocznie do mniej więcej łopatki. Mięsień zwęża się w kierunku ogonowym, tak że najbardziej tylna granica leży przyśrodkowo do granicy przedniej i może leżeć równo z kręgosłupem. Należy również zwrócić uwagę na dwie poduszeczki tłuszczowe, leżące bezpośrednio grzbietowo i brzusznie do mięśnia rdzeniowo-trapezowego w kierunku połowy czaszki.
- Wykazano, że stan zapalny spowodowany nacięciem nie ma wpływu na odpowiedź na przebudowę naczyń krwionośnych, ponieważ operacja pozorowanego podwiązania nie wykazała zmian w przebudowie naczyń krwionośno-trapezowych. Na ten wynik składają się dwa czynniki przestrzenne. Najpierw nacięcie jest usuwane o 5 mm w kierunku czaszkowym z obszaru zainteresowania, w którym zwykle badana jest odpowiedź naczyniowa w mięśniu. Dodatkowo miejsce nacięcia na skórze grzbietowej jest oddzielone od miejsca podwiązania naczynia brzuszną poduszką tłuszczową, która leży na szczycie czaszkowej jednej trzeciej mięśnia rdzeniowo-rdzeniowego.
- Przepłukać nacięcie podgrzanym roztworem Ringera, aby zapobiec wysuszeniu mięśni. Stosowanie leków rozszerzających naczynia krwionośne, takich jak papaweryna, pomoże w wizualizacji tętnicy docelowej do podwiązania.
- Pod mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby stępić, rozciąć i oddzielić (ale nie usunąć) grzbietową białą poduszeczkę tłuszczową od leżącej poniżej tkanki mięśniowej, aby uwidocznić unaczynienie, gdy wchodzi i opuszcza spinotrapezius na jego bocznej krawędzi.
- Zlokalizuj tętnicę docelową, która wraz z jedną lub dwiema sparowanymi żyłami przechodzi przez poduszeczkę tłuszczową, która jest brzuszna do rdzenia trójbocznego w drodze do bocznej krawędzi mięśnia. Tętnica ta zasila znaczną część ogonowej połowy mięśnia, co można potwierdzić poprzez odbicie i wymianę mięśnia w celu obserwacji ścieżki tętnicy w mięśniu. Docelowym miejscem podwiązania jest odcinek tętnicy wychodzący z brzusznej poduszeczki tłuszczowej i wchodzący do mięśnia i jest dość dostępny w tym obszarze. Para tętnica-żyła może wymagać delikatnego oddzielenia od brzusznej poduszeczki tłuszczowej w tym obszarze. Należy zauważyć, że spinotrapezius jest zasilany przez wiele par tętnica-żyła, w tym naczynia, które przecinają grzbietowe i brzuszne poduszeczki tłuszczowe. Należy uważać, aby nie naruszyć tych naczyń.
- Do odróżnienia tętnicy od żyły można użyć wielu wskaźników. Jedną z najlepszych metod jest delikatne zablokowanie przepływu krwi za pomocą mikrosondy i przesunięcie się w górę od mięśnia; Przepływ w tętnicy nie zostanie wznowiony, dopóki przeszkoda nie zostanie zwolniona. Można również użyć koloru, ponieważ ściany żył zawierają białawą osłonkę tkanki łącznej, której brakuje tętnicom. Ponadto można rozważyć średnicę przed zastosowaniem środka rozszerzającego naczynia krwionośne, ponieważ żyły są zazwyczaj większe.
- Tętnica zazwyczaj znajduje się w bliskiej odległości od sparowanej żyły; użyj rozwarstwienia za pomocą mikrosondy i kleszczyków #5, aby wyizolować segment około 5 mm, przesuwając mikrosondę za tętnicą i używając końcówki, aby zrobić szerszą szczelinę w naturalnej szczelinie między tętnicą a żyłą. Jest to szczelina, przez którą zostanie przewleczony szew.
- Za pomocą szwu jednonitkowego 10-0 i uchwytu igły umieść podwiązanie wokół tętnicy zasilającej (średnica ~70 μm) w kierunku bliższego końca wyciętego segmentu za pomocą węzła chirurgicznego. Umieścić dodatkowe podwiązanie w kierunku dystalnego końca wyciętego odcinka tętnicy, z wystarczającą separacją między ligaturami, aby umożliwić przecięcie tętnicy.
- Mała skala związana z tętnicą zasilającą rdzeniowo-trapezową prowadzi do zwiększonej trudności chirurgicznej w porównaniu z podwiązaniem większego naczynia, takiego jak tętnica udowa. Szczególnie niedoświadczeni chirurdzy będą mieli wysokie wskaźniki zwichnięć, niezamierzonych krwotoków i innych powikłań chirurgicznych. Szczególnie niepokojąca jest trudność w zidentyfikowaniu i przecięciu bezbarwnej tętnicy po tym, jak przepływ został utrudniony tuż przed przecięciem. Z tych powodów założenie 2 ligatur jest zalecane dla osób nieprzyzwyczajonych do zabiegu, ponieważ chirurg ma wizualny przewodnik w zlokalizowaniu miejsca przecięcia tętnicy, a także potwierdzenie przecięcia z łatwo zauważalną separacją 2 ligatur. Jednak bardziej doświadczony chirurg może uznać, że pojedyncza ligatura jest wystarczająca, o ile jest w stanie wyraźnie zidentyfikować i przeciąć tętnicę za ligaturą. Chociaż technika ta zmniejsza ryzyko niezamierzonego nacięcia pobliskiego naczynia ostrym szwem podwiązanym, nie jest pozbawiona wad, w tym zwiększonej trudności w potwierdzeniu, że tętnica została przecięta.
- Sprawdź podwiązanie, obserwując zmniejszenie przepływu krwi (niedrożna kolumna RBC) za miejscem podwiązania (tj. w kierunku mięśnia).
- Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć podwiązaną tętnicę, między dwoma ligaturami. Jeśli umieszczono tylko jedną ligaturę (11a), należy ją ciąć z najwyższą ostrożnością w kierunku następnym.
- Folia zwykła z lekiem (1 mm) może być umieszczona za lekiem (doogonowo) jako część procedury doświadczalnej.
- Przestaw przemieszczoną powięź i tkankę tłuszczową do ich pierwotnej orientacji.
- Zamknij nacięcie skóry za pomocą 8-0 szwy niewchłanialne. Następnie umieść mysz w przygotowanej, podgrzewanej klatce regeneracyjnej pod obserwacją i podaj odpowiedni środek przeciwbólowy, taki jak bupiwakaina, 0,02-0,05 ml 0,25% nacieku miejscowego.
2. Mikroskopia przyżyciowa Spinotrapezius, in situ
- Znieczulij mysz w komorze indukcyjnej z 3-4% izofluranem odparowanym w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 3-4 l·min-1.
- Stosowanie znieczulenia wziewnego jest preferowane w przypadku pomiarów funkcjonalnych, ponieważ depresja sercowo-naczyniowa jest mniejsza niż w przypadku środków znieczulających do wstrzykiwań. Jeśli znieczulenie wziewne nie jest dostępne, preferowane są długo działające środki znieczulające do wstrzykiwań, takie jak pentobarbital sodu, aby uniknąć powtórnych wstrzyknięć po ułożeniu zwierzęcia.
- Po znieczuleniu należy w sposób ciągły dostarczać izofluran przez maskę anestezjologiczną (inaczej stożek nosowy) w stężeniach podtrzymujących (zwykle ~ 2%) i natężeniu przepływu 0,5-1 L·min-1.
- Myszy wentylują głównie przewody nosowe, dlatego konieczne jest jedynie zakrycie nosa membraną maski anestezjologicznej.
- W razie potrzeby usuń włosy z tyłu za pomocą maszynki do strzyżenia i kremu do depilacji.
- Przetransportuj zwierzę na poduszkę grzewczą.
- Ważne jest, aby utrzymywać myszy w stanie eutermicznym, aby zapobiec zwężeniu naczyń krwionośnych wywołanemu zimnem; można to osiągnąć za pomocą lamp, poduszek grzewczych z cyrkulacją wody, podkładek grzewczych do kuchenki mikrofalowej itp.
- Włóż sondę temperatury doodbytnicy i ustaw regulator temperatury na 35 °C.
- Wykonaj nacięcie skóry na ogonowym końcu rdzenia grzbietowego za pomocą nożyczek do tęczówki i kleszczy o standardowym wzorze.
- Przedłuż nacięcie czaszkowo do poduszeczki tłuszczowej, tworząc nacięcie w kształcie rakiety podkowy, i przykryj płat skóry folią, aby zapobiec wysuszeniu.
- Tępo wypreparuj podskórną tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek sprężynowych, aby zmaksymalizować widoczność.
- Umieść elektrody stymulujące jak najbliżej siebie, aby zminimalizować rozmiar pola prądu, i umieść je na ogonowym końcu odsłoniętego mięśnia tuż obok kręgosłupa.
- Wykonaj stymulację testową w celu potwierdzenia umieszczenia elektrody za pomocą systemu akwizycji danych elektrod, izolatora bodźców elektrod i sterownika komputerowego, z falami prostokątnymi o czasie trwania 200 μs, amplitudzie 2 mA, dostarczanymi z częstotliwością 1 Hz.
- Umieść plastikową folię na odsłoniętym mięśniu, aby zapobiec wysuszeniu.
- Rozpocznij odmierzanie czasu przez 30 minut, podczas którego średnice naczyń będą się równoważyć.
- Umieść mikroskop przyżyciowy nad mięśniem rdzeniowo-mięśniowym, aby zobaczyć architekturę naczyniową.
- Jeśli używasz soczewki zanurzeniowej, umieść kroplę PBS między obiektywem a plastikową folią.
- Zaczynając powyżej głównej tętniczki (największego widocznego naczynia), manipuluj stolikiem w płaszczyźnie X-Y, aby zlokalizować interesujące Cię naczynie.
- Wizualizacja małych tętniczek za pomocą mikroskopii w świetle odbitym wymaga większego kontrastu niż zapewniany przez kolumnę krwinek czerwonych. Używamy przede wszystkim mikroskopu do obrazowania ciemnego pola w strumieniu bocznym w celu zwiększenia kontrastu mikronaczyniowego, ale kontrast można również poprawić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w świetle odbitym po dożylnym wstrzyknięciu dekstranu fluorescencyjnego o dużej masie cząsteczkowej.
- Po 30-minutowej równowadze zrób zdjęcie/film interesującego Cię statku.
- Stymuluj mięsień falami prostokątnymi o czasie trwania 200 μs, amplitudzie 2 mA, dostarczanymi z częstotliwością 8 Hz, przez 90 sekund, jak opisano powyżej.
- Uchwyć kolejny obraz/film natychmiast po stymulacji i kontynuuj rejestrowanie co minutę, aż naczynie powróci do spoczynkowej średnicy, ~10 min.
- Powtórz kroki 6-18, używając mięśnia przeciwległego.
- Analiza danych może być wykonywana w czasie rzeczywistym za pomocą suwmiarki wideo lub w trybie off-line za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
- Poddaj mysz eutanazji zgodnie z protokołem IACUC.
3. Pobieranie i utrwalanie tkanek Spinotrapeziusa
- Znieczulić myszy przez wstrzyknięcie dootrzewnowe; preparat jak w Spinotrapezius Feed Artery Ligation krok 1.
- Wykonaj nacięcie kilka milimetrów czaszki do kostnego wypukłości łopatki myszy za pomocą nożyczek do tęczówki i standardowych kleszczy. Rozszerz nacięcie bocznie, a następnie doogonowo po obu stronach.
- Uwolnij skórę od grzbietu tułowia, delikatnie odbijając skórę i przecinając powierzchowną powięź.
- Użyj sekcji, aby usunąć grzbietową tkankę tłuszczową za pomocą standardowych kleszczy, a następnie odbij mięsień i podobnie wypreparuj brzuszną tkankę tłuszczową.
- Usuń powięź pokrywającą mięsień za pomocą kleszczy i nożyczek sprężynowych. Ten krok może być trudny i czasochłonny, ale jest ważny, aby poprawić barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie. Utrzymywanie nawilżenia tkanki może ułatwić usunięcie powięzi.
- Zlokalizuj boczną granicę mięśnia i użyj sekcji, aby oddzielić mięsień rdzeniowo-trapezowy od poduszeczki tłuszczowej, która leży do niego brzusznie.
- Kontynuuj rozwarstwienie w kierunku czaszkowo-ogonowym. Zauważ, że kilka naczyń krwionośnych wchodzi i opuszcza tę brzuszną powierzchnię mięśnia; Jeśli wymagana jest perfuzja, należy ją wykonać przed przecięciem tych naczyń. Zauważ również, że w ogonowej połowie mięśnia jego boczna granica wstawia się w mięsień leżący brzusznie do niego. Wzdłuż tej granicy może być wymagane pewne cięcie, aby całkowicie zdefiniować i uwolnić krawędź.
- Wytnij mięsień rdzeniowo-trapezowy. Aby to zrobić:
- Uwolnij boczną krawędź mięśnia, jak opisano powyżej.
- Przeciąć poprzecznie w poprzek najbardziej czaszkowego rozciągłości mięśnia.
- Wyciąć wzdłuż granicy przyśrodkowej (wzdłuż kręgosłupa), w płaszczyźnie strzałkowej.
- Powtórz kroki procedury 4-9 na mięśniu przeciwległym, a następnie poddaj mysz eutanazji metodą zatwierdzoną przez IACUC.
- Utrwalić chusteczki na szkiełkach pokrytych żelatyną, zanurzając je w schłodzonym metanolu (4 °C) lub w 4% roztworze paraformaldehydu/dejonizowanej wody w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Alternatywnie można zastosować utrwalenie perfuzyjne. Przed etapem 2 wykonaj torakotomię, wykonaj nacięcie w prawym przedsionku i ukrwij naczynia krwionośne 5 ml soli fizjologicznej buforowanej 1×tris z 0,1 mM CaCl2 i 2% heparyną przez lewą komorę, następnie 5 ml 4% paraformaldehydu do utrwalenia naczynia, a na koniec 5 ml soli fizjologicznej buforowanej 1×Tris z 0,1 mM CaCl2 7.
- Natychmiast po utrwaleniu przemyć próbkę cztery razy przez 20 minut przy użyciu 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 0,1% saponiną.
Wyniki
Widok chirurgiczny głównej tętnicy zasilającej mięsień grzbietowo-czworoboczny, która poddawana jest podwiązaniu, przedstawiono na Rysunku 1, wraz z oznaczeniami obszarów zainteresowania. Przykładowy obraz konfokalny pobranego i poddanego immunostainingu obszaru mięśnia znajdującego się bezpośrednio za podwiązaną tętnicą tydzień po zabiegu przedstawiono na Rysunku 2A. Powiększone arteriole kolateralne zawierające komórki mięśni gładkich wykazujące ekspresję alfa-aktyny mięśni gładkich (kolor czerwony) wykazują charakterystyczną krętość po podwiązaniu. Krętość naczyń, raportowana jako stosunek długości drogi naczynia do odległości w linii prostej (tj. linii łączącej punkty końcowe tej samej drogi naczyniowej), w mięśniu podwiązanym (po prawej) jest zwiększona w stosunku do niepodwiązanego mięśnia przeciwległego (Rysunek 2B; n=8). Rysunek 3 przedstawia wyniki badania pilotażowego, w którym mierzono funkcjonalną wazodylatację arteriol terminalnych przy użyciu mikroskopii wewnątrzorganizowej. Zgodnie z oczekiwaniami, średnica arteriol istotnie zwiększa się po skurczu mięśnia wywołanym stymulacją elektryczną.
Rysunek 1. Pole operacyjne odsuniętego mięśnia czworobocznego grzbietowego i tętnicy doprowadzającej. Tętnica doprowadzająca zostaje podwiązana w dwóch miejscach wskazanych przez A0. Pomiędzy tymi podwiązkami, po zablokowaniu przepływu krwi, tętnica zostaje przecięta w miejscu wskazanym przez A. Docelowy odcinek tętnicy przechodzi z brzusznej poduszki tłuszczowej, obramowanej przez C, do mięśnia czworobocznego grzbietowego, obramowanego przez D, w miejscu wskazanym strzałką B. Kierunek przepływu zaznaczono przerywaną strzałką E.
Rysunek 2. Obraz konfokalny sieci mikronaczyniowej mięśnia grzebieniowo-obojczykowego dla badania pilotażowego krętości. (A) Pobrany i zamontowany w całości mięsień poddano immunobarwieniu na alfa-aktynę mięśni gładkich i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pole widzenia obejmuje obszar mięśnia znajdujący się bezpośrednio poniżej podwiązanej tętniczki 1 tydzień po podwiązaniu. W mięśniu widoczne są kręte naczynia będące wynikiem podwiązania. (B) Wyniki badania pilotażowego wykazują znacznie zwiększoną (p=0,035; jednostronny test t Studenta) krętość mikronaczyń w podwiązanym mięśniu, mierzoną jako stosunek długości ścieżki naczynia do odległości w linii prostej, dla grupy myszy C57BL/6 (n=8) w porównaniu do przeciwstawnej kontroli.
Rycina 3. Obrazowanie mikroskopią wewnątrzżyciową funkcjonalnej wazodylatacji w tętniczkach mięśnia czworobocznego grzbietowego, in vivo. (A) Reprezentatywne fotomikrografie końcowych tętniczek mięśnia czworobocznego grzbietowego w spoczynku (lewo) oraz bezpośrednio po zaprzestaniu skurczu mięśnia o częstotliwości 8 Hz (prawo). (B) Średnica końcowych tętniczek w spoczynku (8,5 ± 0,5 μm, lewo) i bezpośrednio po (11 ± 1 μm, środek) 90 s skurczu mięśnia, co spowodowało istotny wzrost średnicy tętniczek (p=0,032; jednostronny test t dla par) u myszy Balb/C (n=6). Wykazano procentową zmianę (prawo).
Dyskusja
Przedstawiony tutaj mysi model podwiązania rdzeniowo-trapezowego jest skutecznym modelem małego zwierzęcia do badania adaptacji funkcjonalnych i strukturalnych, które wynikają z niedrożności tętnicy. Model ten jest komplementarny z szeroko stosowanym modelem niedokrwienia kończyn tylnych4, ponieważ zapewnia widok całych mięśni nienaruszonych sieci mikronaczyniowych z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Co więcej, ponieważ mięsień ten znajduje się tuż pod skórą grzbietową, jest dostępny do seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii przyżyciowej oraz do miejscowego dostarczania leku poprzez superfuzję lub implantację cienkiej warstwy2. Te cechy sprawiają, że jest to atrakcyjny model małego zwierzęcia, w którym można badać wpływ nowych celów terapeutycznych na przebudowę naczyń krwionośnych i funkcjonalne rozszerzenie naczyń krwionośnych po niedrożności tętnic.
Należy pamiętać, że należy zachować ostrożność przy porównywaniu danych uzyskanych w modelu podwiązania rdzeniowo-trapezowego z danymi uzyskanymi w modelu podwiązania kończyn tylnych ze względu na kilka kluczowych różnic. Po pierwsze, mięśnie rdzeniowo-trapezowe są mięśniami stabilizującymi i różnią się od mięśni nóg pod względem funkcji i rozkładu włókien. Nasza grupa wykazała wcześniej, że podwiązanie tętniczek w mięśniu rdzeniowo-trapezowym powoduje mniejsze lub znikome niedotlenienie w szczepach z dobrze rozwiniętymi pobocznymi sieciami tętniczek, w porównaniu z niedotlenieniem obserwowanym w tylnej łapie po podwiązaniu tętnicy udowej w modelukończyny tylnej 1,8-10. Wykazaliśmy również, że model ligacji rdzeniowo-trapezowej wywołuje inną odpowiedź remodelacyjną u myszy Balb / c w porównaniu z myszami C57bl / 6, przy czym sieci myszy Balb / c są przebudowywane przez kolateralizację naczyń włosowatych i przebudowa C57bl / 6 przez powiększenie istniejących połączeń tętniczych3. Istnieje interesująca paralela między tymi obserwacjami a tymi dokonanymi w modelach podwiązania kończyn tylnych, w których myszy Balb / c doświadczają przedłużonej regeneracji perfuzji po podwiązaniu w porównaniu z myszami C57bl / 69,11,12. W innych modelach niedokrwienia tkanek wiekmyszy 13 lat, płeć14 i obecność choroby15 również wpływają na odpowiedzi tkanek na okluzję tętniczek, chociaż nie przetestowaliśmy jeszcze tych predyktorów w modelu podwiązania rdzeniowo-trapezowego.
Po drugie, rozmiar tętnicy, która jest podwiązana w modelu rdzeniowo-trapezowym, jest znacznie mniejszy niż tętnicy udowej, a zatem podwiązanie wpływa na mniejszą objętość tkanki, która znajduje się dalej w dół, tj. na niższym poziomie drzewa krążenia, w rdzeniu trapezowym w porównaniu z kończyną tylną3. W związku z tym anatomiczna różnica w lokalizacji podwiązania w tych dwóch modelach powinna być brana pod uwagę przy porównywaniu odpowiednich reakcji fizjologicznych (np. przebudowy naczyń krwionośnych) na tę interwencję.
Po trzecie, cienkość rdzenia trapezowego może pozwolić tlenowi dotrzeć do nieperfundowanej części tkanki z sąsiedniej tkanki, w porównaniu z połączonym niedokrwieniem i niedotlenieniem w modelu kończyn tylnych, jak wspomniano powyżej3. Po czwarte, przywrócenie przepływu do części rdzenia czworobocznego za podwiązaniem jest szybsze niż w przypadku podwiązania kończyn tylnych. Model podwiązania rdzeniowo-trapezowego jest unikalnym modelem przewlekłym i nie należy go mylić z innymi modelami przejściowej niedrożności tętnic lub modelami uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. Uważamy, że możliwe jest dostosowanie tego modelu do tego typu warunków, ale wykracza to poza zakres prac przedstawionych w niniejszym dokumencie. Na koniec ostrzegamy przed bezpośrednim wiązaniem obserwacji przedklinicznych w tym modelu z klinicznymi objawami choroby niedokrwiennej u ludzi, zwłaszcza w przypadku wykorzystywania młodych i zdrowych myszy oraz ze względu na nieodłączne ograniczenia fizjologiczne, takie jak wyższe tętno5. Niemniej jednak uważamy ten nowy model za cenne narzędzie do odkrywania podstawowych mechanizmów odpowiedzi tkanek na podwiązanie i identyfikowania potencjalnych celów terapeutycznych w warunkach in vivo .
Oprócz uwag chirurgicznych zawartych w procedurze podwiązania tętnicy rdzeniowo-trapezowej (uwaga anatomiczna (6a), odróżnienie tętnicy od żyły (9a) i zastosowanie pojedynczej ligatury (11a)), warto omówić kilka innych aspektów procedury.
Po pierwsze, początkowe nacięcie wykonane nad granicą grzbietowej poduszeczki tłuszczowej (lub kilka mm ogonowo do łopatki, jeśli wizualizacja przezskórna nie jest możliwa) jest idealnie wykonane tak małe, jak chirurg czuje się komfortowo, i rozszerzone podczas zabiegu, jeśli to konieczne. Praktyka ta minimalizuje szycie wymagane do zamknięcia nacięcia, co jest wygodne dla chirurga, skraca czas zabiegu, a także jest mniej drażniące dla zwierzęcia podczas rekonwalescencji. Alternatywnie, większe nacięcie skóry może być odpowiednie zgodnie z preferencjami chirurga, ponieważ mięsień może być łatwiejszy do zlokalizowania przy rozszerzonym polu. W takim przypadku nacięcie może mieć kształt podkowy z otwartą powierzchnią przyśrodkową, aby umożliwić złożenie w kierunku kręgosłupa. Podczas wykonywania nacięcia skóry i rozciągania przez wtórne warstwy skóry, jeśli naczynie powierzchniowe jest uszkodzone i powoduje krwotok, należy lekko docisnąć sterylną gazą i zapewnić czas na hemostazę.
Należy również zauważyć, że ważne jest, aby obchodzić się z tkanką z minimalną wymaganą siłą i jeśli to możliwe, trzymać kleszczami bliżej bocznej granicy mięśnia i z dala od zamierzonej strefy niedokrwiennej. Praktyka ta pomaga uniknąć zmiażdżenia, które może prowadzić do dodatkowych reakcji tkanek o podłożu zapalnym, które mogą zakłócić reakcję przebudowy naczyń wywołaną przez podwiązanie tętnicy.
Podsumowując, wykazaliśmy zastosowanie mysiego mięśnia rdzeniowo-trapezowego jako modelu chirurgicznego do badania odpowiedzi naczyniowych i tkankowych na podwiązanie tętniczek. Model ten nadaje się do przyżyciowej oceny zmian naczyniowych (na przykład funkcjonalnego rozszerzenia naczyń krwionośnych) oraz do oceny ex vivo zmian naczyniowych (na przykład obrazowanie immunofluorescencyjne i ocena ilościowa sieci naczyniowych). Zarówno badania przedkliniczne, jak i kliniczne wykazały, że odpowiedź danej osoby na niedrożność tętniczek (np. poprzez podwiązanie u myszy lub blaszki miażdżycowe u ludzi) zależy od ich wieku, obecności lub braku choroby (np. cukrzycy), średnicy niedrożnej tętnicy, składu genetycznego danej osoby oraz zapotrzebowania metabolicznego tkanki 11-15. Modele mysie, takie jak ten prezentowany tutaj, korzystają z badań nad specyficznymi dla szczepu różnicami anatomicznymi i genetycznymi oraz fenotypami specyficznymi dla choroby, co ułatwia badanie tych złożonych zależności.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Kevinowi Macleodowi za wykorzystanie jego muzyki na licencji creative commons w powiązanym filmie, w tym (w kolejności pojawiania się) jego utworów "Airport Lounge", "Wallpaper" i "Evening Melodrama." Chcielibyśmy również podziękować Ndubisi Okeke i Frederickowi Torstrickowi za ich pomoc w przygotowaniu filmu z operacji.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nożyczki do przysłony | FST | 14090-09 | Typ: Narzędzie |
| Rozmiar 7 kleszczyki | FST | 11271-30 | Typ: |
| Narzędzie Rozmiar 5 kleszczyki | FST | 11251-20 | Typ: Narzędzie |
| Nożyczki sprężynowe | Roboz | RS5671 | Typ: Mikrosonda narzędziowa |
| FST | 10140-03 | Typ: Narzędzie Może być zastąpione prostą sondą | |
| Uchwyt igły | FST | 12500-12 | Typ: |
| Narzędzie Komora indukcyjna | JD Medical Dist. Co., Inc. | IC-1086 | Typ: |
| Sprzęt Żel do oczu | Dechra | NDC 17033-211-38 | Typ: Odczynnik |
| Poduszka grzewcza | FST | 21060-01 | Typ: Sprzęt |
| Sonda temperatury doodbytniczej | FST | 21060-01 | Typ: Sprzęt |
| Elektrody stymulujące | FHC | UEWSGCSE0N1M | Rodzaj: Sprzęt |
| Artisan's Polymer Clay | Polyform | Nie dotyczy | Typ: Sprzęt |
| System akwizycji danych PowerLab | ADInstruments | ML 845 | Typ: Sprzęt |
| Izolator bodźców | ADInstruments | FE 180 | Typ: Sprzęt |
| LabChart | ADInstruments | ML S060/7 | Typ: |
| Oprogramowanie Mikroskop fluorescencyjny ze światłem odbitym | Olympus | BFXM | Typ: Sprzęt |
| High MW dekstran fluorescencyjny | Sigma | FD250S-100MG | Rodzaj: Odczynnik |
| Suwmiarki wideo | Colorado Video | 308 | Rodzaj: Sprzęt |
| Automatyczna analiza naczyniowa (AVA) | Microvision Typ medyczny | : Oprogramowanie | |
| anty-αSMA sprzężony fluorofor | Sigma | 1A4-Cy3 | Typ: Odczynnik Klonalny, mikroskop |
| fluorescencyjny | 1:100Olympus | BFXM | Typ: Sprzęt |
| Fluorescencyjny dekstran o wysokiej masie cząsteczkowej | Sigma | FD250S-100MG | Rodzaj: Odczynnik |
Bibliografia
- Bailey, A. M., O'Neill, T. J., Morris, C. E., Peirce, S. M. Arteriolar Remodeling Following Ischemic Injury Extends from Capillary to Large Arteriole in the Microcirculation. Microcirculation. 15, 389-404 (2010).
- Bruce, A. C., Peirce, S. M. Exogenous Thrombin Delivery Promotes Collateral Capillary Arterialization and Tissue Reperfusion in the Murine Spinotrapezius Muscle Ischemia Model. Microcirculation. 19, 143-154 (2012).
- Mac Gabhann, F., Peirce, S. M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 17, 333-347 (2010).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (23), e1035(2009).
- Madeddu, P., et al. Murine models of myocardial and limb ischemia: diagnostic end-points and relevance to clinical problems. Vascul. Pharmacol. 45, 281-301 (2006).
- Cardinal, T. R., Kurjiaka, D. T., Hoying, J. B. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front. Physio. 2, 91(2011).
- Sefcik, L. S., et al. Selective Activation of Sphingosine 1-Phosphate Receptors 1 and 3 Promotes Local Microvascular Network Growth. Tissue Eng. Part A. 17, 617-629 (2011).
- Deindl, E., et al. Role of Ischemia and of Hypoxia-Inducible Genes in Arteriogenesis After Femoral Artery Occlusion in the Rabbit. Circulation Research. 89, 779-786 (2001).
- Chalothorn, D., Zhang, H., Smith, J. E., Edwards, J. C., Faber, J. E. Chloride Intracellular Channel-4 Is a Determinant of Native Collateral Formation in Skeletal Muscle and Brain. Circulation Research. 105, 89-98 (2009).
- Scholz, D., et al. Contribution of Arteriogenesis and Angiogenesis to Postocclusive Hindlimb Perfusion in Mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 775-787 (2002).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 1748-1756 (2011).
- Peng, X., et al. Gender differences affect blood flow recovery in a mouse model of hindlimb ischemia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, 2027-2034 (2011).
- Li, Y., Guan, H., Hazarika, S., Liu, C., Annex, B. H. Impaired angiogenesis following hind-limb ischemia in diabetes mellitus mice. Chin. Med. Sci. J. 22, 232-237 (2007).
Przedruki i uprawnienia
