Model danio pręgowanego cukrzycy i pamięci metabolicznej

Podsumowanie

Pamięć metaboliczna to zjawisko, dzięki któremu powikłania cukrzycowe utrzymują się i postępują bez przeszkód, nawet po osiągnięciu euglikemii farmaceutycznie. W tym miejscu opisujemy model danio pręgowanego z cukrzycą, który jest wyjątkowy, ponieważ pozwala na badanie mitotycznie przenoszonych składników epigenetycznych pamięci metabolicznej in vivo.

Streszczenie

Cukrzyca dotyka obecnie 346 milionów osób i przewiduje się, że do 2030 roku liczba ta wzrośnie do 400 milionów. Dowody zarówno z badań laboratoryjnych, jak i badań klinicznych na dużą skalę wykazały, że powikłania cukrzycowe postępują bez przeszkód dzięki zjawisku pamięci metabolicznej, nawet jeśli kontrola glikemii jest osiągana farmaceutycznie. Ekspresja genów może być stabilnie zmieniana poprzez zmiany epigenetyczne, które nie tylko pozwalają komórkom i organizmom szybko reagować na zmieniające się bodźce środowiskowe, ale także nadają komórce zdolność do "zapamiętywania" tych spotkań po usunięciu bodźca. W związku z tym role, jakie te mechanizmy odgrywają w zjawisku pamięci metabolicznej, są obecnie badane.

Niedawno informowaliśmy o rozwoju modelu danio pręgowanego typu I i scharakteryzowaliśmy ten model, aby pokazać, że cukrzycowe danio pręgowane nie tylko wykazują znane wtórne powikłania, w tym zmiany związane z retinopatią cukrzycową, nefropatią cukrzycową i upośledzonym gojeniem się ran, ale także wykazują upośledzoną regenerację płetwy ogonowej. Model ten jest wyjątkowy, ponieważ danio pręgowany jest w stanie zregenerować uszkodzoną trzustkę i przywrócić stan euglikemiczny, podobny do tego, którego można by się spodziewać u pacjentów po przeszczepie. Co więcej, wielokrotne rundy amputacji płetwy ogonowej pozwalają na separację i badanie czystych efektów epigenetycznych w systemie in vivo bez potencjalnych czynników komplikujących z poprzedniego stanu cukrzycy. Chociaż euglikemię uzyskuje się w wyniku regeneracji trzustki, wtórne powikłanie cukrzycowe związane z regeneracją płetw i gojeniem się ran skóry utrzymuje się w nieskończoność. W przypadku upośledzonej regeneracji płetw patologia ta utrzymuje się nawet po wielu rundach regeneracji płetw w tkankach płetwy potomnej. Obserwacje te wskazują na leżący u podstaw proces epigenetyczny istniejący w stanie pamięci metabolicznej. Poniżej przedstawiamy metody potrzebne do skutecznego generowania grup pamięci cukrzycowej i metabolicznej ryb oraz omawiamy zalety tego modelu.

Wprowadzenie

Cukrzyca (DM) to poważny i narastający problem zdrowotny, który powoduje skrócenie oczekiwanej długości życia z powodu specyficznych dla choroby powikłań mikronaczyniowych (retinopatia, nefropatia, neuropatia, zaburzenia gojenia się ran) i makronaczyniowych (choroby serca i udar ^{mózgu) 1}. Raz rozpoczęte powikłania cukrzycowe postępują nieprzerwanie, nawet jeśli osiągnięta jest kontrola glikemii ^2,3, a zjawisko to zostało nazwane pamięcią metaboliczną lub efektem dziedzictwa. Obecność tego zjawiska została rozpoznana klinicznie na początku lat 90. XX wieku, gdy "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" postępowało i od tego czasu zostało poparte wieloma dodatkowymi badaniami klinicznymi ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14}. Zwierzęce modele cukrzycy miały kluczowe znaczenie dla odkryć związanych z patofizjologią powikłań cukrzycowych i pamięcią metaboliczną. W rzeczywistości utrzymywanie się powikłań cukrzycowych zostało po raz pierwszy udokumentowane w psim modelu retinopatii cukrzycowej, który od tego czasu został poparty kilkoma liniami dowodów eksperymentalnych przy użyciu różnych systemów hodowli in vitro i modeli zwierzęcych ^{15,16,17,18,19,20,21}. Badania te wyraźnie pokazują, że początkowy okres hiperglikemii powoduje trwałe nieprawidłowości (w tym nieprawidłową ekspresję genów) docelowych narządów/komórek i mechanistycznie sugeruje zaangażowanie epigenomu.

Epigenomy składają się ze wszystkich modyfikacji chromatyny dla danego typu komórki i są odpowiedzialne za unikalny profil ekspresji genów komórki. Modyfikacje chromosomów są dynamiczne podczas rozwoju, wspomagają różnicowanie komórek, reagują na bodźce zewnętrzne, są mitotycznie stabilnie dziedziczone ^22,23 i mogą być zmieniane w chorobie ^24,25,26. Te mechanizmy epigenetyczne obejmują: potranslacyjne modyfikacje histonów, włączenie niekanonicznego wariantu histonu do oktomerów, zmiany dostępu do chromatyny poprzez metylację DNA oraz kontrolę ekspresji genów poprzez niekodujące mikro RNA ^27,28,29,30. Ogólnie rzecz biorąc, procesy epigenetyczne pozwalają komórkom/organizmom szybko reagować na zmieniające się bodźce środowiskowe ^31,32,33 , nadają również komórce zdolność do "zapamiętywania" tych spotkań po usunięciu bodźca ^23,22. W związku z tym, ponieważ zmienione profile ekspresji genów wynikające z procesów epigenetycznych są stabilne przy braku sygnału, który je zainicjował, i są dziedziczne poprzez podział komórki, zyskały one duże zainteresowanie jako mechanizmy molekularne leżące u podstaw patologii człowieka, w tym pamięci metabolicznej. Wyniki, które pojawiają się w kontekście DM i epigenetyki, są równoległe do postępów w innych chorobach, ponieważ mnóstwo zmian epigenetycznych wywołanych przez hiperglikemię powoduje niezwykłe, trwałe zmiany w sieciach transkrypcyjnych komórek (przegląd w ^{34,35,36,37,38}).

Danio pręgowany od dawna jest głównym modelowym organizmem do badania rozwoju kręgowców, jednak w ciągu ostatnich 15 lat nastąpił gwałtowny wzrost wykorzystania tego organizmu do badań nad ludzkimi chorobami. ³⁹. Ustalono modele chorób człowieka dla danio pręgowanego, obejmujące szeroki zakres patologii człowieka, w tym zaburzenia genetyczne i choroby nabyte ^40,41,42. Do wielu zalet danio pręgowanego w porównaniu z innymi modelowymi organizmami kręgowców należą: wysoka płodność, krótki czas generacji, przejrzystość do wczesnej dorosłości, zmniejszone koszty utrzymania oraz szereg narzędzi do manipulacji genami. Co więcej, ze względu na rozległą ochronę szlaków genetycznych i fizjologii komórkowej wśród kręgowców oraz zdolność do wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, danio pręgowany został z powodzeniem wykorzystany do odkryć farmaceutycznych.

Opracowaliśmy model dorosłego danio pręgowanego z cukrzycą typu I, używając leku przeciwcukrzycowego, streptozocyny. Scharakteryzowaliśmy ten model, aby pokazać, że danio pręgowany z cukrzycą nie tylko wykazuje znane ludzkie wtórne powikłania, ale ponadto wykazuje upośledzoną regenerację kończyn (regenerację płetwy ogonowej) w wyniku środowiska hiperglikemicznego. Ponadto donieśmy również, że danio pręgowany z hiperglikemią powraca do normalnej glikemii w ciągu 2 tygodni od odstawienia leku w wyniku regeneracji endogennych komórek beta trzustki, co skutkuje fizjologicznie normalnym stanem glikemicznym. Jednak w przeciwieństwie do tego, regeneracja kończyn u tych ryb pozostaje upośledzona w takim samym stopniu, jak w ostrym stanie cukrzycowym, co wskazuje, że to powikłanie utrzymuje się i jest podatne na pamięć metaboliczną. Głównym impulsem do stworzenia tego modelu było zapewnienie systemu do badania mitotycznie stabilnych składników epigenetycznych, które wspierają zjawisko pamięci metabolicznej przy braku szumu tła poprzedniego środowiska hiperglikemicznego. Po zakończeniu dostarczonego tutaj protokołu danio pręgowany i/lub selektywne tkanki mogą być przetwarzane za pomocą dowolnego testu odpowiedniego do potrzeb badaczy. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę procedurę do identyfikacji utrzymujących się w całym genomie zmian w metylacji DNA wywołanych hiperglikemią, które są utrzymywane w stanie pamięci metabolicznej ²¹.

Uważamy, że ten model zebrywanego cukrzycy typu I ma kilka innowacyjnych zalet w porównaniu z innymi systemami modelowymi do badania pamięci metabolicznej. 1) Wszystkie nasze badania mogą być prowadzone in vivo, a ponieważ poprzednie ryby hiperglikemiczne powracają do euglikemii poprzez regenerację endogennej produkcji insuliny, nie wymagają egzogennych zastrzyków insuliny. W związku z tym pozwala to uniknąć komplikujących skoków i dolin w kontroli glikemii, które mogą wystąpić u zwierząt wymagających egzogennej insuliny. 2) Jak opisano powyżej, stymulacja tła z poprzedniego stanu cukrzycowego (tj. ciągła obecność końcowych produktów zaawansowanej glikacji i markerów reaktywnych form tlenu) jest eliminowana, a zatem można badać czysto epigenetyczne czynniki pamięci metabolicznej. 3) Eksperymenty można przeprowadzić szybko, ponieważ od indukcji cukrzycy do badania pamięci metabolicznej mija około 80 dni. 4) Regeneracja płetwy ogonowej jest eksperymentalnie bardzo przystępna i pozwala na łatwą manipulację genetyczną i eksperymentalną, do której istnieje szeroki wachlarz narzędzi. 5) Regeneracja płetwy ogonowej stanowi bardzo prostą i wymierną metodę oceny pamięci metabolicznej, a zatem pozwoli na odkrycie leków w przyszłości.

Protokół

Wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z wytycznymi opisanymi w "Zasadach opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" (publikacja National Institutes of Health nr 85-23, poprawiona w 1985 roku) oraz zatwierdzonym protokołem 08-19 Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Rosalind Franklin.

Są 2 ważne skróty, które są używane w tym manuskrypcie. 1) DM: odnosi się do ryb, które znajdują się w ostrym (300 mg/dl) stanie hiperglikemii i przebywają w nim od co najmniej 3 tygodni. 2) MM: odnosi się do ryb, które były 21-dniowymi (patrz protokół) rybami cukrzycowymi i którym pozwolono przywrócić kontrolę glikemii poprzez regenerację trzustki. Osiąga się to w ciągu (14) dni od usunięcia leku. Od tego momentu ryby są uważane za ryby MM. Należy również zauważyć, że ryby, które określa się mianem ryb kontrolnych, są traktowane identycznie jak ryby DM lub MM pod względem liczby wstrzyknięć (tylko sól fizjologiczna), czasu inkubacji w różnych temperaturach oraz liczby i czasu amputacji płetw ogonowych.

1. Pokolenie danio pręgowanego z cukrzycą, DM Fish

1. Przygotuj zarówno zbiorniki na wodę regeneracyjną, jak i znieczulającą. Woda regeneracyjna to normalna woda dla ryb. W przypadku wody znieczulającej dodaj wystarczającą ilość 2-fenoksyetanolu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1,000 w normalnej wodzie dla ryb.
2. Przygotować 0,3% roztwór (w dygestorium) streptozocyny (STZ) dodając 6 mg STZ do 2 ml 0,09% chlorku sodu i natychmiast umieścić roztwór na lodzie. Zapewni to wystarczającą ilość roztworu do wstrzyknięcia około 20 ryb w ciągu 20 minut. Jeśli przekroczysz znak 20 minut, zatrzymaj się i przygotuj świeży roztwór STZ przed kontynuowaniem. W oddzielnej probówce podwielokrotność roztworu soli fizjologicznej wystarczająca do kontrolowania ryb. Po rozpuszczeniu STZ wszystkie kolejne kroki nie wymagają użycia dygestorium.
3. Napełnij strzykawkę o pojemności 1/2 cm3 wyposażoną w igłę o rozmiarze 27 1/2 roztworem STZ lub roztworem kontrolnym, upewniając się, że nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza.
4. Znieczulenie każdej ryby z osobna, umieszczając ją w znieczulonej wodzie i poczekaj, aż ich ruch pływania ustanie (1-2 min).
5. Po znieczuleniu na krótko umieść rybę na ręczniku papierowym, aby wchłonąć nadmiar wody, umieść rybę w łodzi do ważenia i zmierz masę ryby.
6. Umieścić rybę na twardym podłożu (pokrywka szalki Petriego) w celu wstrzyknięcia.
7. Wstrzyknąć STZ lub roztwór kontrolny do jamy otrzewnowej ryby, wprowadzając igłę poza skos do tylnej części brzusznej otrzewnej.
8. Każdej rybie należy dostarczyć 0,35 mg/g (350 mg/kg) STZ, a wymaganą objętość 0,3% roztworu można obliczyć w następujący sposób.
   1. Pomnóż masę ryby (g) przez 0,35, aby otrzymać wymaganą ilość STZ w mg.
   2. Podzielić wytworzony powyżej produkt przez 3, aby otrzymać objętość 0,3% roztworu wymaganego do wstrzyknięcia w μl.
      Próbka: Dla ryby o masie 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175/3 = 0,058 ml = 58 μl,
      Ta sama objętość bez STZ zostałaby wstrzyknięta dla ryby kontrolnej. Należy sporządzić arkusz określający objętości do wstrzyknięcia na masę ryb i wykorzystać go do szybkiego odniesienia.
9. Po wstrzyknięciu umieść ryby w zbiorniku na wodę regeneracyjną i monitoruj je pod kątem normalnej aktywności pływackiej. Po osiągnięciu tego celu ryby przenosi się do normalnego zbiornika, który jest utrzymywany w zmniejszonym zakresie temperatur od 22 °C do 24 °C. Ta obniżona temperatura ma kluczowe znaczenie dla skutecznej indukcji hiperglikemii (cukrzyca, DM).
10. Chociaż hiperglikemia jest wykrywana w ciągu 24 godzin od pierwszego wstrzyknięcia, w celu wywołania przedłużonego stanu bardzo wysokiej hiperglikemii danio pręgowany wymaga częstej fazy indukcji wstrzyknięcia, a następnie cotygodniowych zastrzyków podtrzymujących, jak pokazano poniżej.

Tydzień 1: 3 wstrzyknięcia (Dzień 1, 3, 5), Tydzień 2: 1 wstrzyknięcie (Dzień 12), Tydzień 3: 1 wstrzyknięcie (Dzień 19),
Tydzień 4: (Dzień 21) Wykonaj interesujący Cię test.

W tym momencie uważa się, że danio pręgowany znajdował się w przedłużonym stanie hiperglikemii i wykazywał cukrzycowe powikłania retinopatii, nefropatii, a także upośledzoną regenerację płetw. Są one określane jako ryby DM. Dodatkowo, w razie potrzeby, ryby można utrzymać w stanie hiperglikemii za pomocą cotygodniowych zastrzyków podtrzymujących. Podczas tego procesu należy spodziewać się około 5% zgonu.

2. Pobieranie krwi i oznaczanie poziomu glukozy we krwi na czczo (FBGL)

1. Każda grupa ryb DM i kontrolnych musi zawierać wystarczającą liczbę ryb, aby dokładnie określić średni FBGL w grupie, ponieważ ten test wymaga uśmiercenia tych ryb.
2. Przygotuj oznakowaną probówkę do PCR dla każdej próbki krwi zawierającej 5 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
3. W celu pobrania krwi znieczulij rybę jak powyżej, usuń całą wodę, umieść rybę na szkiełku mikroskopowym i za pomocą skalpela usuń głowę ryby u podstawy wieczka.
4. Zebrać krew (do 2 μl) uwolnioną od ryby na szkiełko podstawowe i szybko dodać ją do 5 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej, pipetując w górę i w dół, aby upewnić się, że krew się nie zatka. Natychmiast umieścić próbkę na lodzie.
5. Oznaczyć objętość próbki krwi, mierząc całkowitą objętość płynu (sól fizjologiczna + krew), a następnie odejmując 5 μl soli fizjologicznej.
6. Przenieś 5 μl rozcieńczonej krwi z każdej probówki do PCR do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i oznacz stężenie glukozy we krwi za pomocą zestawu do oznaczania glukozy QuantiChrome. Odbywa się to bez wyjątku zgodnie z protokołem producenta. Oczekiwane efekty: ryby normalne/kontrolne 60 mg/dl i ryby DM 310 mg/dl.

3. Badania nad regeneracją płetw ogonowych

1. Znieczulić ryby zgodnie z opisem w 1.0-1.4.
2. Umieść rybę na pokrywie szalki Petriego i amputuj płetwę ogonową w linii prostej za pomocą sterylnego skalpela w rozmiarze 10 proksymalnie do pierwszego punktu rozgałęzienia lepidotrichia, oglądając płetwę przez mikroskop preparacyjny.
3. Pozwolić, aby ryby zregenerowały się, jak w ppkt 1.10, ale umieścić ryby w temperaturze 33 °C na regeneracyjną fazę wzrostu testu. Jest to ustalona temperatura dla analizy przyspieszonej regeneracji płetw.
4. Płetwy można obrazować w dowolnym momencie po amputacji, jednak rutynowo badamy wzrost regeneracyjny po 24, 28 i 72 godzinach po przecięciu.
5. Znieczulić ryby jak poprzednio (patrz 1.0-1.4), umieścić rybę pod mikroskopem preparacyjnym wyposażonym w kamerę (używamy Nikona SMZ-1500 wyposażonego w kamerę do obrazowania Q) i zebrać wszystkie obrazy płetw w powiększeniu 1X za pomocą oprogramowania NIS elements. Płetwa powinna być rozłożona do obrazowania tak, aby była całkowicie wysunięta bez rozciągania lub uszkadzania tkanki i powinna być wolna od kropelek wody. Aby zachować spójność, zawsze umieszczaj stronę grzbietową po prawej stronie.
6. Drukuj obrazy i mierz obszar wzrostu regeneracyjnego za pomocą oprogramowania Image J i bloku rysunkowego. Obrysuj cały obszar nowego wzrostu i określ obszar. Każdy pomiar powinien być wykonany pięć razy i uśredniony, aby zapewnić dokładność śledzenia. Ważne jest, aby użyte obrazy nie zawierały cieni ani kropel wody, ponieważ przyczyniają się one do błędów w pomiarze obszaru przyrostu.
7. Zmierzyć długość miejsca amputacji wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej i podzielić obszar wyznaczony w ppkt 3.6 przez ten pomiar. Pozwala to na bezpośrednie porównywanie ryb o różnych rozmiarach.

4. Generacja pamięci metabolicznej (MM) Danio pręgowany

1. Zainicjować grupę ryb DM i ich odpowiednie kontrole, jak opisano w sekcji 1.
2. Po 21 dniach określ FBGL dla podzbioru grupy i podziel ryby DM na 2 podgrupy. Kontynuuj cotygodniowe wstrzyknięcia STZ dla jednej z grup jako grupy kontrolnej DM przez czas trwania eksperymentu. Należy przerwać wstrzykiwanie STZ dla drugiej grupy i inkubować ryby w normalnej temperaturze. W ciągu 14 dni danio pręgowany przywróci prawidłową kontrolę insuliny i glukozy we krwi poprzez regenerację trzustki. Ryby te nazywane są obecnie MM (ryba pamięci metabolicznej).
3. W 30 dniu po usunięciu leku amputować płetwy ogonowe ryb kontrolnych, DM i MM metodą opisaną w ppkt 3.2.
4. Przywróć ryby do normalnych warunków wodnych w celu regeneracji płetw przez 30 dni. Pozwala to na wzrost tego, co nazywamy metaboliczną tkanką pamięci.
5. W 60 dniu wykonać drugą amputację (zgodnie z opisem w 3.2) w tkance, która została zregenerowana w okresie od 30 do 60 dni i wykonać test regeneracji płetwy ogonowej (3.1-3.7) Ryc. 1.
6. Wyizoluj tkankę i wykonaj interesujący Cię test. Tabela 1 zawiera podsumowanie protokołu.

Wyniki

Zebrafish z cukrzycą typu I wykazują nie tylko znane powikłania wtórne, takie jak retinopatia i nefropatia, ale także dodatkowe powikłanie: upośledzoną regenerację płetwy ogonowej. To ostatnie powikłanie utrzymuje się ze względu na pamięć metaboliczną u ryb, u których przywrócono prawidłową kontrolę glikemii po okresie hiperglikemii. Na Rysunku 2A (kontrola) oraz Rysunku 2B (pamięć metaboliczna) przedstawiono reprezentatywne obrazy regenerujących się płetw, wykonane 72 h po amputacji. De...

Dyskusja

Cukrzyca jest chorobą polegającą na rozregulowaniu metabolizmu, początkowo diagnozowanym jako hiperglikemia, która ostatecznie prowadzi do uszkodzenia naczyń krwionośnych prowadzących do wielu powikłań, które utrzymują się nawet po osiągnięciu euglikemii poprzez interwencję farmaceutyczną. To utrzymywanie się powikłań jest określane jako pamięć metaboliczna, a kilka ostatnich badań zbadało rolę, jaką odgrywają mechanizmy epigenetyczne w tym zjawisku. Tutaj szczegółowo opisaliśmy protokół, który pozwala na generowanie zar...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 fenoksyetanol	Skalpel Sigma Aldrich	P1126
(rozmiar 10)	Fisher Scientific	089275A
Szalki Petriego	Fisher Scientific	08-757-13
½ strzykawka cc, z igłą o rozmiarze 27 1/2	Fisher Scientific	305620
Zestaw do oznaczania glukozy QuantiChrome.	Systemy testów biologicznych	DIGL-100
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S3014
Mikroskop preparacyjny	Nikon	TMZ-1500	Każdy mikroskop preparacyjny jest w porządku.
Aparat do obrazowania	Obrazowanie Nikon	Q	Każdy aparat jest odpowiedni.
Oprogramowanie Image J	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Odpowiednie jest dowolne oprogramowanie do obrazowania.