Mysi model gojenia się ran

Podsumowanie

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Streszczenie

Gojenie i gojenie ran to najbardziej złożone procesy biologiczne, które zachodzą w życiu człowieka. Po urazie aktywuje się wiele szlaków biologicznych. Upośledzone gojenie się ran, które występuje na przykład u pacjentów z cukrzycą, może prowadzić do poważnych niekorzystnych wyników, takich jak amputacja. W związku z tym istnieje coraz większy impuls do opracowywania nowych środków, które wspomagają gojenie się ran. Ich testowanie ograniczyło się do dużych modeli zwierzęcych, takich jak świnie, które często są niepraktyczne. Myszy stanowią idealny model przedkliniczny, ponieważ są ekonomiczne i podatne na manipulacje genetyczne, co pozwala na badania mechanistyczne. Jednak gojenie się ran u myszy zasadniczo różni się od gojenia się ludzi, ponieważ zachodzi głównie poprzez skurcz. Nasz mysi model radzi sobie z tym problemem, umieszczając szynę wokół rany. Poprzez szynowanie rany, proces gojenia jest następnie zależny od nabłonkowania, proliferacji komórkowej i angiogenezy, które ściśle odzwierciedlają biologiczne procesy gojenia się ran u ludzi. Chociaż wymaga spójności i staranności, ten mysi model nie obejmuje skomplikowanych technik chirurgicznych i pozwala na solidne testowanie obiecujących środków, które mogą, na przykład, promować angiogenezę lub hamować stan zapalny. Co więcej, każda mysz pełni rolę własnej grupy kontrolnej, gdy przygotowywane są dwie rany, co umożliwia zastosowanie zarówno badanego związku, jak i kontroli nośnika na tym samym zwierzęciu. Podsumowując, demonstrujemy praktyczny, łatwy do opanowania i solidny model gojenia się ran, który jest porównywalny z modelem gojenia się ran.

Wprowadzenie

Upośledzone gojenie się ran jest odpowiedzialne za znaczną zachorowalność i śmiertelność na całym świecie; dotyczy to szczególnie osób cierpiących na cukrzycę^1,2. U ludzi gojenie się ran jest kontinuum procesów, w których w znacznym stopniu nakładają się^{na siebie 3}. Bezpośrednio po zranieniu inicjowane są procesy zapalne. Komórki zapalne uwalniają czynniki, które pobudzają procesy proliferacji, migracji i angiogenezy komórek. Po reepitelializacji i utworzeniu nowej tkanki następuje faza przebudowy, która pociąga za sobą zarówno apoptozę, jak i reorganizację białek macierzy, takich jak kolagen.

Złożoność gojenia ran nie może być obecnie odtworzona in vitro, co wymaga użycia modeli zwierzęcych. Do tej pory badania nad gojeniem się ran ograniczały się do dużych modeli zwierzęcych, takich jak świnie, aby zapewnić, że procesy gojenia są równoważne i porównywalne z procesami u ludzi. Jednak wykorzystanie dużych zwierząt do takich badań może być trudne do utrzymania w domu i nie zawsze jest praktyczne⁴. Mysz laboratoryjna reprezentuje ekonomiczny model zwierzęcy, który można łatwo manipulować genetycznie w celu przeprowadzenia badań mechanistycznych^5-7. Jednak rany mysie goją się inaczej niż u ludzi, przede wszystkim ze względu na proces skurczu⁸. Wynika to częściowo z rozległej podskórnej warstwy mięśni prążkowanych zwanej panniculus carnosus, która jest w dużej mierze nieobecna u ludzi. U myszy ta warstwa mięśniowa umożliwia ruch skóry niezależnie od głębszych mięśni i jest odpowiedzialna za szybki skurcz skóry po zranieniu.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie, mysie gojenie ran może być dostosowane do replikowania gojenia się ran u ludzi za pomocą szyny (Rysunek 1)^8,9. W tym filmie pokazujemy szynowany model rany mysjej, który eliminuje skurcz rany i bardziej zbliża się do ludzkich procesów reepitelializacji i tworzenia nowych tkanek. W tym modelu na grzbiecie tworzone są dwa wycięcia o pełnej grubości, które obejmują panniculus carnosus, po jednym z każdej strony linii środkowej myszy. Wokół rany za pomocą kleju zakłada się szynę silikonową, a następnie zabezpiecza się ją przerwanymi szwami. Każda mysz działa jak osobna kontrola, przy czym jedna rana jest leczona, a druga kontrolowana pojazdem, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt. Po zastosowaniu miejscowym nakładany jest przezroczysty opatrunek okluzyjny. Opatrunek można zdjąć w razie potrzeby do dalszych zastosowań miejscowych i/lub pomiaru powierzchni rany^10,11. Po zakończeniu eksperymentów zamknięcie rany, architekturę morfologiczną i stopień neowaskularyzacji można ocenić za pomocą immunohistochemii. Ten ekonomiczny i łatwy do wykonania model może być również wykorzystany do oceny gojenia się ran w kontekście cukrzycy lub innych patofizjologii.

Protokół

1. Przygotowanie szyn i opatrunków okluzyjnych

1. Obrysuj 10 mm kółka na folii silikonowej o grubości 0,5 mm i użyj nożyczek lub dziurkacza do biopsji, aby stworzyć silikonowe krążki.
2. Wyśrodkuj stempel do biopsji o średnicy 5 mm w środku okręgu o średnicy 10 mm i mocno dociśnij, aby utworzyć otwór tworzący krążek przypominający "pączek", który będzie używany jako szyna.
3. Obrysuj 10 mm kółka na przezroczystym opatrunku okluzyjnym, takim jak Opsite, i użyj nożyczek, aby stworzyć okrągłe opatrunki.

2. Zwierzęta doświadczalne

1. Uzyskanie zgody Komisji Bioetycznej ds. Zwierząt na wszystkie eksperymenty, które zostaną przeprowadzone.
2. Użyj 8-tygodniowych (22-26 gramów) samców myszy C57BL/6J od komercyjnego hodowcy (np. The Jackson Laboratories).
3. Trzymaj myszy w standardowych warunkach 21 °C i 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.
4. (Opcjonalnie): Cukrzycę można wywołać u myszy w wieku od 6 do 7 tygodni za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego w bolusie 165 mg/kg streptozotocyny (w buforze cytrynianowym, pH 4,5), z hiperglikemią potwierdzoną przez regularne monitorowanie stężenia glukozy we krwi (glukometr AccuChek). Myszy z cukrzycą mogą mieć wielomocz, dlatego ich ściółka może wymagać częstszej zmiany w celu wyeliminowania wilgoci, a ich waga powinna być ściśle monitorowana.

3. Znieczulenie i przygotowanie operacyjne

1. Wywołaj znieczulenie ogólne za pomocą 5% izofluranu w 100% tlenu (szybkość przepływu 1 l/min) i utrzymuj znieczulenie za pomocą 1-3% izofluranu.
2. Upewnij się, że głębokie odruchy pedałowania myszy są stłumione i umieść mysz w pozycji leżącej.
3. Przygotuj obszar operacyjny, usuwając sierść za pomocą maszynki do strzyżenia od podstawy szyi do 3 cm dalej w dół pleców i między dwiema łopatkami.
4. Lekką aplikację kremu do depilacji można nakładać nie dłużej niż 2 minuty. Można użyć wacików z gazy, aby upewnić się, że cały krem i pozostała sierść zostały usunięte.
5. Przetrzyj skórę wacikiem nasączonym alkoholem i dwiema aplikacjami 10% jodu powidonu (Betadine) i udrapuj mysz.

4. Wycięcie i unieruchomienie rany

1. Schematyczne przedstawienie mysiego modelu gojenia się ran przedstawiono na rysunku 1.
2. Użyj sterylnego dziurkacza do biopsji o średnicy 4 mm, aby obrysować dwa okrągłe wzory rany po obu stronach linii środkowej myszy na poziomie ramion (patrz ryc. 2a-2b).
3. Użyj ząbkowanych kleszczy, aby podnieść skórę w środku konturu i nożyczek do tęczówki, aby utworzyć ranę o pełnej grubości, która rozciąga się przez tkankę podskórną (ryc. 2c-2d), w tym panniculus carnosus (ryc. 2e), i wyciąć okrągły kawałek tkanki.
4. Powtórz ten proces dla rany po drugiej stronie linii środkowej (Rysunek 2f).
5. Usuń plastikową powłokę ochronną z każdej strony silikonowej szyny.
6. Nałóż klej cyjanoakrylowy (np. Super Glue lub Krazy Glue) na jedną stronę szyny silikonowej.
7. Wyśrodkuj szynę nad raną (ryc. 2g) i zakotwicz szynę za pomocą przerywanych szwów nylonowych 6-0, aby zapewnić ułożenie (ryc. 2h).
8. Powtórz proces szynowania na drugiej ranie.
9. Jeśli jest to wymagane w tym momencie, należy nałożyć badany związek terapeutyczny (do 100 μl) na jedną ranę (rysunek 2i), a kontrolę nośnika na drugą.
10. Przykryj ranę przezroczystym opatrunkiem okluzyjnym (na przykład OpSite) (ryc. 2j-2k).
11. Pod szynami umieszcza się linijkę i wykonuje się mikrofotografię (ryc. 2l).

6. Postępowanie pooperacyjne

1. Karprofen (5 mg/kg) podaje się raz na dobę we wstrzyknięciu podskórnym w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
2. Po operacji zwierzęta są indywidualnie umieszczane w klatkach i trzymane na matach grzewczych do czasu całkowitego wyzdrowienia.
3. Monitoruj zwierzęta dwa razy dziennie pod kątem objawów bólu i utraty wagi. Nie zaobserwowaliśmy żadnych rażących przejawów bólu lub utraty wagi.

7. Pomiar i leczenie ran

1. Rana może być mierzona codziennie.
2. Wywołaj znieczulenie ogólne za pomocą 5% izofluranu (szybkość przepływu 1 l/min), a następnie upewnij się, że głębokie odruchy czuciowe myszy są tłumione za pomocą 1-3% izofluranu.
3. Delikatnie odklej opatrunek okluzyjny za pomocą kleszczy.
4. Użyj suwmiarki chirurgicznej, aby zmierzyć średnicę rany. Pobieramy średnią z trzech pomiarów wzdłuż osi X, Y i Z (rysunki 2m-2o) oraz mikrofotografię do wykorzystania w przyszłości (Rysunek 2p).
5. Opcjonalnie: W tym czasie zwierzę można ocenić pod kątem perfuzji krwi za pomocą laserowego obrazowania dopplerowskiego (ryc. 2q).
6. W tym momencie można ponownie zastosować związek terapeutyczny i przeprowadzić kontrolę pojazdu.
7. Następnie ponownie nakłada się czysty, przezroczysty opatrunek okluzyjny, a zwierzęta trzyma się w cieple aż do całkowitego wyzdrowienia.
8. Uwaga: jeśli szyny nie są odpowiednio zabezpieczone, rana łatwo się kurczy (ryc. 2r).

8. Analiza histologiczna

1. Myszy należy poddać eutanazji po 10 dniach za pomocą przedawkowania znieczulenia.
2. Za pomocą kleszczyków i ostrza skalpela usuń szwy i ostrożnie oderwij szynę.
3. Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonać szerokie, pełne wycięcie wokół i pod raną i inkubować tkankę w 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C przez noc.
4. Przenieść tkankę do 17% sacharozy w roztworze PBS na kolejne 24 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć nadmiar roztworu, ostrożnie wklepując w tkankę i umieścić w związku OCT i zamrozić w temperaturze -80 °C.
5. Barwienie hematoksyliną i eozyną można wykorzystać do wizualizacji struktury rany i szczeliny nabłonkowej. Neowaskularyzację można ocenić za pomocą analiz immunohistochemicznych w celu określenia liczby naczyń włosowatych (przy użyciu czynnika von Willebranda).

Wyniki

Krzywą gojenia rany wyznacza się poprzez obliczenie średnicy rany i wyrażenie wyników w procentach, t.j. 100 - (średnica w dniu 0/średnica w dniu X). W tym doświadczeniu do rany codziennie aplikowano związek terapeutyczny (lub kontrolę nośnikiem). Związek terapeutyczny znacznie przyspieszył zamykanie się rany (Rysunek 3). Należy zauważyć, że szyny muszą być utrzymywane przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ ich usunięcie doprowadzi do szybkiego kurczenia się rany (Rysunek 2r

Dyskusja

Jest to eksperymentalny mysi model gojenia się ran skórnych. Istotną cechą tego modelu jest zastosowanie szyn silikonowych zapobiegających kurczeniu się rany, dzięki czemu może dojść do ponownego nabłonkowania i tworzenia się nowych tkanek, co upodabnia go do procesu zachodzącego u ludzi. Model ten jest wszechstronny i może być używany do oceny gojenia się ran zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patofizjologicznych (np. cukrzyca). Model może być również wykorzystany do oceny potencjalnego gojenia się ran ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Folia silikonowa Press-to-seal o grubości 0,5 mm	Invitrogen	P18178	Pokroić w "pączki" o średnicy zewnętrznej 1 cm zewnętrznej, 0,5 cm średnicy wewnętrznej
Dziurkacz do biopsji 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	Do obrysowania obszaru rany do wycięcia
Nożyczki Vannas 8,5 cm zakrzywione	World Precision Instruments	501232	Do nacinania i wycinania ran
Dumonte #7b kleszcze, 11 cm	World Precision Instruments	501302	Do chwytania skóry podczas wykonywania nacięć i wycinania skóry
Kleszcze Graefe, ząbkowane 10 cm	World Precision Instruments	14142	Do pomocy w mocowaniu szyny silikonowej do skóry
Uchwyt igły, szczęki gładkie, zakrzywiony, 12,5 cm	World Precision Instruments	14132
Kleszcze Malis, gładkie, proste, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J& Amp; J)	80-1500	Do przyszywania pierścieni silikonowych do skóry
Linijka, gradacja 0,5 mm	nie dotyczy
Suwmiarki Gradacja 0,25 mm	Duckworth i Kent	9-653	Do pomiaru obszaru rany
Opsite FlexiFix przezroczysta folia samoprzylepna. 10 cm x 1 m	Smith & Siostrzeniec	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986