Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Summary

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Abstract

Technologie tworzenia wzorców komórkowych, które są szybkie, łatwe w użyciu i przystępne cenowo, będą potrzebne do przyszłego rozwoju wysokoprzepustowych testów komórkowych, platform do badania interakcji komórka-komórka i systemów inżynierii tkankowej. Ten szczegółowy protokół opisuje metodę generowania kokultur komórek przy użyciu biokompatybilnych roztworów dekstranu (DEX) i glikolu polietylenowego (PEG), które rozdzielają się fazowo po połączeniu powyżej stężeń progowych. Za pomocą tej metody komórki mogą być wzorowane w różnych konfiguracjach. Wzorzec wykluczenia komórek można przeprowadzić poprzez drukowanie kropelek DEX na podłożu i pokrycie ich roztworem komórek zawierających PEG. Napięcie międzyfazowe powstające między dwoma roztworami polimerowymi powoduje, że komórki opadają na zewnątrz kropli DEX i tworzą okrągłe oczyszczanie, które można wykorzystać do testów migracji. Wyspy komórkowe można modelować poprzez dozowanie bogatej w komórki fazy DEX do roztworu PEG lub przez pokrycie kropli DEX roztworem PEG. Kokultury mogą być tworzone bezpośrednio przez połączenie wykluczania komórek z modelowaniem wysp DEX. Metody te są kompatybilne z różnymi podejściami do obchodzenia się z cieczami, w tym z ręcznym mikropipetowaniem, i mogą być stosowane z praktycznie każdym typem komórek przylegających.

Introduction

Wodne układy dwufazowe (ATPS) powstają, gdy roztwory dwóch niekompatybilnych polimerów są mieszane ze sobą w wystarczająco wysokich stężeniach. Na separację faz ma wpływ wiele czynników, w tym masa cząsteczkowa i polarność polimerów, temperatura roztworów, pH i zawartość jonów w wodnym rozpuszczalniku ^{1, 2}. Punkt, w którym dwa roztwory polimerowe rozdzielają się, jest określany przez właściwości fizykochemiczne wybranego układu fazowego, ale na ogół występuje przy niskich stężeniach polimerów (mniej niż 20% wag./wag.) w warunkach niedenaturujących, co pozwala na stosowanie ATPS do zastosowań biotechnologicznych ^3-9.

Zdecydowanie najszerzej badanym ATPS jest system glikolu polietylenowego (PEG)/dekstranu (DEX). ATPS utworzony przez te niedrogie i biokompatybilne polimery został pierwotnie opisany do oczyszczania biomolekuł za pomocą partycjonowania molekularnego ^{2, 10}. Partycjonowanie następuje, gdy dodatkowe cząsteczki lub cząstki, które nie przyczyniają się do układu fazowego, są mieszane z PEG i DEX. W oparciu o ich względne powinowactwo do DEX lub PEG, cząsteczki lub cząstki będą preferencyjnie znajdować się w jednej z dwóch faz lub na granicy faz. Kolejną właściwością PEG/DEX ATPS jest istnienie napięcia międzyfazowego między dwiema fazami polimeru. ATPS utworzone przez PEG i DEX na ogół wykazują napięcia międzyfazowe, które są znacznie niższe niż w innych dwufazowych układach ciecz-ciecz, takich jak olej i woda; Jednak międzyfazowe siły napięcia nadal wywierają wpływ na małe cząsteczki, takie jak wirusy, komórki i agregaty białkowe ^{2, 11-13}. Wreszcie, ponieważ PEG i DEX o wyższej masie cząsteczkowej rozdzielają się w niskich stężeniach (mniej niż 5% wag./wt dla odmian polimerów o wysokiej masie cząsteczkowej) w obecności fizjologicznych stężeń soli, istnieje niewiele, jeśli w ogóle, szkodliwy wpływ na komórki ssaków włączone do tych systemów ^14-16.

Ostatnio, właściwości międzyfazowe i efekty podziału ATPS zostały zastosowane przez nasze laboratorium do modelowania komórek ^{14, 16-20}. Udało się to osiągnąć poprzez mikrowzorzec gęstszego roztworu DEX na podłożach hodowli komórkowych w obecności PEG. Kiedy komórki są włączane do fazy PEG, są wykluczone z przedostania się do kropelek DEX ze względu na napięcie międzyfazowe PEG/DEX ²⁰. Kiedy komórki są wzorzyste w fazie DEX, są zatrzymywane na powierzchni substratu hodowli komórkowej przez napięcie międzyfazowe i partycjonowanie ^{16, 17, 19}.

W przeciwieństwie do innych metod tworzenia wzorów komórkowych, tworzenie wzorów komórkowych ATPS jest łatwe do nauczenia i wymaga jedynie podstawowej wiedzy na temat samych polimerów, a także umiejętności przeprowadzenia hodowli komórkowej i użycia mikropipetatora. Inne metody tworzenia wzorców komórkowych często wymagają specjalistycznego sprzętu i szkolenia, które nie są łatwe do przełożenia na nauki przyrodnicze. Na przykład niektóre metody (druk mikrokontaktowy lub druk atramentowy) modelują komórki pośrednio, nakładając wzory biomolekuł adhezyjnych komórek na podłoże hodowlane, które następnie służą jako miejsca przyczepiania komórek ^{21, 22}. Chociaż podejścia pośrednie są przydatne w przypadku niektórych typów komórek, wymagają one wysokiego stopnia umiejętności użytkownika i specjalistycznego sprzętu do wytworzenia narzędzia do tworzenia wzorów i mogą nie mieć specyficzności w zależności od konkretnego typu komórki / wzoru biomolekuły. Alternatywnie, komórki mogą być osadzane z wysoką specyficznością wzoru za pomocą bezpośrednich metod modelowania, które obejmują modelowanie przepływu laminarnego, szablony i druk atramentowy ^23-26. Jednak techniki te wymagają również wiedzy użytkownika i specjalistycznego sprzętu oraz mogą uszkodzić ogniwa podczas procesu drukowania. Chociaż podejścia te na ogół tworzą precyzyjne wzorce komórek, aby wzorce komórek były użytecznym narzędziem w naukach przyrodniczych, muszą być opłacalne i proste do wdrożenia.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół generowania wzorcowych kultur komórkowych przy użyciu ATPS opisanych w naszych poprzednio opublikowanych aplikacjach. Korzystając wyłącznie z mikropipetatorów, użytkownicy mogą generować strefy wykluczenia komórek lub wyspy komórkowe do testów migracji. Osiąga się to za pomocą napięcia międzyfazowego PEG/DEX, które albo zatrzymuje komórki w fazie DEX, albo wyklucza komórki zdeponowane w fazie PEG z DEX. Łącząc te dwie podstawowe techniki modelowania, możliwe jest szybkie generowanie kokultur komórek, takich jak kokultury komórek wątroby i fibroblastów. Szczegółowo opisano metody tworzenia wzorców, parametry ATPS i oczekiwane wyniki.

Protocol

1. Charakterystyka systemu fazowego: Określanie progów separacji faz

1. Przygotować roztwory zawierające PEG i DEX w żądanym buforze lub pożywce do hodowli komórkowych, jak pokazano na rysunku 1 (fioletowe kropki) w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml lub 50 ml. W dalszej części PEG i DEX będą odnosić się do 35 kDa PEG i 500 kDa DEX; Jednak stężenia krytyczne będą się zmieniać w zależności od dwóch użytych polimerów. Zapisać masę PEG i DEX w każdym roztworze. Roztwory polimerów o wysokim stężeniu mogą rozpuścić się po kilku godzinach. Wirowanie może być stosowane w przypadku roztworów bez surowicy. W przypadku pożywek zawierających białka lub surowicę, umieść probówki na etapie kołysania, aż oba polimery całkowicie się rozpuszczą. Zanotować masę pożywki użytej do rozpuszczenia polimerów i zanotować początkowe stężenia.
2. Gdy polimery całkowicie się rozpuszczą, roztwory powinny wydawać się mętne. Jest to pierwsza oznaka, że nastąpiła separacja faz. Aby to potwierdzić, pozwól roztworom polimerów spoczywać w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Wirowanie przy 1 000 x g może być wykorzystane do przyspieszenia procesu separacji faz. Gęstsza dolna faza będzie bogata w DEX, a górna faza będzie bogata w PEG.
3. Powoli dodaj dodatkowy bufor lub pożywkę do probówek. Należy stosować małe przyrosty, aby nie przekroczyć punktu separacji faz.
4. Gdy roztwór staje się klarowny i nie rozdziela się fazowo po odwirowaniu, próg separacji faz został osiągnięty. Zapisz ostateczną wagę rury.
5. Korzystając z poprzednio zarejestrowanych mas dla polimerów, wraz z masą końcową po dodaniu pożywki, należy określić % wag./wag. każdego z dwóch polimerów, przy których nie zachodzi już separacja faz
.
6. Wykreśl te wartości jako % wt/wt PEG na osi y i % wt/wt DEX na osi x. Wykres ten, znany jako krzywa binodalna, może być wykorzystany do określenia stężenia progowego dla separacji faz dla różnych stężeń PEG/DEX w określonej pożywce do hodowli komórkowych.

2. Konfiguracja 1: Wzór wykluczenia (format płytki 96-dołkowej)

1. Przygotować oddzielne roztwory 5,0% wag./wt PEG i 12.8% wt/wt DEX w pożywce do hodowli komórkowych. Stosować roztwory ATPS o stężeniu co najmniej dwukrotnie większym niż punkt krytyczny, aby upewnić się, że ATPS pozostaje po tym, jak polimery zrównoważą się względem siebie. Do fazy bogatej w PEG i odwrotnie dochodzi do niewielkiej ilości strumienia DEX, dlatego praca zbyt blisko stężenia krytycznego może spowodować utratę układu fazowego, ponieważ stężenia spadną poniżej punktu krytycznego. Podobnie, przeniesienie szalki do hodowli komórkowej do inkubatora o kontrolowanej wilgotności i temperaturze może zmienić właściwości dwufazowe i sprawić, że oba roztwory będą się mieszać. Uwaga: Niektóre komórki mogą działać lepiej z innymi preparatami ATPS. Dopuszczalne formuły można wybrać na podstawie krzywych obuwęzłowych określonych w części 1.
2. Zbierz komórki, które mają być użyte do tworzenia wzorców wykluczania. Określ całkowitą liczbę/stężenie dostępnych komórek. Opcjonalnie: oznacz komórki za pomocą CellTracker lub innych niecytotoksycznych znaczników do mikroskopii fluorescencyjnej.
3. Osadzać ogniwa i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości 5,0% PEG, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek do wykluczenia. Na przykład jedna studzienka z 96-dołkową płytką wymaga ponownego zawieszenia 37 500 komórek fibroblastów w 200 μl PEG, aby następnego dnia wytworzyć konfluencję. Przeskaluj te liczby odpowiednio do innych typów komórek i rozmiarów substratów hodowlanych.
4. Za pomocą mikropipetora dozować 0,5 μl kropelek DEX na suchy substrat do hodowli komórkowych. Kropelki o większej objętości tworzą większe strefy wykluczenia. Kropelki o wielkości od 0,1 do 1 μl są zalecane do mikromodelowania wykluczającego. Opcjonalnie: kropelki DEX mogą być osadzane z 24-godzinnym wyprzedzeniem i pozostawiane do odwodnienia w temperaturze pokojowej. Może to zapewnić czystsze wzory.
5. Dozuj 200 μl zawiesiny komórek PEG do studzienki, aby przykryć kropelki DEX.
6. Umieścić w nawilżanym inkubatorze na 12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Upewnij się, że naczynie nie jest przechylone podczas przenoszenia i że jest umieszczone na równej półce inkubatora, aby uniknąć zakłócenia wzorów.
7. Usunąć roztwór PEG i przemyć trzykrotnie 200 μl pożywki hodowlanej.
8. Dodać świeżą pożywkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.
9. Okresowo monitoruj kultury, aby obserwować ruch komórek do strefy wykluczenia.

3. Konfiguracja 2: Wzór wyspy (format płytki 96-dołkowej)

1. Przygotować roztwory 5,0% wag./wt PEG i 12.8% wt/wt DEX w pożywce do hodowli komórkowych, jak wyżej.
2. Zbierz komórki, które zostaną użyte do stworzenia wzoru wyspy. Określ całkowitą liczbę/stężenie dostępnych komórek.
3. Osadzaj i ponownie zawieszaj ogniwa w odpowiedniej objętości 12,8% DEX, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do wzoru wyspowego. Stężenia 5 000 komórek/μl lub mniej są zalecane dla silnie przylegających typów komórek. W przypadku komórek, które mają trudności z przyczepieniem się lub komórek, które luźno przylegają, można rozważyć stężenia do 10 000 komórek/μl.
4. Działając szybko, aby uniknąć wysuszenia, odpipetować 0,5 μl kropelek DEX na suchy substrat do hodowli komórkowych, jak opisano powyżej. Nie dopuścić do wyschnięcia kropel. Opcjonalnie: 200 μl roztworu PEG można dodać do studni z wyprzedzeniem. Kropelki DEX mogą być następnie osadzane w roztworze PEG, gdzie opadną na dno i zetkną się z powierzchnią hodowli. Może to prowadzić do powstania czystszych wzorów wysp.
5. Przykryj kropelki DEX 200 μl PEG.
6. Umieścić w nawilżanym inkubatorze na 12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Upewnij się, że naczynie nie jest przechylone podczas przenoszenia i że jest umieszczone na równej półce inkubatora, aby uniknąć zakłócenia wzorów.
7. Usunąć roztwór PEG i przemyć trzykrotnie 200 μl pożywki hodowlanej.
8. Dodać świeżą pożywkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.
9. Okresowo monitoruj kultury, aby obserwować ruch komórek i proliferację na zewnątrz wysp.

4. Konfiguracja 3: Wykluczenie Współkultury (96-dołkowy format płytki)

1. Przygotować roztwory 5,0% wag./wt PEG i 12.8% wt/wt DEX w pożywce do hodowli komórkowych, jak wyżej.
2. Zbierz komórki, które zostaną użyte do wykluczenia i wytworzenia wzoru wyspy. Określ całkowitą liczbę/stężenie komórek dostępnych dla każdego typu komórek. Opcjonalnie: Niektóre pary komórek mogą wykazywać znacznie różne wskaźniki proliferacji. Aby zapobiec przeludnieniu wykluczonych komórek w komórkach o wzorze wyspowym (szczególnie w przypadku długotrwałych hodowli), należy traktować komórki użyte do wykluczenia mitomycyną C przez 2 godziny lub napromieniać je przed pobraniem. Zapobiegnie to rozprzestrzenianiu się. W razie potrzeby można użyć barwników fluorescencyjnych CellTracker do rozróżnienia dwóch populacji komórek.
3. Osadzaj ogniwa i ponownie zawieś je w celu wykluczenia w odpowiedniej objętości 5,0% PEG, aby uzyskać pożądaną liczbę komórek, jak powyżej. Ponownie zawiesić granulkę do wzoru wyspowego w odpowiedniej objętości 12,8% DEX, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek, jak wyżej.
4. Za pomocą mikropipetora dozować 0,5 μl kropelki zawiesiny komórek DEX na suche podłoże do hodowli komórkowych. Nie dopuścić do wyschnięcia kropel.
5. Przykryj kropelki DEX 200 μl zawiesiny ogniw PEG.
6. Umieścić w nawilżanym inkubatorze na 12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Upewnij się, że naczynie nie jest przechylone podczas przenoszenia i że jest umieszczone na równej półce inkubatora, aby uniknąć zakłócenia wzorów.
7. Usunąć roztwór PEG i przemyć trzykrotnie w 200 μl pożywki hodowlanej.
8. Dodać świeżą pożywkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.
9. Monitoruj kokultury, aby obserwować interakcje między populacjami komórek. Opcjonalnie: Kontrole można przygotować, wykonując indywidualne wzorce wykluczania lub wyspowe, przez wspólne hodowle komórek, które nie wchodzą ze sobą w interakcje, lub poprzez blokowanie szlaków zainteresowania w jednej lub obu populacjach komórek przed lub po wzorcu.

Results

Aby wybrać odpowiednią kombinację PEG i DEX do tworzenia wzorców komórkowych, ważne jest określenie krzywej binarnej. Krzywa ta wyznacza punkty, w których może tworzyć się ATPS i może się różnić dla danego zestawu polimerów w zależności od temperatury, pH i zawartości jonów. W przypadku hodowli komórek, które wymagają niestandardowych preparatów pożywki, może być konieczne eksperymentalne wyznaczenie krzywej binodalnej. Osiąga się to poprzez wygenerowanie serii ATPS, które są daleko od binodala i różnią się zawartością P...

Discussion

Metoda mikrowzorcowania komórek ATPS wymaga bardzo niewielkiej wiedzy specjalistycznej poza biegłością w technikach hodowli komórkowych i może być szybko opanowana. Zaletą tego podejścia jest to, że jest niedrogie, szybkie i kompatybilne z różnymi typami komórek i formatami hodowli. Z tych powodów nasz protokół powinien być łatwo przyjęty przez naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi, szczególnie tych, którzy badają proliferację komórek, migrację i chemotaksję oraz wpływ interakcji jukstakrynowych i parakrynnych...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dekstran 500 000 kDa	Pharmacosmos, Dania
Glikol polietylenowy 35 000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia
RPMI	Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia
F12	Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia
Surowica bydlęca	płodu Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia