Badania rozwojowe na myszach są utrudnione przez niedostępność zarodka podczas ciąży. Aby promować długoterminową hodowlę embrionalnego serca w późnych stadiach ciąży, opracowaliśmy protokół, w którym wycięte serce jest hodowane w półstałym, rozcieńczonym Matrigelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowatorska metoda hodowli ex vivo embrionalnego serca myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania rozwojowe na myszach są utrudnione przez niedostępność zarodka podczas ciąży. W związku z tym protokoły izolacji i hodowli poszczególnych narządów będących przedmiotem zainteresowania są niezbędne, aby zapewnić metodę zarówno wizualizacji zmian w rozwoju, jak i umożliwienia nowych strategii leczenia. Aby promować długoterminową hodowlę embrionalnego serca w późnych stadiach ciąży, opracowaliśmy protokół, w którym wycięte serce jest hodowane w półstałym, rozcieńczonym Matrigelu. Podłoże to zapewnia wystarczające podparcie, aby utrzymać trójwymiarową strukturę, ale jest wystarczająco elastyczne, aby umożliwić ciągły skurcz. Krótko mówiąc, serca wycina się z zarodka i umieszcza w mieszaninie zimnego Matrigelu rozcieńczonego 1:1 z pożywką wzrostową. Po zestaleniu się rozcieńczonego Matrigelu do szalki hodowlanej dodaje się pożywkę wzrostową. Serca wycięte dopiero w 16,5 dniu embrionalnym były zdolne do życia przez cztery dni po sekcji. Analiza splotu wieńcowego pokazuje, że metoda ta nie zaburza rozwoju naczyń wieńcowych. W ten sposób przedstawiamy nowatorską metodę długotrwałej hodowli zarodków serca.
Wprowadzenie
W ostatnich latach transgeniczna mysz była dominującym modelowym systemem do badania wad rozwojowych serca. Jednak inne organizmy modelowe, takie jak danio pręgowany, okazały się mieć znaczną przewagę nad myszem. Trzy główne zalety danio pręgowanego to zewnętrzne składanie jaj, co ułatwia dostęp do zarodków; przezroczystość optyczna zarodków, która umożliwia łatwą wizualizację rozwoju serca; oraz łatwość stosowania zabiegów małocząsteczkowych w celu modulacji rozwoju zarodka1. W ten sposób opracowanie techniki hodowli, która pozwoliłaby na wzrost ex utero narządu embrionalnego, ominęłoby, przynajmniej częściowo, ograniczenia, z którymi obecnie borykają się naukowcy badający procesy rozwojowe u myszy transgenicznych.
Systemy hodowli serca ex vivo zostały opracowane zarówno na zarodkach piskląt, jak i myszy, które umożliwiają leczenie małymi cząsteczkami i analizę, jak różne regiony serca komunikują się2-6. W przypadku hodowli całego serca myszy, serca pobrane z zarodków w wieku do 12,5 wieku zarodkowego (E) można umieścić w pożywce hodowlanej z kołysaniem lub bez kołysania2,3,5. Stosując tę technikę, embrionalne serca zostały z powodzeniem inkubowane do poziomu równoważnego E13,5, a serca hodowane z kołysaniem były utrzymywane przez trzy dni (począwszy od E10,5)3. Jednak żadne badania nie wykazały udanej hodowli serc ze starszych zarodków. Podobnie, eksperymenty ratunkowe ograniczały się do globalnego stosowania środka terapeutycznego w pożywcehodowlanej 2.
System hodowli kropek, w którym serca są wycinane, osadzane i dzielone za pomocą wibratomu, został również wykorzystany zarówno dla młodszych serc, takich jak serca myszy E12.5 i Hamburger-Hamilton stadium 36 (około E16 u myszy) serca piskląt2,4,6, jak i starszych serc, takich jak serca myszy po urodzeniu i dorosłych oraz serca dorosłych ludzi7,8. Podczas gdy analizy embrionalne zwykle wykorzystywały odcinki o grubości 150 μm2,4, grubość przekroju może wynosić nawet 500 μm bez dowodów na niedobór tlenu8. Te kultury plastrów były utrzymywane w kulturze przez dwa miesiące, przy czym większość plastrów zachowuje kurczliwość przez cały ten okres9. W porównaniu z badaniami na izolowanych kardiomiocytach, te kultury warstwowe umożliwiają kohodowlę kardiomiocytów z sąsiednimi typami komórek i stanowią użyteczną metodę analizy ex vivo. Jednak kultury te wymagają bardziej skomplikowanej konfiguracji niż po prostu umieszczenie serca w pożywce hodowlanej (np. osadzenie żywego serca w celu sekcji na wibratomie), a wszelka analiza jest oczywiście ograniczona do części serca w sekcji.
Biorąc pod uwagę opisane powyżej ograniczenia dotyczące hodowli embrionalnych serc myszy oraz bogactwo transgenicznych myszy dostępnych do badań, opracowaliśmy system hodowli serca myszy ex vivo, podobny do systemu hodowli płuc ex vivo opracowanego przez Weavera, et al.10 Nasz system hodowli pozwala na długotrwałą hodowlę i wizualizację przebudowy krążenia wieńcowego w całych zarodkach myszy sercowych. Ponadto stosowanie Matrigelu pozwala na utrzymanie koralików na miejscu w pobliżu serca, zapewniając w ten sposób miejscowe leczenie środkami terapeutycznymi. Eksperymenty te można przeprowadzać w różnych punktach czasowych rozwoju, aby porównać wpływ danego leczenia na proces taki jak tworzenie się tętnic wieńcowych. Ponieważ małe cząsteczki mogą dyfundować przez Matrigel, ten system hodowli może być również używany do hodowli wypreparowanych regionów serca blisko siebie w celu określenia, czy określone kontakty komórka-komórka są niezbędne do określonych procesów rozwojowych, czy też konieczna jest sygnalizacja parakrynna z jednego regionu do drugiego.
Ten system hodowli jest stosunkowo prosty i, w przeciwieństwie do systemu hodowli plastrowej, wykorzystuje podstawowe odczynniki i zestawy do hodowli, które są łatwo dostępne w większości laboratoriów. Krótko mówiąc, wycięte serca zarodkowe są hodowane w rozcieńczonym Matrigelu, który zapewnia półstałe podparcie. To wsparcie jest wystarczające do utrzymania trójwymiarowej morfologii serca, jednocześnie umożliwiając mu kurczenie się. Korzystając z tego systemu, całe serca ze starszych zarodków myszy (E14.5-E16.5) mogą być utrzymywane w hodowli przez okres do czterech dni. Cały splot wieńcowy jest utrzymywany, w przeciwieństwie do kultur warstwowych, więc wszelkie sygnały sygnałowe, które występują z różnych regionów serca, pozostają obecne. Co więcej, barwniki fluorescencyjne z żywych komórek mogą przenikać przez Matrigel, aby umożliwić wizualizację żywego serca, a kulki sprzężone z białkiem można umieścić w pobliżu serca, aby zapewnić zlokalizowane źródło sygnału. Razem te korzyści sprawiają, że technika ta jest idealną metodą do badania procesów rozwojowych w embrionalnym sercu myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wycinanie embrionalnych serc
- Poddaj eutanazji mysz w ciąży w wybranym dniu embrionalnym przy użyciu zatwierdzonej techniki eutanazji. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill.
- Obficie spryskaj samicę 70% etanolem przed preparacją. Otwórz jamę brzuszną samicy, aby pobrać i wyciąć róg macicy.
- Umieść róg macicy na szalce Petriego zawierającej zimną sól fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS) i spłucz w razie potrzeby. Rozetnij róg macicy przez linię środkową, aby odsłonić przyczepione woreczki embrionalne.
- Rozetnij worek embrionalny i odzyskaj zarodek. Umieść zarodek na drugiej szalce Petriego z zimnym PBS. Umieść szalkę Petriego z rogiem macicy z lodem.
- Odetnij głowę zarodka, aby poprawić dostęp do ściany klatki piersiowej. Jeśli konieczne jest genotypowanie, usuń ogon i zachowaj go w probówce Eppendorfa umieszczonej na lodzie.
- Trzymając zarodek na plecach, rozetnij ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić serce i płuca. W zależności od etapu, ściana klatki piersiowej może być przezroczysta.
- Ostrożnie podnieś serce za pomocą kleszczy i przetnij naczynia poniżej. Następnie przetnij nad wielkimi naczyniami, aby uwolnić serce. W razie potrzeby usuń obce tkanki.
- Umieść serce w jednym dołku 24-dołkowego naczynia wypełnionego zimnym PBS i umieść naczynie na lodzie.
- Powtarzaj poprzednie kroki, aż serca zostaną wycięte ze wszystkich zarodków.
2. Konfiguracja kultury
- W kapturze laminarnym połączyć zimny Matrigel i żądaną pożywkę hodowlaną (np. 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM)) w stosunku 1:1. Nie podgrzewaj wstępnie pożywki hodowlanej.
- Trzymając rozcieńczony Matrigel na lodzie, odpipetować 500-1 000 μl rozcieńczonego roztworu do dołka w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym, które również utrzymuje się na lodzie.
- W kapturze ostrożnie podnieś i umieść wycięte serce w studzience naczynia hodowlanego zawierającego Matrigel, trzymając naczynie hodowlane na lodzie.
- Jeśli orientacja osadzonego serca ma kluczowe znaczenie: Obficie spryskaj odwrócony mikroskop i otaczającą go przestrzeń 70% etanolem. W kapturze umieść wycięte serce w studzience na płytce hodowlanej zawierającej Matrigel, będąc jeszcze na lodzie. Następnie umieść płytkę pod mikroskopem i szybko ustaw wycięte serce, gdy Matrigel zacznie krzepnąć.
- Umieścić naczynie hodowlane w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C (5% CO2 ) i pozostawić Matrigel do zestalenia się na około 30 minut.
- Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki zawierającej serce.
- Serca mogą pozostać w kulturze przez co najmniej cztery dni. Zaleca się zmianę pożywki hodowlanej co dwa dni.
3. Fiksacja i wizualizacja
- W razie potrzeby dodaj fluorescencyjny barwnik z żywych komórek (np. Syto-16), aby uwidocznić żywe serce. Fotografia będzie ograniczona do tej strony serca, która jest widoczna na podstawie pozycji, w której zostało osadzone.
- Jeśli będą wykonywane analizy po hodowli (np. obrazowanie całego wierzchowca lub sekcjonowanie), należy usunąć pożywkę hodowlaną i zastąpić ją zimnym 4% formaldehydem. Umieść danie na lodzie na 30 minut.
- Po tym, jak zimny formaldehyd i lód sprzyjają rozpuszczeniu Matrigel, zastąp utrwalacz (i Matrigel) świeżym formaldehydem i utrwal serca przez noc w temperaturze 4 °C.
- Umyć serca buforem (np. PBS lub Tris) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszych analiz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dzięki zastosowaniu tej techniki serce zachowuje swoją trójwymiarową morfologię i pozostaje żywe, o czym świadczą nieprzerwane skurcze (Movie 1). Skurcze te są konsekwentnie bardziej wyraźne w przedsionkach niż w komorach. Po hodowli serca można utrwalić i poddać obróbce w celu przeprowadzenia immunohistochemii lub histologii, aby zbadać ekspresję konkretnych markerów lub struktur. Figure 1A przedstawia podstawę komór i dużych tętnic embrionalnego serca myszy, które było hodowane przez 2...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecny system hodowli stwarza znaczące korzyści w badaniach nad embrionalnym sercem myszy. Ten system hodowli zachowuje kurczliwość mięśnia sercowego i splotu wieńcowego, z ograniczonymi objawami martwicy, nawet po czterech dniach w hodowli. Co więcej, półstała matryca zapewnia wystarczające wsparcie, aby utrzymać trójwymiarową morfologię rozwijającego się serca, jednocześnie umożliwiając elastyczność w kurczeniu się, a także utrzymywanie powlekanych kulek na miejscu podczas hodowli. Pomimo tego wsparcia, matryca ta jest...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Andrei Portbury za krytyczne przeczytanie manuskryptu oraz NIH (grant # R01HL061656) za wsparcie finansowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| myszy w ciąży | Do przeprowadzenia w fazie embrionalnej będącej przedmiotem zainteresowania | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Używany zgodnie z zaleceniami w 13 |
| 24-dołkowych płytkach | hodowlanych Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Mikroskop stereoskopowy | Nikon | SMZ645 | |
| Inkubator kultur komórkowych | Thermo | 3110 |
Bibliografia
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
