Artykuł metodologiczny

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50561

⸱

6 stycznia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, 3Department of Otolaryngology, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Oceniane na syngenetycznych immunokompetentnych gospodarzach, szczepionka z komórek dendrytycznych (DC) na bazie nowotworowych komórek macierzystych (CSC) wykazała znacznie wyższą odporność przeciwnowotworową niż tradycyjne szczepionki DC pulsujące z heterogenicznymi komórkami nowotworowymi.

Streszczenie

Zidentyfikowaliśmy populacje wzbogacone w rakowe komórki macierzyste (CSC) od myszy syngenecznej czerniaka D5 do myszy C57BL/6 i raka płaskonabłonkowego SCC7 syngenicznego do myszy C3H, używając ALDEFLUOR/ALDH jako markera, i przetestowaliśmy ich immunogenność przy użyciu lizatu komórkowego jako źródła antygenów do pulsacyjnych komórek dendrytycznych (DC). DC pulsowane lizatami CSCo wysokim poziomie ALDH indukowały znacznie wyższą ochronną odporność przeciwnowotworową niż DC pulsowane lizatami niesortowanych całych komórek nowotworowych w obu modelach oraz odpowiednio w ustawieniu przerzutów do płuc i ustawieniu wzrostu guza SC. Zjawisko to było spowodowane humoralną, a także komórkową odpowiedzią anty-CSC wywołaną szczepionką CSC. W szczególności splenocyty wyizolowane od gospodarza poddanego szczepionce CSC-DC wytwarzały znacznie większą ilość IFNγ i GM-CSF niż splenocyty wyizolowane od gospodarza poddanego niesortowanej szczepionce pulsacyjnej DC z lizatem komórek nowotworowych. Wyniki te wspierają wysiłki zmierzające do opracowania autologicznej szczepionki terapeutycznej opartej na CSC do użytku klinicznego w warunkach adiuwantowych.

Wprowadzenie

Nowotworowe komórki macierzyste są stosunkowo odporne na konwencjonalną chemioterapię i radioterapię1,2. Z drugiej strony, ta populacja komórek może być komórkami odpowiedzialnymi za nawrót i progresję nowotworów po tradycyjnych terapiach przeciwnowotworowych1-4. Ze względu na brak ekspresji zróżnicowanych antygenów nowotworowych na nowotworowych komórkach macierzystych, rakowe komórki macierzyste mogą unikać obecnych interwencji immunologicznych terapii raka, które są w większości zaprojektowane tak, aby celować w antygeny na zróżnicowane komórki nowotworowe. W związku z tym opracowanie nowych strategii ukierunkowanych na nowotworowe komórki macierzyste i ich niszczących może przynieść nadzieję na zwiększenie skuteczności terapeutycznej obecnego leczenia raka. W tym celu wyizolowaliśmy populacje wzbogacone w rakowe komórki macierzyste (CSC) z dwóch guzów zwierzęcych (czerniak D5 i rak płaskonabłonkowy SCC7) i wykorzystaliśmy je jako źródło antygenu do pulsacji komórek prezentujących antygen (komórki dendrytyczne, DC) w celu przygotowania szczepionki CSC-TPDC. Następnie oceniliśmy odporność przeciwnowotworową indukowaną przez szczepionkę CSC-TPDC u syngenicznych immunokompetentnych gospodarzy, myszy B6 i myszy C3H. Skuteczność przeciwnowotworową indukowaną przez CSC-TPDC porównano z tradycyjną szczepionką DC pulsacyjną z lizatem z niesortowanych heterogennych komórek nowotworowych (H-TPDC), która była wcześniej stosowana przez naszą grupę5,6, a także przez innych badaczy7 zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych.

Protokół

1. Barwienie ALDEFLUOR

  1. Przygotowanie próbki komórkowej: Przygotować zawiesinę komórek nowotworowych z pojedynczych komórek, albo z hodowanych komórek nowotworowych, albo ze świeżo pobranych próbek guza. Policz komórki i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 1 x 106 komórek/ml w buforze do oznaczania ALDEFLUOR.
  2. Oznacz cztery probówki z polistyrenu o wymiarach 12 mm x 75 mm jako probówki kontrolne w następujący sposób: #1: Niebarwiony, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR plus DEAB i #4: 7AAD.
  3. W przypadku tych probówek kontrolnych umieść 1 ml zawiesiny komórek w #1 i #4, ale 2 ml w probówce #2. Dodaj 5 μl DEAB (inhibitora ALDH) do probówki #3 i trzymaj na lodzie. Następnie dodać 10 μl aktywowanego substratu ALDEFLUOR do probówki #2, wymieszać i natychmiast przenieść 1 ml mieszaniny do probówki #3.
  4. W tym samym czasie dodać 2 μl aktywowanego substratu ALDEFLUOR na milion komórek do pozostałych komórek (probówek z próbkami) również w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w buforze testowym ALDEFLUOR.
  5. Inkubować zarówno 4 probówki kontrolne, jak i probówki z próbkami przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  6. Po inkubacji dodać 5 μl 7AAD do probówki kontrolnej #4 i 1 μl 7AAD 1 x 106 komórek do probówki z próbką. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Odwirować wszystkie probówki przez 5 minut przy 250 x g i usunąć supernatant.
  8. Ponownie zawiesić komórki w buforze testowym ALDEFLUOR.
  9. Wykonaj sortowanie oparte na cytometrii przepływowej.
  10. Ustawić bramki sortujące za pomocą komórek barwionych ALDEFLUOREM potraktowanych DEAB jako kontrola ujemna i komórek barwionych jodkiem propidyny (PI) 7AAD w celu kontroli żywotności. Na podstawie tych kontroli ustalono bramkę w celu rozróżnienia komórek ALDEFLUOR+/ALDHhigh, D5 i SCC7. Bramki te zostaną następnie wykorzystane do posortowania wszystkich przygotowanych powyżej komórek próbek dla komórek ALDEFLUOR+/ALDHo wysokiej zawartości D5 i SCC7.

2. Przygotowanie szczepionki przeciwko lizatom i pulsacyjnym komórkom dendrytycznym (CSC-TPDC) przeciwko nowotworowym komórkom macierzystym

  1. Eutanazja myszy (odpowiednio syngeniczne B6 i C3H) za pomocą CO2 i wyizolowanie kości udowych i piszczelowych.
  2. Umieść kości w 75% etanolu na 1 minutę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj kości za pomocą HBSS.
  3. Odetnij głowę od kości i użyj igły 21 G i strzykawki o pojemności 10 ml, aby wepchnąć komórki do naczynia.
  4. Odessać i przedmuchać komórki za pomocą strzykawki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
  5. Po odwirowaniu z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut, odrzucić supernatant. Następnie dodać 5 ml buforu do lizy RBC, aby lizować RBC przez 1 minutę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  6. Policz liczbę komórek i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 1 miliona komórek/ml w kompletnym pożywce (CM) zawierającej 10 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.
  7. Hoduj komórki i kompensuj CM oraz IL-4 i GM-CSF 3 dni później.
  8. W 5dniu należy zebrać niedojrzałe komórki dendrytyczne (DC) i przygotować pożywkę izolacyjną DC zawierającą 4,2 ml roztworu C oraz 1 ml pożywki o gradiencie gęstości OptiPrep.
  9. Zawiesić granulki komórek w 5 ml CM. Powoli dodawać zawiesinę komórek do podłoża izolacyjnego. Wirować z prędkością 2 000 obr./min w temperaturze pokojowej.
  10. Zbierz DC między CM a medium izolacyjnym. Policz liczbę komórek i dostosuj zawiesinę komórek do stężenia 1 miliona komórek/ml w pożywce hodowlanej zawierającej 10 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.
  11. Przygotować lizaty nowotworowe, zawieszając wysoko lub niesortowane komórki D5 lub SCC7 owysokiej zawartości ALDH w pożywce hodowlanej i poddając szybkiej ekspozycji na zamrażanie i rozmrażanie czterokrotnie, a następnie wirowanie przy ∼100 x g przez 5 minut w celu zebrania części błonowej lizatów.
  12. Aby przygotować CSC-TPDC, pulsuj DC lizatem autologicznych komóreko wysokim poziomie ALDH. Aby przygotować H-TPDC, pulsuj DC niesortowanym heterogennym lizatem komórek nowotworowych. Stosunek DC do lizatu komórek nowotworowych jest taki sam.

3. Szczepienie i ocena skuteczności

  1. Zaszczep normalne myszy B6 odpowiednio 2,500 komórek nowotworowych D5 CSC-TPDC lub D5 H-TPDC podskórnie (s.c.). Zaszczepić normalne zwierzęta C3H s.c. odpowiednio 5,000 komórek nowotworowych SCC7 CSC-TPDC lub SCC7 H-TPDC.
  2. Po szczepieniu należy zmobilizować myszy B6 heterogenicznymi komórkami nowotworowymi D5 dożylnie. Myszy należy poddać eutanazji za pomocą CO2 20 dni później. Zbierz płuca i policz przerzuty do płuc.
  3. W modelu SCC7 należy rzucić wyzwanie myszom C3H z niesortowanymi komórkami nowotworowymi SCC7 s.c po przeciwnej stronie szczepionki DC. Monitoruj wielkość guza.
  4. Pod koniec eksperymentów należy poddać eutanazji myszy B6 i C3H za pomocą CO2 . W 34 dniu po pierwszej szczepionce należy poddać myszy eutanazji za pomocą CO2 i jednocześnie pobrać śledziony z każdej grupy za pomocą procedury aseptycznej.
  5. Aktywuj limfocyty T i/lub B śledziony za pomocą unieruchomionych mAb anty-CD3 plus anty-CD28 w CM zawierającym wodobrzusze mAb hrIL-2 lub LPS plus anty-CD40 (FGK45).
  6. Po aktywacji zebrać supernatanty i użyć do testu ELISA.
  7. W przypadku testu ELISA należy pokryć płytki przeciwciałami przeciwko IFNγ, GM-CSF i IgG w temperaturze 4 °C O/N.
  8. Po zastosowaniu buforu blokującego dodać próbki i wzorce i inkubować w temperaturze pokojowej.
  9. Umyć płytkę i dodać przeciwciało wykrywające HRP oraz substrat TMB do inkubacji.
  10. Zmierzyć absorbancję na czytniku płytek ELISA przy długości fali 450 nm w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji.

Wyniki

ALDEFLUOR/ALDH był wykorzystywany jako pojedynczy marker do izolowania komórek macierzystych w wielu nowotworach złośliwych8-11. Wykorzystując ALDEFLUOR jako marker, zidentyfikowaliśmy populacje wzbogacone w nowotworowe komórki macierzyste w dwóch modelach guzów: D5 i SCC7. Wykryliśmy komórki ALDEFLUOR+ w mysim czerniaku B16-D5 oraz w raku płaskonabłonkowym SCC7. Stwierdzono, że komórki ALDEFLUOR+ stanowią odpowiednio około 0,5% i 5,2% w hodowlach linii komórkowych nowotworów D5 i SCC7 (Rysunek 1). W celu potwierdzenia obecności komórek ALDEFLUOR+ przeanalizowano świeżo pobrane komórki z wytworzonych guzów. Jak pokazano również na Rysunku 1, komórki ALDEFLUOR+ stanowiły odpowiednio 2,5% i 4,2% w guzach D5 i SCC7 wytworzonych in vivo. Zdolność do tworzenia guzów oraz potencjał do samoodnawiania tych posortowanych populacji D5 i SCC7 ALDEFLUOR+/ALDHhigh oceniono odpowiednio w syngenicznych gospodarzach immunocompetentnych: myszach C57BL/6 oraz C3H8.

W badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych wykorzystaliśmy lizat nieposortowanych heterogenicznych komórek nowotworowych do pulsowania komórek dendrytycznych (H-TPDC)5,6. Aby zbadać immunogenność CSC, wyizolowaliśmy CSC ALDHhigh i pulsowaliśmy komórki dendrytyczne lizatem CSC w celu wygenerowania CSC-TPDC (Rysunek 2), natomiast H-TPDC wykorzystaliśmy jako konwencjonalną kontrolną szczepionkę przeciwnowotworową, aby sprawdzić, czy CSC-TPDC wykazuje korzystny wpływ na hamowanie wzrostu guza.

Oceniliśmy immunogenność CSC, badając ochronną odporność przeciwnowotworową indukowaną przez CSC-TPDC. W modelu D5 naiwne myszy immunokompetentne szczepiono s.c CSC-TPDC lub H-TPDC (przy tym samym stosunku lizatu do DC). Grupy kontrolne otrzymały sól fizjologiczną (PBS). Tydzień po ostatnim szczepieniu myszy poddano wyzwaniu w postaci dożylnego (i.v.) podania nieposortowanych komórek nowotworowych D5, a po 3 tygodniach pobrano płuca w celu policzenia przerzutów płucnych. Jak pokazano w Table 1, myszy leczone H-TPDC rozwinęły mniej przerzutów płucnych w porównaniu z grupą PBS. Co istotne, myszy leczone CSC-TPDC miały znacznie mniej przerzutów płucnych niż grupa szczepiona H-TPDC w obu przeprowadzonych eksperymentach. W modelu SCC7 normalne zwierzęta C3H szczepiono s.c odpowiednio SCC7 CSC-TPDC lub H-TPDC w prawy bok, a następnie poddano wyzwaniu poprzez podskórne (s.c) podanie nieposortowanych komórek nowotworowych SCC7 w lewy bok. W porównaniu z grupą PBS, H-TPDC wywołało umiarkowaną odporność przeciwnowotworową przeciwko wzrostowi guza. Jednakże w myszach leczonych CSC-TPDC odnotowano istotne zahamowanie wzrostu guza w porównaniu zarówno z grupą kontrolną, jak i grupą H-TPDC (p<0.05, Figure 3). Wyniki te wskazują, że CSC mogą być wykorzystane jako bardziej efektywne źródło antygenów do ładowania DC niż tradycyjne nieposortowane komórki nowotworowe w indukowaniu odporności ochronnej przeciwko wyzwaniu komórkami nowotworowymi.

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw obserwowanego indukowanego przez CSC ochronnego odporności przeciwnowotworowej, po zakończeniu eksperymentów pobrano śledziony od zwierząt poddanych szczepieniom DC. Komórki śledziony aktywowano następnie za pomocą anty-CD3/CD28/IL-2 lub anty-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anty-CD40. Następnie zebrano nadsączki hodowlane, aby wykryć ekspresję cytokin i przeciwciał. Odnotowano znacznie wyższą produkcję IFNγ i GM-CSF przez komórki śledziony pochodzące od zwierząt szczepionych D5 CSC-TPDC lub SCC7 CSC-TPDC (Rysunek 4). Co więcej, w przypadku komórek śledziony aktywowanych LPS/anty-CD40 pobranych od zwierząt szczepionych D5 CSC-TPDC lub SCC7 CSC-TPDC, stwierdzono istotnie (p<0,05) wyższą produkcję IgG w porównaniu z D5 H-TPDC lub SCC7 H-TPDC. Wykazano, że przeciwciała te wiążą się odpowiednio z CSC D5 i SCC7, a takie wiązanie może prowadzić do lizy CSC w obecności dopełniacza8.

Wykres cytometrii przepływowej sortowania komórek, hodowane/świeże D5 SCC7 z/bez DEAB, pokazuje populację komórek.
Rysunek 1. Populacje ALDHFLUOR+/ALDHhigh wykryto zarówno w hodowanych, jak i świeżo pobranych mysich czerniakach D5 oraz guzach плоскоściennych SCC7. Komórki nowotworowe traktowane 50 mmol/L DEAB, specyficznego inhibitora ALDH, posłużyły jako kontrola negatywna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Schemat sortowania komórek nowotworowych myszy i pulsowania komórek dendrytycznych w badaniach nad rakiem ALDH\(^\text{high}\).
Rycina 2. Generowanie szczepionek przeciwko komórkom macierzystym nowotworu opartych na komórkach dendrytycznych. W celu przygotowania CSC-TPDC i H-TPDC, komórki dendrytyczne pochodzące z szpiku kostnego zostały poddane pulsowaniu odpowiednio lizatami komórek ALDHhigh lub nieposortowanych komórek nowotworowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Wykres porównania wielkości guza; efekty leczenia PBS, H-TPDC, CSC-TPDC; istotność statystyczna.
Rysunek 3. Szczepionka z komórek dendrytycznych pulsowanych lizatem CSC (CSC-TPDC) może indukować skuteczniejszą ochronną odporność przeciwnowotworową w modelu guza SCC7 wszczepionego s.c. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Analiza produkcji cytokin w populacjach TPDC; wykresy słupkowe poziomów IFN-γ i GM-CSF w zależności od metody aktywacji.
Rycina 4. Silniejsze systemowe odpowiedzi komórkowe u gospodarza immunokompetentnego szczepionego CSC-TPDC. Splenocyty pobrano od zwierząt poddanych szczepieniu H-TPDC lub CSC-TPDC i aktywowano zgodnie z opisem. Następnie zebrano nadsączki z kultur w celu wykrycia cytokin za pomocą testu ELISA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Gospodarze z obniżoną odpornością, tacy jak myszy SCID, wykluczają ocenę immunologiczną CSC z powodu braku odporności adaptacyjnej w obrębie gospodarzy. W tym badaniu oceniliśmy immunogenność CSC u immunokompetentnych gospodarzy, którzy mogą bardziej naśladować warunki pacjenta. Wzbogacone CSC są immunogenne i mogą indukować skuteczniejszą odporność ochronną nowotworu, gdy ich lizaty są ładowane do DC jako szczepionka w porównaniu z niewybranymi DC pulsacyjnymi lizatami komórek nowotworowych. Mechanistycznie ochrona została zapewniona przez selektywną indukcję przeciwciał reaktywnych CSC i limfocytów T8 , a także produkcję cytokin typu 1, np. IFNγ i GM-CSF.

Większość obecnych immunoterapii, w tym szczepionki oparte na komórkach dendrytycznych i adoptywny transfer limfocytów T, jest ukierunkowana na antygeny zróżnicowane pod kątem nowotworu. CSC, które mogą nie wyrażać tych zróżnicowanych antygenów, mogą zatem uniknąć tego celowania immunologicznego. W przeciwieństwie do tego, szczepionka CSC zaprojektowana specjalnie do celowania w nowotworowe komórki macierzyste może zniszczyć tę specjalną populację komórek nowotworowych, a tym samym poprawić skuteczność terapeutyczną szczepionki poprzez zapobieganie nawrotom guza i przerzutom.

Zarówno w hodowanych komórkach nowotworowych, jak i świeżo pobranych guzach, zidentyfikowaliśmy populację wzbogaconą w CSC za pomocą cytometrii przepływowej opartej na wysokiej aktywności dehydrogenazy aldehydowej. Takie komórkio wysokim poziomie ALDH można wyizolować przez sortowanie przepływowe, aby wykorzystać je jako źródło antygenu do impulsowania prądem stałym w celu wytworzenia CSC-TPDC. Porównanie przy użyciukomórek o wysokim poziomie ALDH wyizolowanych z hodowanych komórek nowotworowych w porównaniu ze świeżo pobranymi nowotworami nie wykazało istotnej różnicy pod względem indukcji odporności anty-CSC8. Wyniki te ujawniły potencjał wykorzystania CSC wyizolowanych z hodowanych komórek nowotworowych lub ze świeżo pobranych guzów do zastosowań klinicznych.

Aby szczepionka była istotna klinicznie, musi zostać przebadana w warunkach terapeutycznych. Eksperymenty te są obecnie przeprowadzane w naszym laboratorium.

Oświadczenia

Firma STEMCELL Technologies wsparła opłaty za publikacje w otwartym dostępie.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez The Will and Jeanne Caldwell Endowed Research Fund of the University of Michigan Comprehensive Cancer Center, a częściowo przez CA82529 grantowe NIH i Fundację Gillson Longenbaugh.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ALDHEFLOUR KITStemcell Technologies1700
Mysz IL-4Pepro Tech214-14
Mysz GM-CSFPepro Tech315-03
Mysz GM-CSF ELISA KITBD Biosciences555167
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaAldrich D1556
BD OptEIA TMB Substrated Reagent ZestawBD Biosciences555214
Sprzęt
BD FACS Aria Cell SorterBD Biosciences336834
KcjuniorBio-Tek Instruments176058

Bibliografia

  1. Shafee, N., Smith, C. R., et al. Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors. Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).
  2. Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells. Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).
  3. Dallas, N. A., Xia, L., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).
  4. Yamauchi, K., Yang, M., et al. Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy. Cancer Res. 68, 516-520 (2008).
  5. Chang, A. E., Redman, B. G., et al. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer. Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).
  6. Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines. Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).
  7. Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy. Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).
  8. Ning, N., Pan, Q., et al. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).
  9. Ginestier, C., Liu, S., et al. CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).
  10. Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer. Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).
  11. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza ALDEFLUORdehydrogenaza aldehydowaizolacja kom rek dendrytycznychprzygotowanie lizatu guzacytometria przep ywowaanaliza ELISAochronna odporno przeciwnowotworowaprodukcja cytokin

Powiązane artykuły