Artykuł metodologiczny

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

DOI:

10.3791/50772

⸱

23 września 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen

.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody szybkiego unieruchamiania powierzchni małych cząsteczek bioaktywnych z kontrolą orientacji i gęstości unieruchomienia są wysoce pożądane dla zastosowań biosensorów i mikroukładów. W tym badaniu wykorzystujemy wysoce wydajną kowalencyjną bioortogonalną [4 + 2] reakcję cykloaddycji między transcyklooktenem (TCO) a 1,2,4,5-tetrazyną (Tz), aby umożliwić mikroprzepływową immobilizację cząsteczek derywatyzowanych TCO / Tz. Monitorujemy proces w czasie rzeczywistym w warunkach ciągłego przepływu za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Aby umożliwić odwracalne unieruchomienie i rozszerzyć zakres eksperymentalny powierzchni czujnika, łączymy niekowalencyjny składnik wychwytywania antygenu-przeciwciała z reakcją cykloaddycji. Dzięki naprzemiennemu prezentowaniu ugrupowań TCO lub Tz na powierzchni czujnika, możliwe jest teraz wiele procesów wychwytywania-cykloaddycji na jednej powierzchni czujnika w celu montażu na chipie i badań interakcji różnych struktur wieloskładnikowych. Ilustrujemy tę metodę dwoma różnymi eksperymentami unieruchomienia na chipie biosensora; mała cząsteczka AP1497, która wiąże białko 12 wiążące FK506 (FKBP12); i ta sama mała cząsteczka jako część unieruchomionej i funkcjonalizowanej in situ nanocząstki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywne reakcje koniugacji są cennymi narzędziami do łączenia bioaktywnych cząsteczek z powierzchniami dla różnych zastosowań biotechnologicznych. Ostatnio bardzo szybka bioortogonalna [4+2] reakcja cykloaddycji między transcyklooktenem (TCO) a 1,2,4,5-tetrazyną (Tz) została wykorzystana do znakowania powierzchni komórek, struktur subkomórkowych, przeciwciał i nanocząstek. 1-7 Tutaj używamy reakcji cykloaddycji [4+2] w połączeniu z wychwytywaniem antygenu/przeciwciała (GST/anty-GST) do odwracalnej syntezy na chipie struktur wieloskładnikowych do analizy interakcji powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) i monitorujemy proces w czasie rzeczywistym (Rysunek 1). 8,9 Warto zauważyć, że strategia wychwytywania-cykloaddycji umożliwia regenerację powierzchni przy użyciu ustalonego protokołu. 8 W związku z tym możliwy jest teraz montaż stabilnych powierzchni czujników z kontrolą nad orientacją i gęstością ligandów dla wielu nowych formatów testów. Korzystając z tej strategii, demonstrujemy immobilizację małych cząsteczek derywatyzowanych TCO/Tz, i charakteryzujemy tempo cykloaddycji w różnych warunkach buforowych. Wybraliśmy dobrze znaną interakcję między FKBP12 a cząsteczką AP1497, która wiąże FKBP1210-12 jako przykład, aby sprawdzić, czy strategia wychwytywania-cykloaddycji zachowuje zdolność małej cząsteczki do interakcji z celem, gdy jest bezpośrednio przyłączona do unieruchomionych antygenów GST lub do unieruchomionych nanocząstek (NP).

Ta metoda oferuje kilka korzyści. Po pierwsze, możliwe jest odwracalne unieruchomienie małych cząsteczek na chipach czujników. Po drugie, unieruchomienie małych cząsteczek TCO/Tz umożliwia również badania interakcji bez znaczników, które odwracają orientację kanonicznych badań SPR i mogą dostarczyć uzupełniającego spojrzenia na interakcję wiążącą. Po trzecie, metoda ta umożliwia syntezę mikroprzepływową docelowych nanocząstek i natychmiastową ocenę ich właściwości wiązania. Daje to nadzieję na poprawę efektywności oceny lub badań przesiewowych docelowych nanocząstek, a także zmniejszenie wymaganych ilości nanocząstek. 13-15 Po czwarte, podejście to może mierzyć kinetykę reakcji bioortogonalnych reakcji cykloaddycji w czasie rzeczywistym przy ciągłym przepływie. Wreszcie, chemia unieruchomienia TCO/Tz jest silna w obecności surowicy. Podsumowując, przewidujemy, że to wszechstronne podejście znacznie ułatwi budowę stabilnych powierzchni czujników dla szerokiej gamy badań mikroprzepływowych mających znaczenie dla zastosowań komórkowych in vitro i in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie koniugatów GST i nanocząstek (NP)

  1. Przygotowanie GST-TCO:
    1. Dodać 8 μl roztworu TCO-NHS (50 mM w DMSO) do 100 μl GST (1 mg/ml w PBS) i wstrząsać mieszaniną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Usuń nadmiar odczynnika za pomocą wirowej kolumny odsalającej Zeba. Odzyskany filtrat zawierający koniugat GST-TCO jest przechowywany w temperaturze 4 °C przed użyciem.
  2. Przygotowanie GST-Tz:
    1. Dodać 6 μl roztworu Tz-NHS (25 mM w DMF) do 75 μl GST (1 mg/ml w PBS) i wstrząsać mieszaniną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną 25 μl PBS i oczyścić za pomocą wirowej kolumny odsalającej. Przesącz zawierający koniugat GST-Tz jest przechowywany w temperaturze 4 °C przed użyciem.
    nuta: Analizy masy (MALDI-TOF) wykazały, że średnio ~10 cząsteczek Tz lub TCO było sprzężonych z GST.
  3. Przygotowanie NP-TCO:
    1. Dodać 100 μl roztworu TCO-NHS (50 mM w DMSO) do 150 μl aminowanych nanocząstek (NP-NH2, 8,7 mg Fe/ml w PBS, rdzeń żelazny 3 nm ~ 8 000 Fe/NP) i wstrząsać mieszaniną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Usunąć nadmiar odczynnika przez filtrację żelową za pomocą kolumny NAP-10 eluowanej buforem PBS. Zbierz kolorową opaskę zawierającą produkt NP-TCO.
    3. Zagęścić filtrat do końcowej objętości ~150 μl za pomocą filtra odśrodkowego (100 k MWCO).
    4. Dodać 50 μl bezwodnika bursztynowego (0,1 M w DMSO) do roztworu NP-TCO i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (bezwodnik reaguje z pozostałymi aminami, tworząc końcowe kwasy karboksylowe. Zapobiega to niespecyficznym interakcjom z powierzchnią dekstranu).
    5. Oczyść produkt NP-TCO za pomocą kolumny NAP-10 eluującej PBS. Przed użyciem przechowywać roztwór NP-TCO w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie powierzchni

Wszystkie testy rezonansu plazmonów powierzchniowych są wykonywane na urządzeniu Biacore T100 (GE Healthcare) w temperaturze 25 °C przy użyciu chipa czujnika CM5 i PBS-P jako bufora do działania, chyba że zaznaczono inaczej. Oprogramowanie Biacore Control and Evaluation dostarczone wraz z urządzeniem służy do przeprowadzania eksperymentów i analizowania danych. Dwa tryby pracy, kreatory aplikacji i uruchamianie ręczne, będą wykorzystywane do przygotowania powierzchni i monitorowania wbudowanego w układ scalony cykloaddycji. Tryb konstruktora metod będzie używany do ustawiania eksperymentów wiązania w odwrotnej orientacji oraz do pomiaru szybkości reakcji cykloaddycji. Dane są odejmowane z podwójnym odniesieniem, a analizy kinetyczne są wykonywane przy użyciu modelu wiązania Langmuira 1:1.

  1. Użyj szablonu kreatora immobilizacji amin i wybierz immobilizację w komórkach przepływu 1 (odniesienie) i 2 (wykrywanie). Zmodyfikowanie metody aminowej w celu aktywacji powierzchniowych grup karboksylowych przez wstrzyknięcie roztworu 1:1 0,4 M EDC: 0,1 M NHS przez 480 sekund przy natężeniu przepływu 10 μl/min. Ustawić wstrzyknięcie etanoloaminy w celu ugaszenia pozostałych aktywowanych estrów do czasu kontaktu 420 sekund przy natężeniu przepływu 10 μl/min.
  2. Nazwa liganda wejściowego, anty-GST (18 μg/ml w buforze octanowym o pH 5,0) i ustawione na wstrzykiwanie przez czas kontaktu 420 sekund przy natężeniu przepływu 10 μl/min.
  3. Umieść wymagane fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz i rozpocznij unieruchomienie.
    Uwaga: Uruchomienie kreatora unieruchomienia w ten sposób powoduje unieruchomienie anty-GST na poziomie od ~14 000 do 17 000 RU.
  4. Edytuj kreatora unieruchomienia, aby wstrzykiwać roztwór liganda GST (20 μg/ml) tylko przez 420 sekund przy 5 μl/min nad referencyjną komórką przepływową 1.

3. Monitorowanie wbudowanego w układ scalony wychwytywania-cykloaddycji funkcjonalizowanych cząsteczek

  1. Monitorowanie wbudowanego w układ scalony cykloaddycji przechwytywania w czasie rzeczywistym (ilustracja 2).
    1. Umieść fiolki z roztworem GST-TCO (20 μg/ml), Tz-BnNH2 (10 μM) i regeneracyjnym (10 mM glicyny, pH = 2,0) w stojaku na odczynniki 2. Wybierz metodę uruchamiania ręcznego, ustaw natężenie przepływu na 5 μl/min, a ścieżkę przepływu na Komórka przepływu 2.
    2. Wstrzykiwać roztwór GST-TCO przez 420 sek.
    3. Wstrzykiwać roztwór Tz-BnNH2 przez 600 sek.
    4. Zregeneruj powierzchnię za pomocą dwóch 30 sekundowych wstrzyknięć roztworu regeneracyjnego.
  2. Monitorowanie montażu na chipie struktur wielokomponentowych w czasie rzeczywistym (ilustracja 3):
    1. Umieścić fiolki z roztworem GST-Tz (20 μg/ml), NP-TCO (100 μg Fe/ml), Tz-BnNH2 (10 μM) i regeneracyjnym (10 mM glicyny, pH = 2,0) w stojaku na odczynniki 2. Wybierz metodę ręcznego uruchamiania przyrządu, ustaw natężenie przepływu na 5 μl/min, a ścieżkę przepływu na Komórka przepływu 2.
    2. Wstrzykiwać roztwór GST-Tz przez 60 sekund.
    3. Wstrzykiwać roztwór NP-TCO przez 60 sekund.
    4. Wstrzykiwać roztwór Tz-BnNH2 przez 60 sekund.
    5. Zregeneruj powierzchnię za pomocą dwóch 30 sekundowych wstrzyknięć roztworu regeneracyjnego.

4. Monitorowanie gęstości unieruchomienia i wyznaczanie szybkości cykloaddycji

  1. Charakterystyka szybkości reakcji cykloaddycji małych cząsteczek (ryc. 4).
    1. Wybierz nową metodę i wprowadź parametry ogólne. W panelu kroków testu utwórz nowy krok i nadaj mu nazwę Próbka. Ustaw ustawienia Cel i Połącz bazę na Przykład.
    2. W panelu Typy cykli Utwórz nowy krok cyklu i wstaw następujące polecenia: Przechwytywanie, pobieranie próbek, regeneracja 1 i regeneracja 2.
    3. Wybierz polecenie Przechwyć; wprowadź nazwę liganda (GST-TCO, 20 μg/ml), czas kontaktu 120 sekund przy 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Drugi. Wybierz polecenie Próbka; wprowadź czas kontaktu 180 sekund, czas dysocjacji 60 sekund, natężenie przepływu 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Oba. Wybierz polecenie Regeneracja 1; wejściowa nazwa roztworu regeneracyjnego (10 mM glicyna-HCl pH 2,0), czas kontaktu 30 sekund przy 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Sekunda. Powtórz to samo dla polecenia Regeneration 2.
    4. Wybierz pozycję Setup Run i ustaw ścieżkę przepływu na: 2-1. Wybierz następny i wypełnij listę próbek roztworem analitu (Tz-BnNH2) i szeregiem stężeń (0,3-10 μM, rozcieńczenie 1:2). Wybierz obok panelu pozycji stojaka. Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane wiążące i analizę kinetyczną przedstawiono na rysunku 4.
  2. Charakterystyka szybkości reakcji cykloaddycji NP (ryc. 4).
    1. Otwórz zapisany szablon metody od góry i zmień następujące parametry. Wybierz panel Przechwyć; zmień nazwę liganda na GST-Tz, 20 μg/ml. Wybierz panel Próbka; Zmień czas kontaktu na 120 sekund, czas kontaktu i czas dysocjacji na 120 sekund.
    2. Wybrać listę próbek, zmienić analit na NP-TCO i szeregi stężeń (od 7 do 224 nM, rozcieńczenie 1:2). Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane wiążące i analizę kinetyczną przedstawiono na rysunku 4.

5. Pomiar wiązania FKBP12 z unieruchomionym AP1497

Badania wiązania o odwróconej orientacji wykorzystują FKBP12 jako analit i związek AP1497 jako unieruchomiony ligand (Rysunek 5). Ogólna metoda dla tego testu jest konfigurowana w następujący sposób za pomocą narzędzia do tworzenia metod:

  1. Wybierz nową metodę i wprowadź parametry ogólne. W panelu kroków testu utwórz i nazwij kroki przechwytywania, pobierania próbek i regeneracji. Wybierz odpowiednie ustawienia Cel i Podłącz bazę.
  2. Wybierz panel Typy cykli i utwórz 3 kroki cyklu: Przechwytywanie, Próbkowanie i Regeneracja.
  3. Wstaw polecenie Przechwyć dwukrotnie w kroku cyklu przechwytywania. Wybierz panel Capture 1 (Przechwyć 1) i wybierz rozwiązanie do przechwytywania jako zmienną, ustaw czas kontaktu na 300 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Drugi. Wybierz panel Capture 2 i wybierz rozwiązanie do przechwytywania jako zmienną, ustaw czas kontaktu na 250 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Drugi.
  4. Wstaw polecenie Sample w kroku cyklu Sample. Wybierz panel Próbka; Ustaw czas kontaktu na 60 sekund, czas dysocjacji na 200 sekund przy natężeniu przepływu 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Jedno i drugie.
  5. Wstaw dwukrotnie polecenie Regeneracja w kroku Cykl regeneracji. Wybierz panel Regeneracja 1; wejściowa nazwa roztworu regeneracyjnego (10 mM glicyna-HCl pH 2,0), czas kontaktu 30 sekund przy 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Sekunda. Powtórz to samo dla panelu Regeneracja 2.
  6. Wybierz pozycję Setup Run i ustaw ścieżkę przepływu na: 2-1. Wybierz następne i wejściowe nazwy roztworów do wychwytywania (GST-TCO i AP1497-Tz), nazwę próbki (FKBP12), serię stężeń (0,020 do 5 μg/ml, rozcieńczenie 1:2) i MW (13 000). Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane analizy kinetycznej przedstawiono na rysunku 5.

6. Pomiar wiązania FKBP12 z AP1497 przyczepionym do unieruchomionych NP

Ogólna metoda immobilizacji nanocząstek, derywatyzacji małych cząsteczek i testu wiązania FKBP12 jest ustawiana w następujący sposób za pomocą narzędzia do tworzenia metod:

  1. Otwórz zapisany szablon metody od góry i zmodyfikuj. Wstaw dodatkowe polecenie przechwytywania w kroku cyklu przechwytywania. Wybierz panel Capture 1 (Przechwyć 1). usuń zaznaczenie opcji Capture solution as variable and name capture solution 1 (GST-Tz). Ustaw czas kontaktu na 60 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na Sekunda. Wybierz panel Capture 2; usuń zaznaczenie opcji Capture Solution as Variable and Name Capture Solution 2 (NP-TCO). Ustaw czas kontaktu na 90 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na sekundę. Wybierz panel Capture 3; usuń zaznaczenie opcji Capture solution as variable and name capture solution 3 (AP1497-Tz) (rozwiązanie do przechwytywania). Ustaw czas kontaktu na 180 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na Sekunda.
  2. Wybierz pozycję Setup Run i ustaw ścieżkę przepływu na: 2-1. Wybierz pozycję Następny dwa razy. Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane analizy kinetycznej przedstawiono na rysunku 5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane i rysunki zostały zaadaptowane z odnośnika 8.

Efektywna odwracalna immobilizacja małych cząsteczek bioaktywnych z kontrolą orientacji i gęstości odgrywa kluczową rolę w rozwoju nowych zastosowań biosensorów. Wykorzystując szybką reakcję bioortogonalną pomiędzy TCO i Tz, opisano metodę stopniowego montażu i regeneracji powierzchni ligandów z zachowaniem aktywności biologicznej. Rysunek 2 przedstawia monitorowanie unieruchomienia Tz-BnNH2 w czasie rzeczywistym....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda wychwytywania-cykloaddycji umożliwia szybką, odwracalną immobilizację zmodyfikowanych nanocząstek i małych cząsteczek w celu bezznacznikowej interakcji opartej na chipach i badań kinetycznych. Protokół immobilizacji można wykonać w ciągu kilku minut, co wymaga stężenia <10 μM ligandów drobnocząsteczkowych. Modulując stężenie liganda i czas kontaktu, można ściśle kontrolować gęstość unieruchomienia. Nasze dane pokazują, że reakcje bioortogonalne na chipie zachowują zdolność funkcjonalizowanych in ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potwierdzamy finansowanie z NIH (NHLBI Contract No. HHSN268201000044C do R.W., S.H. i S.Y.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reagent
Sensor Chip CM5GE HealthcareBR-1005-30 
Zestaw sprzęgła aminowegoGE HealthcareBR-1000-50 
Zestaw do przechwytywania GSTGE HealthcareBR-1002-23 
Kolumny NAP-10GE Healthcare17-0854-01 
GST, liofilizowany w 1X PBSGenscriptZ020391 mg/ml
rhFKBP12R& D Systems3777-FK&nbsp;
Surfaktant P-20GE HealthcareBR-1000-54 
Glicyna 2.0GE HealthcareBR-1003-55 
Wirowa kolumna odsalająca ZebaThermo898827 K MWCO
Amicon Ultra 4FisherUFC810096100 K filtr odśrodkowy
TCO-OHRef. 8Syntetyzowany we własnym
zakresie TCO-NHSRef. 8Syntetyzowany we własnym zakresie, *Komercyjnie dostępny w Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2Ref. 8Synteza we własnym zakresie
Tz-NHSRef. 8764701Syntetyzowany we własnym zakresie, *Dostępny w handlu od Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2Ref. 8Syntetyzowany we własnym
zakresie AP1497, AP1497-TzRef. 8Syntetyzowany wewnętrznie
Equipment
SPR BiosensorGE Opieka zdrowotnaBiacore T100 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746(2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , Edition AB, (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immobilizacja mikroprzep ywowapowierzchniowy rezonans plazmonowywychwytywanie ma ych cz steczekimmobilizacja odwracalnawychwytywanie antygen przeciwcia ofunkcjonalizacja nanocz stektest wi zania SPRmonitorowanie w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły