Artykuł metodologiczny

Produkcja królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego

20.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50957

⸱

18 listopada 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Department of Molecular Pathology, University of Yamanashi

W tym artykule

Podsumowanie

Niedawny rozwój narzędzi do celowania w geny umożliwia produkcję królików nokautujących (KO). W niniejszej pracy wygenerowaliśmy pięć królików Apolipoproteiny (Apo) C-III KO przy użyciu nukleaz palca cynkowego (ZFN). Prace te wykazały, że ZFN jest wysoce wydajną metodą produkcji królików KO.

Streszczenie

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) znajduje się na powierzchni lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (CM), lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL). Stwierdzono, że wysoki poziom ApoCIII w osoczu stanowi czynnik ryzyka chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Podwyższony poziom ApoCIII w osoczu często koreluje z insulinoopornością, otyłością i hipertriglicerydemią. Bezcenną wiedzę na temat roli ApoCIII w metabolizmie lipidów i CVD uzyskano z transgenicznych modeli mysich, w tym myszy z nokautem ApoCIII (KO); Należy jednak zauważyć, że metabolizm lipoprotein u myszy różni się od metabolizmu ludzi pod wieloma względami. Do tej pory nie wiadomo, czy podwyższone stężenie ApoCIII w osoczu ma bezpośrednie działanie miażdżycowe. W niniejszym badaniu pracowaliśmy nad opracowaniem królików ApoCIII KO w oparciu o hipotezę, że króliki mogą służyć jako rozsądny model do badania metabolizmu lipidów i miażdżycy u ludzi. Zestawy nukleazy palca cynkowego (ZFN) ukierunkowane na króliczy gen ApoCIII poddano walidacji in vitro przed mikroiniekcją zarodka. MRNA wstrzyknięto do cytoplazmy 35 króliczych zarodków w stadium przedjądrowym i oceniono tempo mutacji w stanie blastocysty. Spośród szesnastu blastocyst, które poddano testom, osiągnięto zadowalający 50% wskaźnik mutacji (8/16) w miejscu docelowym, co przemawia za zastosowaniem zestawu 1 w eksperymentach in vivo. Następnie wykonaliśmy mikroiniekcję 145 zarodków z mRNA Set 1 i przenieśliśmy te zarodki do 7 królików biorców. Po 30 dniach ciąży urodziło się 21 kociąt, z których pięć zostało potwierdzonych jako króliki ApoCIII KO po testach sekwencjonowania PCR. Odsetek zwierząt KO (#KO młodych/łączną liczbę urodzeń) wyniósł 23,8%. Ogólna wydajność produkcji wynosi 3,4% (5 zestawów/145 przetransferowanych zarodków). Przedstawione prace wykazały, że ZFN jest wysoce wydajną metodą produkcji królików KO. Te króliki ApoCIII KO są nowymi zasobami do badania roli ApoCIII w metabolizmie lipidów.

Wprowadzenie

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) to małe O-glikozylowane białko wydzielnicze, które jest syntetyzowane głównie w wątrobie i jelicie. Znajduje się na powierzchni chylomikronu osocza (CM), lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL). ApoCIII został uznany za czynnik ryzyka chorób sercowo-naczyniowych1. Pacjenci z dziedzicznym niedoborem ApoCIII mają niski poziom trójglicerydów (TG) w osoczu i zmniejszoną subkliniczną miażdżycę tętnic wieńcowych2,3 . Z drugiej strony podwyższony poziom ApoCIII w osoczu często koreluje z insulinoopornością, otyłością i hipertriglicerydemią (HTG)4,5 .

Nokaut genowy (KO) to potężny sposób na badanie funkcji genu. Zgodnie z obserwacjami w populacjach zmutowanych ludzi, nokaut genu ApoCIII u myszy doprowadził do zmniejszenia TG w osoczu i ochrony przed poposiłkowym HTG6. Tak pozytywna rola ApoCIII wydaje się być niezależna od Apolipoproteiny E (ApoE), ponieważ myszy z niedoborem zarówno ApoE, jak i ApoCIII są również chronione przed hiperlipidemiąpoposiłkową 7. Chociaż te mysie modele ApoCIII KO dostarczyły bezcennych informacji na temat możliwych funkcji ApoCIII u ludzi, należy zauważyć, że metabolizm lipoprotein myszy różni się od metabolizmu ludzi w wielu aspektach. Na przykład myszy nie ma białka przenoszącego ester cholesterolu w osoczu (CETP), głównego enzymu biorącego udział w transporcie VLDL, LDL i HDL8. W związku z tym konieczne jest opracowanie odpowiedniego modelu zwierzęcego, aby lepiej zrozumieć fizjologiczną rolę ApoCIII in vivo.

Królik to klasyczny model gatunku zwierząt9-11. Ma krótki okres ciąży (30-31 dni), dużą wielkość miotu (4-12 na miot) i może być wygodnie trzymany w pomieszczeniu. W porównaniu z myszami, króliki są filogenetycznie bliższe ludziom10. Co ważne, podobnie jak ludzie, ale w przeciwieństwie do myszy, króliki są ssakami bogatymi w LDL i mają znaczny poziom CETP10,12 . Ponadto są podatne na miażdżycę tętnic wywołaną dietą bogatą w cholesterol ze zmianami podobnymi do tych obserwowanych w ludzkiej miażdżycy13. Z tych powodów postawiliśmy hipotezę, że króliki ApoCIII KO mogą służyć jako lepszy model niż ich mysie odpowiedniki do badania ról ApoCIIIplay w metabolizmie lipidów i miażdżycy u ludzi.

Produkcja genowo ukierunkowanych królików transgenicznych (GTT) była wyzwaniem. Wynika to głównie z braku embrionalnych komórek macierzystych przekazujących linię zarodkową (ESC) oraz wyjątkowo niskiej skuteczności transferu jądra komórki somatycznej (SCNT) u królików. ESC jest podstawowym narzędziem do generowania myszy GTT, podczas gdy SCNT został z powodzeniem zastosowany do generowania zwierząt KO u gatunków pozbawionych ESC przenoszących linię zarodkową, w tym świń, owiec i bydła, ale nie królików. Ostatnio nukleaza palca cynkowego (ZFN), nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN)14 i endonukleaza sterowana RNA (RGEN)15okazały się potężnymi środkami do edycji genomu. Te nukleazy, tak zwane "nożyczki molekularne", są skuteczne w generowaniu pęknięć dwuniciowych (DSB) w genomie, które mogą prowadzić do funkcjonalnego KO docelowego genu lub wykorzystywane do integracji sekwencji DNA w określonym miejscu w genomie u wielu gatunków16. W 2011 roku, jako jedni z pierwszych adaptatorów technologii ZFN, wygenerowaliśmy komórki świń KO aktywowane proliferatorami peroksysomów (PPARγ) KO za pomocą tego podejścia i z powodzeniem wygenerowaliśmy świnie PPARγ KO po użyciu tych komórek do SCNT17. W tym samym roku stwierdzono skuteczne rozrywanie genów immunoglobulin i celowaną ich zastępstwo u królików również stosującychZFN18.

W obecnym badaniu, pięć królików ApoCIII KO zostało wygenerowanych, co zostało potwierdzone przez sekwencjonowanie PCR, przy użyciu ZFN Set 1 (patrz Rysunek 1. dla ilustracji schematu blokowego). Zwierzęta te są nowymi zasobami do badania roli ApoCIII w metabolizmie lipidów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące utrzymania, opieki i użytkowania zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Uniwersytecką Komisję ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan.

1. Projekt i wybór ZFN

  1. Należy dostarczyć producentowi informacje o sekwencji genomowej genu będącego przedmiotem zainteresowania (np. królika ApoCIII). Wybierz zestawy ZFN do eksperymentów na podstawie wyników ZFN.

2. Kolekcja zarodków królika

  1. Dojrzałe płciowo (6-18 miesięcy) samice królików nowozelandzkich białych (NZW) superowulować przez podskórne (s.c.) wstrzyknięcie FSH dwa razy na dobę w dawce 3 mg na pierwsze dwa wstrzyknięcia, 5 mg na następne dwa wstrzyknięcia i 6 mg na ostatnie dwa wstrzyknięcia.
  2. Podać pojedyncze wstrzyknięcie dożylne (dożylnie) 200 j.m. hCG po 72 godzinach od pierwszego wstrzyknięcia FSH w celu wywołania owulacji. Skojarzyć samice z superowulacją z samcem królika natychmiast po wstrzyknięciu hCG.
  3. Króliki dawcy z superowulacją należy poddać eutanazji pentobarbitalem sodu (150 mg/kg, dożylnie) po 16-18 godzinach od inseminacji (p.s.i.).
  4. Odzyskaj bańki jajowodu, ostrożnie zbierając całe jajowody i strukturę jajników.
  5. Przepłukać każdy jajowód 10 ml pożywki manipulacyjnej TCM 199 z buforem HEPES, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, wstrzykując pożywkę z końca jajowodu. Zebrać przepłukaną pożywkę w otworze jajowodu na końcu jajnika do szalki Petriego.
  6. Obserwować i identyfikować odzyskane zarodki w przepłukanej pożywce, trzykrotnie umyć zarodki w pożywce do manipulacji, przechowywać je w pożywce do manipulacji w temperaturze 38,5 °C na powietrzu i obserwować pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem wystąpienia zapłodnienia. Przygotować do mikroiniekcji na zarodki w stadium przedjądrzastym 19-21 h p.s.i.

3. Przygotowanie mRNA ZFN

  1. Oczyść powstałe mRNA przed ponownym zawieszeniem w wolnym od RNAzy 0,1X TE (1 mM Tris-Cl pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Zmierz stężenie i przechowuj mRNA w temperaturze -80°C do czasu użycia.
  2. Przygotować mRNA kodujące parę ZFN (4-10 ng/μl w 1 mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA przy pH 7,5), podwielokrotność do 10 μl fiolek. Przechowywać je w temperaturze -80 ºC, aż będą gotowe do użycia. Przed mikrowstrzyknięciem należy rozmrozić fiolkę (fiolki) z RNA i przechowywać ją na lodzie.

4. Mikroiniekcja zarodka

  1. Przygotować platformę do mikroiniekcji, umieszczając kroplę 5 μl pożywki manipulacyjnej na 1-dołkowym szkiełku podstawowym, z którego usunięto komorę na pożywkę. Przykryj kroplę pożywki olejem mineralnym i umieść na podgrzewanym stoliku mikroskopu.
  2. Umieścić pipetę przytrzymującą (o średnicy 120 μm) w uchwycie mikromanipulatora i umieścić ją w kropli medium manipulacyjnego.
  3. Wytwarzanie mikropipet iniekcyjnych poprzez podgrzewanie i wyciąganie kapilar ze szkła borokrzemianowego w urządzeniu do ściągania mikropipet. Załaduj mRNA do wstrzyknięcia do pipety iniekcyjnej.
  4. Włączyć dopływ sprężonego powietrza, który jest podłączony do mikrowtryskiwacza.
  5. Umieścić pipetę iniekcyjną w uchwycie do wstrzykiwań, umieścić ją na mikromanipulatorze i umieścić w kropli medium manipulacyjnego.
  6. Ustaw mikrowtryskiwacz z następującymi sugerowanymi parametrami: holdP=2 p.s.i., InjP=20 p.s.i., ClearP= 60 p.s.i., Injtime= 1 s, co spowoduje objętość wstrzyknięcia 1-5 pl.
  7. Otwórz końcówkę pipety iniekcyjnej, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą.
  8. Przenieś zarodki (30-50) do kropli mikromanipulacji na platformie. Za pomocą pipety przytrzymującej uchwycić zarodek i wyrównać igłę do wstrzykiwań, zarodek i pipetę przytrzymującą wzdłuż osi x.
  9. W powiększeniu 400x przesunąć pipetę iniekcyjną przez zarodek. Uważaj, aby uniknąć jądra. Po przebiciu błony plazmatycznej naciśnij pedał nożny, aby wykonać wstrzyknięcie. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę, uwolnić zarodek. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych zarodków.
  10. Umyj wstrzyknięte zarodki trzykrotnie w pożywce do hodowli zarodków, która składa się ze zbilansowanego roztworu soli Earle'a (EBSS) uzupełnionego aminokwasami endogennymi (NEAA), aminokwasami egzogennymi (EAA), 1 mM L-glutaminy, 0,4 mM pirogronianu sodu i 10% FBS.
  11. Inkubować zarodki w temperaturze 38,5 °C w 5% CO2 w powietrzu przez 1-2 godziny, zanim zostaną chirurgicznie przeniesione do jajowodów zsynchronizowanej samicy królika NZW biorcy (patrz krok 5.1). Alternatywnie, hoduj zarodki do momentu osiągnięcia stadium blastocysty, zanim zostaną wykorzystane do walidacji in vitro lub testów.

5. Transfer zarodków

  1. Jako biorcę należy wybrać samicę królika NZW w wieku 5-12 miesięcy, w dobrym zdrowiu, o wadze ok. 4,0 do 5,0 kg. Hormon uwalniający gonadotropiny (GnRH) należy podać domięśniowo (i.m., 50 mcg/ml, 0,3 ml/zwierzę) biorcy w tym samym czasie, w którym wstrzykuje się hCG zwierzęciu(om) dawcy (patrz krok 2.2).
  2. Po zakończeniu mikroiniekcji należy przygotować królika biorcę do transferu zarodków (zwykle 16-24 godziny po wstrzyknięciu GnRH). Znieczulić królika 10-40 mg/kg ketaminy (domięśniowo) i/lub odparowanego izofluranu (2-4%) przez drogi oddechowe. Chroń oczy królika przed nadmiernym wysuszeniem poprzez nałożenie sterylnej maści okulistycznej. Obserwuj zwierzę aż do całkowitej utraty przytomności, tj. nie reaguje na odruchy pedałowania; Ściskanie podkładki pod stopę służy do sprawdzenia, czy nie ma odruchu pedałowania, co wskazuje na odpowiednie znieczulenie.
  3. Ogolić brzuch królika, umyć go peelingiem antyseptycznym, a następnie roztworem antyseptycznym i wytrzeć ogolony obszar sterylnymi gąbkami z gazy.
  4. Wykonaj operację w sterylnych warunkach, rejestruj parametry życiowe królika biorcy mniej więcej co 15 minut przez cały czas trwania operacji.
  5. Przenieść 10-25 zarodków do jednego zwierzęcia biorcy, w zależności od dostępnej liczby zarodków.
  6. Pod koniec zabiegów chirurgicznych należy zamknąć warstwę mięśniową powlekanym szwem wchłanialnym. Zszyć skórę szwem podskórnym za pomocą szwu wchłanialnego lub za pomocą prostych szwów przerywanych za pomocą szwów niewchłanialnych (np. nylonu monofilamentowego lub podobnego).
  7. Utrzymuj zwierzę w cieple i monitoruj je, aż do osiągnięcia pozycji mostkowej.
  8. Codziennie monitoruj zwierzę. Postępuj zgodnie z instrukcjami lekarza weterynarii, aby opiekować się zwierzęciem. Meloksykam (podp. 1,0 mg/kg) należy podawać codziennie po operacji w celu złagodzenia bólu i/lub obniżenia gorączki, jeśli lekarz weterynarii uzna to za konieczne.
  9. Niewchłanialne szwy skórne należy usunąć po około 10-14 dniach od operacji.

6. Wykrywanie zaburzeń genów wywołanych przez ZFN

  1. W celu walidacji in vitro należy przeprowadzić genotypowanie zarodków hodowanych in vitro. Lizować poszczególne zarodki, które rozwinęły się do stadium moruli/blastocysty w 5 μl roztworu NP40 (1% NP40 plus 1 ug/ml proteinazy K w buforze Taq) przez 0,5-1 godzinę w temperaturze 55 °C i 10 minut w temperaturze 95 °C.
  2. W celu genotypowania potomstwa należy pobrać próbki skóry uszu od noworodków, wyodrębnić genomowe DNA i użyć ich jako matryc do sekwencjonowania PCR. Po pobraniu próbek należy zastosować Kwik-Stop w miejscu pobierania próbek, aby zatrzymać krwawienie i zmniejszyć dyskomfort.
  3. Użyj lizy z kroku 6.2 lub 6.3 jako matrycy do PCR przy użyciu pary starterów LA-Taq i PCR, które znajdują się przed (5'- TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3') i za (5'-GCCAGGCCCACCCACACGGAACAGC-3') od miejsca docelowego ZFN.
  4. Oczyść produkty PCR i zsekwencjonuj je za pomocą startera sekwencjonującego (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3').
  5. Zidentyfikuj próbki zmutowanych substancji, szukając podwójnej krzywej na diagramie sekwencji wokół miejsca docelowego. Oznacz te z podwójnymi krzywymi jako "pozytywne".
  6. Sklonuj "pozytywne" produkty PCR do wektora klonowania TA, wybierz 10-20 klonów, zsekwencjonuj wstawki i potwierdź mutacje wokół miejsca docelowego.

Wyniki

Walidacja par ZFN in vitro
Początkowo zaprojektowano szesnaście par ZFN. Ukierunkowana sekwencja rozerwania zestawu 1 znajduje się w eksonie 2 królika ApoCIII (ryc. 2A). Wybrano trzy pary (zestaw 1, 2 i 3, rysunek 2A) i poddano je testowi reporterowemu drożdży MEL-1 w celu określenia aktywności ZFN (figura 2B). Zestaw 1 ma wynik ZFN wynoszący 224,2%, wyższy niż w przypadku zestawu 2 (196,9%) i zestawu 3 (177,8%) oraz znacznie wyższy niż próg selekcji (tj. 50% wewnętrznej kontroli dodatniej). W związku z tym zestaw 1 został wybrany do eksperymentów walidacyjnych in vitro.

Konkretny zestaw musi skutkować dodatnim wskaźnikiem u zarodków wynoszącym 10% lub wyższym, aby przejść walidację zarodków in vitro, w oparciu o wewnętrzne kryteria walidacji. mRNA (5 μg / ml) z zestawu 1 zostało mikrowstrzyknięte do cytoplazmy 35 zarodków królika w stadium przedjądrowym (ryc. 3A). Jako grupę kontrolną wykorzystano zarodki wypłukane bez leczenia mikroiniekcją (n=31). Osiemnaście zarodków z grupy mikrowstrzykniętych rozwinęło się do stadium BL na D5, z których szesnaście zostało zsekwencjonowanych, a osiem (BL#apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Figura 3B, podkreślone na czerwono) wykazywało zmutowane sekwencje w miejscu docelowym (czarne pole, Figura 2B, górny rząd, apoC3wt.seq). Odsetek BL w grupie mikroiniekcji (51,4%) jest niższy niż w grupie kontrolnej (77,4%), co wskazuje na nieznacznie upośledzoną kompetencję rozwojową zarodków z mikrowstrzyknięciem. Wskaźnik pozytywnych mutacji zarodków z mikrowstrzykniętymi zarodkami wynosi 50,0% (8/16), znacznie więcej niż próg selekcji (tj. 10%). Wyniki te ujawniły, że zestaw 1 jest skutecznym zestawem ZFN do indukowania mutacji w miejscu docelowym królika ApoCIII. W związku z tym do produkcji in vivo królików ApoCIII KO wybrano Zestaw 1.

Produkcja królików ApoCIII KO
mRNA ZFN Set 1 zostało mikrowstrzyknięte do cytoplazmy zarodków w stadium przedjądrowym królika i przeniesione 145 mikrowstrzykniętych zarodków do 7 królików biorców w pseudociąży (Figura 4A). Świeżo wypłukane zarodki (n=75) bez mikroiniekcji ZFN przeniesiono do biorców (n=6) jako grupę kontrolną. Po 30 dniach ciąży w grupie mikroiniekcji urodziło się 21 kociąt. Sekwencjonowanie PCR zidentyfikowało pięć (apoC3-R1, R9, R11, R12 i R16) jako dodatnie zestawy KO (Figura 4B). Odsetek terminów liczony jako łączna liczba donoszonych kociąt/całkowita liczba zarodków wynosi 14,5% (21/145), podczas gdy w grupie kontrolnej wynosi 29,3% (22/75). Wskaźnik KO liczony jako suma zestawów KO na łączny termin wynosi 23,8% (5/21). Jeden zestaw KO (apoC-R16) zmarł pięć dni po porodzie (20,0%, 1/5). Indelsat w miejscu docelowym zawiera dwie insercje i trzy delecje; są to odpowiednio Δ1, +1, +1, Δ20 i Δ21 dla królików # R1, R9, R11, R12 i R16 (rysunek 4B).

Analiza bioinformatyczna została użyta do zidentyfikowania potencjalnych niezgodności ZFN z 7 lub mniej niezgodnościami z sekwencją Zestawu 1, jak opisano wcześniej17. Tylko jedno przewidywane możliwe miejsce poza celem, zlokalizowane na chromosomie 14, zostało zidentyfikowane z 7 niedopasowanymi bps. Test PCR nie wykrył żadnych zdarzeń niedocelowych u żadnego ze zwierząt założycielskich.

Dyskusja

W niniejszej pracy, przy użyciu technologii ZFN, wygenerowano pięć królików ApoCIII KO. Wcześniej jedyny raport dotyczący produkcji królików GTT również wykorzystywał technologię ZFN18. Niniejsza praca potwierdziła, że ZFN jest użyteczna do efektywnego celowania w geny u królików.

W niniejszym badaniu odsetek transgeniczności (pozytywne zestawy/wszystkie urodzone) wyniósł 23,8% (5/21), co jest porównywalne z poprzednim raportem dotyczącym ZFN u królików (30,8%, 16/52)18 oraz wynikami zgłaszanymi przy użyciu ZFN u innych gatunków zwierząt, w tym u danio-pręgowanych19, myszy20, szczurów21 i świń17. W rzeczywistości odsetek ten jest wyższy niż w wielu konwencjonalnych badaniach nad produkcją królików transgenicznych, gdzie zazwyczaj mieści się on w zakresie 5-20%. Na przykład w próbie uzyskania transgenicznych królików ApoCIII poprzez konwencjonalną mikroiniekcję DNA, Ding et al. otrzymali 3 pozytywne osobniki założycielskie spośród 54 urodzonych młodych (5,6%)22.

Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, mutacje w miejscach celowania są zmienne i obejmują delecje lub insercje składające się z różnej liczby zasad (od 1-21 u pięciu królików KO). Na podstawie informacji o konkretnych sekwencjach zwierząt założycielskich przewiduje się, że co najmniej cztery z nich (i.e. te z mutacjami Δ1, +1, +1 lub Δ20) wykażą utratę funkcji ApoCIII. Zwierzę R-16 z mutacją Δ21 może nie wykazywać utraty funkcjonalności, ponieważ przewiduje się, że mutacja ta spowoduje jedynie utratę siedmiu aminokwasów, a nie przesunięcie ramki odczytu. Ostatecznie niezbędne są testy fenotypowe, aby ustalić, czy zwierzęta założycielskie rzeczywiście wykazują utratę funkcji ApoCIII.

Żaden z pięciu królików KO wygenerowanych w niniejszym badaniu nie posiada modyfikacji biallelicznych. Co ciekawe, tak samo było w przypadku poprzedniego raportu dotyczącego królików ZFN. W przeciwieństwie do tego, gdy zastosowano ZFN celujące w α1,3-galaktozylotransferazę w komórkach świńskich, częstotliwość celowania w pojedynczy allel wynosiła od 7 do 46%, przy czym około jedna trzecia mutacji tworzyła jednostopniowe nokauty bialleliczne 23. Zgodnie z tym, gdy zastosowano TALEN w komórkach fibroblastów świńskich, modyfikacje bialleliczne stwierdzono w około 15-40% wszystkich pozytywnych klonów14. Możliwe, że brak możliwości wygenerowania biallelicznych królików KO w niniejszym badaniu może wskazywać na różnice międzygatunkowe (i.e. króliki vs. świnie) w zakresie takiej wydajności celowania genowego opartego na nukleazach. Bardziej prawdopodobne jest jednak, że wynika to po prostu z faktu, iż liczba królików KO wygenerowanych w tym projekcie jest stosunkowo niewielka. Uważamy, że ZFN jest w stanie generować mutacje bialleliczne u królików, co powinno być rozważane jako kolejna potencjalna zaleta produkcji królików GTT w oparciu o ZFN. W celu potwierdzenia takiej zdolności ZFN u królików niezbędne są dalsze eksperymenty.

Podsumowując, niniejsza praca wykazuje, że podejście do celowania w geny oparte na ZFN jest skuteczne w tworzeniu królików KO. W szczególności wygenerowaliśmy pięć królików ApoCIII KO z satysfakcjonującą stopą transgenizacji wynoszącą 23,8%. Przewiduje się, że zwierzęta te dostarczą bardziej istotnych informacji na temat roli tego białka w metabolizmie lipidów u ludzi niż odpowiadające im modele mysie. Przewidujemy, że celowanie w geny oparte na ZFN, a także inne technologie oparte na nukleazach, takie jak TALEN i RGEN, u zwierząt niemysich znacząco ułatwią opracowanie nowych modeli zwierzęcych do badania różnych ludzkich chorób.

Schemat procesu edycji genów z użyciem ZFN; mikroiniekcja, walidacja embrionów, etapy genotypowania.
Rycina 1. Schemat produkcji królików z nokautem genowym przy użyciu technologii ZFN. Produkcja królików KO przy użyciu technologii ZFN rozpoczyna się od wyboru interesującego genu. Po dostarczeniu informacji o sekwencji projektowane są zestawy ZFN, które następnie poddawane są wewnętrznej walidacji w drożdżach. W punkcie kontrolnym 1 (CP-1) użytkownikom do wyboru zostaną udostępnione tylko te zestawy, które przeszły walidację wewnętrzną (50% lub więcej w stosunku do wewnętrznej kontroli pozytywnej). Jeśli żadne zestawy nie przejdą CP-1, do zaprojektowania skutecznych zestawów ZFN może być potrzebna dodatkowa sekwencja. Następnie przeprowadza się walidację embrionów in vitro, aby upewnić się, że wybrany zestaw ZFN może indukować mutacje w wybranych miejscach (CP-2). Zestawy ZFN zostaną wykorzystane tylko wtedy, gdy przejdą CP-2 (wskaźniki mutacji >=10% w embrionach in vitro). Niepowodzenie w CP-2 będzie wymagało ponownego zaprojektowania zestawów ZFN. Przygotowane zostaną dawcy embrionów, a embriony w stadium pronukleusowym zostaną poddane mikroiniekcji zwalidowanych zestawów ZFN. Mikroiniekcyjne embriony zostaną przeniesione do zsynchronizowanych biorców. Po miesięcznym okresie ciąży noworodki zostaną poddane genotypowaniu (CP-3). Jeśli żadne z noworodków nie będą pozytywne, wykonana zostanie dodatkowa mikroiniekcja. Od rozpoczęcia projektu do etapu CP-2 mija 2-3 miesiące, zakładając brak błędów w procesie. Od CP-2 do CP-3 mija dodatkowe 2-3 miesiące. Zatem przy użyciu technologii ZFN możliwe jest wytworzenie królika z nokautem genowym w czasie od 4 do 6 miesięcy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat edycji genów z miejscami wiązania ZFN, strukturą eksonów i tabelą analizy wyników aktywności.
Rycina 2. Projekt ZFN. Zaprojektowano trzy zestawy ZFN (Zestaw 1, 2 i 3) celujące w różne sekwencje w eksonie 1 lub eksonie 2 genu ApoCIII królika (A). Wszystkie trzy zestawy poddano testowi reporterowemu MEL-1 w drożdżach w celu określenia aktywności ZFN. Zgodnie z protokołami producenta, ZFN wykazujące aktywność >50% w stosunku do wewnętrznej kontroli pozytywnej producenta są uważane za użyteczne w eksperymentach edycji genomu in vitro i in vivo. Aktywność ZFN wyniosła 224,2% dla Zestawu 1, 196,9% dla Zestawu 2 oraz 177,8% dla Zestawu 3 (B), w związku z czym w niniejszym badaniu wybrano Zestaw 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Edycja genów ZFN; tabela danych o mutacjach i dopasowanie sekwencji; analiza DNA dla badania naukowego.
Rysunek 3. In vitro walidacja ZFN w embrionach. mRNA (5 μg/ml) z zestawu Set 1 wstrzyknięto do cytoplazmy 35 embrionów królika w stadium pronuklearnym (A). Jako grupę kontrolną wykorzystano wypłukane embriony bez mikroiniekcji (n=31). Odsetek rozwoju BL w grupie kontrolnej wyniósł 77,4%. W grupie poddanej mikroiniekcji odsetek BL wyniósł 51,4%. Spośród 16 BL poddanych sekwencjonowaniu PCR, 8 (50%) zidentyfikowano jako pozytywne, co wskazuje, że Set 1 jest skutecznym zestawem ZFN indukującym mutacje w miejscu celowania (B, apoc3wt.seq, zaznaczone czarną ramką) genu ApoCIII u królików. BL zawierające mutacje to BL#apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15 i 17 (B, podkreślone na czerwono). Pozostałe BL (#apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 i 16) nie posiadają mutacji w miejscu celowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Wyniki edycji genów za pomocą nukleazy z palcem cynkowym (ZFN); tabela przeniesionych zarodków i wykres analizy sekwencji DNA.
Rysunek 4. Produkcja królików KO ApoCIII. Sto czterdzieści pięć zarodków po mikroiniekcji mRNA ZFN Set 1 przeniesiono do 7 pseudaciąży królików biorców (A). Świeżo wypłukane zarodki (n=75) bez mikroiniekcji ZFN przeniesiono do biorców (n=6) jako grupę kontrolną. Odsetek urodzeń pełnoterminowych obliczony jako całkowita liczba miotów pełnoterminowych / całkowita liczba zarodków w grupie eksperymentalnej wynosi 14,5% (21/145), podczas gdy w grupie kontrolnej wskaźnik ten wynosi 29,3% (22/75) (A). Z 21 miotów urodzonych w grupie po mikroiniekcji pięć (R1, R9, R11, R12 i R16) zidentyfikowano jako pozytywne mioty KO po sekwencjonowaniu PCR (B). Indele w miejscu celowania obejmują dwie insercje (+1 dla R9 i R11) oraz trzy delecje (Δ1, Δ 20, Δ 21 odpowiednio dla R1, R12 i R16). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana z grantów z National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652, and HL068878 to Y.E.C.), American Heart Association (National Scientist Development 0835237N to J.Z.). Y.E.C. jest wspierany finansowo jako fundowany przez Fredericka Huetwella profesora medycyny sercowo-naczyniowej w University of Michigan Medical Center (UMMC). W pracach wykorzystano usługi podstawowe wspierane przez Centrum Zaawansowanych Modeli Nauk Translacyjnych i Terapii (CAMTraST) na UMMC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
APOC3-ZFNSigma AldrichCSTZFNY-1KTGen docelowy: APOC3, Numer partii: 12201118MN
Zestaw mMESSAGEZestaw InvitrogenAM1344Msynteza mRNA
MEGAclear Kit InvitrogenAM1908Moczyszczanie mRNA Hormon
folikulotropowyBioniche LifeSciences Folltropin-VLeczenie królików dawców zarodków
Ludzka gonadotropina kosmówkowaIntervetChorulonLeczenie królików dawców zarodków
Hormon uwalniający gonadotropinyProspecbioHOR-255Leczenie królików biorców zarodków
Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) Thermo Fisher ScientificSH30029.02Hodowla zarodków, podłoże
bazowe MEM (aminokwas endogenny)Sigma AldrichM7145Hodowla zarodków, suplementy
Roztwór aminokwasów BMESigmaAldrich B6766Hodowla zarodków, suplementy
GlutaminaGibco25030-149Hodowla zarodków, suplementy
Pirogronian sodu Gibco11360-070Hodowla zarodków, suplementy
Surowica bydlęcapłodu Sigma Aldrich12003CHodowla zarodków, suplementy
HEPES buforowane TCM 199 Gibco12350039Pożywka do manipulacji zarodkami
InkubatorEppendorfGalaxy 170Sprzęt do hodowli zarodków
Mikromanipulator EppendorfTransferMan NK 2Sprzęt do manipulacji zarodkami
Ściągacz do mikropipetSutter Instruments Inc.P-1000Sprzęt do manipulacji zarodkami
Mikroiniektor Tritech ResearchMINJ-DSprzęt do manipulacji zarodkami
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.TW100F-6Zaopatrzenie do manipulacji zarodkami
Euthasol (pentobarbitol sodu)Virbac AH, Inc.ANADA#200-071Eutanazja zarodków królików-dawców

Bibliografia

  1. Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor. Clinical Science. 114, 611-624 (2008).
  2. Pollin, T. I., et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection. Science. 322, 1702-1705 (2008).
  3. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).
  4. Cohn, J. S., et al. Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia. Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).
  5. Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).
  6. Maeda, N., et al. Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia. The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).
  7. Jong, M. C., et al. Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice. Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).
  8. James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. Cardiac physiology in transgenic mice. Circ. Res. 82, 407-415 (1998).
  9. Duranthon, V., et al. On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).
  10. Fan, J., Watanabe, T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).
  11. Shiomi, M., Ito, T. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe. Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).
  12. Morehouse, L. A., et al. Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits. Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).
  13. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).
  14. Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  15. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).
  16. Petersen, B. Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production. Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).
  17. Yang, D., et al. Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Research. 21, 979-982 (1038).
  18. Flisikowska, T., et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE. 6, e21045(2011).
  19. Foley, J. E., et al. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases. Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).
  20. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  21. Mashimo, T., et al. Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS ONE. 5, e8870(2010).
  22. Ding, Y., et al. Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII. Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).
  23. Hauschild, J., et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kr licze modele z nokautem ApoCIIImikroiniekcja zarodk wzarodki w stadium pronukleusowymcelowanie genoweiniekcja mRNA ZFNstopie mutacji blastocystanalizy sekwencjonowania PCRtransfer do kr liczyc biorc wodsetek zwierz t z nokautem
Produkcja królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.