Method Article

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

DOI:

10.3791/51114

⸱

January 17th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo dostępności terapii i szczepionek, gruźlica (TB) pozostaje jedną z najbardziej śmiertelnych i rozpowszechnionych infekcji bakteryjnych na świecie. Od kilkudziesięciu lat nagły wybuch szczepów wielolekoopornych i intensywnie lekoopornych stanowi poważne zagrożenie dla zwalczania gruźlicy. W związku z tym konieczne jest zidentyfikowanie nowych celów i szlaków krytycznych dla czynnika wywołującego gruźlicę, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), oraz poszukiwanie nowych substancji chemicznych, które mogłyby stać się lekami na gruźlicę. Jednym z podejść jest stworzenie metod odpowiednich dla genetycznych i chemicznych badań przesiewowych w dużych bibliotekach umożliwiających poszukiwanie igły w stogu siana. W tym celu opracowaliśmy test fenotypowy polegający na wykrywaniu znakowanego fluorescencyjnie Mtb w znakowanych fluorescencyjnie komórkach gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej. Ten test in vitro pozwala na ilościową identyfikację procesu kolonizacji Mtb do gospodarza na podstawie obrazu i został zoptymalizowany pod kątem formatu mikropłytki 384-dołkowej, który jest odpowiedni dla badań przesiewowych bibliotek siRNA, związków chemicznych lub mutantów Mtb. Obrazy są następnie przetwarzane do analizy wieloparametrycznej, która umożliwia odczytanie wniosków na temat patogenezy Mtb w komórkach gospodarza.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród pojawiających się i ponownie pojawiających się patogenów zakaźnych zgłoszonych w ostatnich latach, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) zajmuje czołowe miejsce, odpowiadając za 1,4 miliona zgonów i 8,7 miliona nowych infekcji w 2011 roku (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Pomimo dostępności terapii wielolekowych, liczba zakażonych osób wciąż rośnie, a wielolekooporne (MDR) oraz wysoce lekooporne (XDR) Mtb szybko rozprzestrzeniają się na całym świecie1. Co więcej, biorąc pod uwagę obecność antygenów Mtb, oczywiste jest, że jedna trzecia światowej populacji jest uważana za utajoną zakażoną Mtb. Statystycznie w jednym przypadku na dziesięć następuje ewolucja w kierunku aktywnej postaci choroby z późniejszymi objawami klinicznymi2. Dlatego pilnie potrzebne są nowe środki do walki z Mtb. W tym kontekście opracowaliśmy wizualny test fenotypowy in vitro, opierający się na monitorowaniu inwazji i namnażania Mtb do komórek gospodarza za pomocą zautomatyzowanej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej3. Adaptacja testu na 384-dołkowych płytkach mikromiareczkowych w połączeniu z automatyczną akwizycją i analizą obrazu umożliwiła przeprowadzenie badań przesiewowych o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości (HC/HTS) bibliotek średniego skali związków, siRNA i mutantów bakteryjnych. Badania przesiewowe biblioteki RNAi obejmującej cały genom w tym teście fenotypowym umożliwiły zatem identyfikację kluczowych czynników gospodarza zaangażowanych w transport Mtb i replikację wewnątrzkomórkową, ale także wyjaśnienie szlaków gospodarza wykorzystywanych przez prątki gruźlicy. Kolejną adaptacją tego konkretnego testu fenotypowego była identyfikacja czynników bakteryjnych niezbędnych do utrzymania się Mtb w obrębie fagosomalów. Na przykład zatrzymanie dojrzewania fagosomów jest uważane za jeden z głównych mechanizmów ułatwiających przetrwanie i replikację Mtb w makrofagach. Monitorowanie subkomórkowej lokalizacji mutantów nokautujących Mtb w znakowanych fluorescencyjnie kompartmentach kwasowych pozwoliło na identyfikację genów bakteryjnych zaangażowanych w proces przeżycia4. Wreszcie, obrazowanie Mtb o wysokiej zawartości stanowi również doskonałą metodę ilościowego określania skuteczności leku w hamowaniu różnych zjawisk, takich jak wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii3. Ogólnie rzecz biorąc, ten rodzaj wysokoprzepustowego testu fenotypowego pozwala przyspieszyć odkrywanie leków przeciwko gruźlicy, a dane zebrane za pomocą tych różnych podejść przyczyniają się do lepszego zrozumienia manipulacji gospodarza wywieranej przez Mtb.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe siRNA całego genomu

Badanie przesiewowe przeprowadzone na ludzkiej linii komórkowej pneumocytów typu II model A549 po zakażeniu Mtb H37Rv wykazującym ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP). Ta procedura jest opisana na rysunku 1A.

  1. Ponownie zawiesić wysuszoną bibliotekę siRNA, która jest przechowywana na płytkach macierzystych (płytki 96-dołkowe) z 1x buforem siRNA, aby osiągnąć stężenie 4 μM, a następnie przenieść 10 μl mieszaniny do 384-dołkowej płytki potomnej (płytka potomna 1).
  2. Dodaj 10 μl buforu 1x siRNA na płytce potomnej 1, aby rozcieńczyć siRNA 2-krotnie. Po ponownym zawieszeniu siRNA płytki są uszczelniane zdzieralną aluminiową uszczelką i mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy do 2-3 lat, ale czas przechowywania może się różnić w zależności od zaleceń producenta biblioteki siRNA.
  3. Rozcieńczyć siRNA na płytce potomnej 1 na płytce potomnej 2, aby osiągnąć stężenie 500 nM. Po ponownym zawieszeniu siRNA płytki są uszczelniane zdzieralną aluminiową uszczelką i mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy do 2-3 lat, ale czas przechowywania może się różnić w zależności od zaleceń producenta biblioteki siRNA.
  4. Przed użyciem rozmrozić płytkę pochodną 2 w temperaturze pokojowej.
  5. Weź 2,5 μl siRNA z płytki potomnej 2 i umieść na 384-dołkowej płytce testowej.
  6. Na tej samej 384-dołkowej płytce testowej w kroku 1.5 dodaj 2,5 μl siRNA kontroli ujemnej i dodatniej do odpowiednich studzienek.
  7. Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji w 1x D-PBS, aby uzyskać wystarczającą ilość roztworu, aby dostarczyć 0,1 μl odczynnika do transfekcji w każdym dołku i wstępnie inkubować rozcieńczony roztwór do transfekcji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  8. Dodać 7,5 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji/roztworu PBS do każdego dołka na płytce testowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Dodać 40 μl komórek A549 (1,500 komórek / studzienkę) zawieszonych w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Utrzymywać komórki przez 3-dniowy okres inkubacji w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 . Komórki te dzielą się co 24 godziny, więc około 12 000 komórek znajduje się w studzienkach trzy dni po transfekcji.
  10. Przepłukać dwutygodniową hodowlę Mtb H37Rv wykazującą ekspresję GFP za pomocą D-PBS (wolnego od MgCl2 i CaCl2) przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 5 minut i wyrzucić popłuczyny. Powtórz ten krok 3 razy. (Aby zapoznać się z warunkami hodowli GFP-Mtb H37Rv, patrz Protokół 3).
  11. Zawiesić osad bakteryjny w 10 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i zdekantować na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić osadzenie się agregatów bakteryjnych.
  12. Zebrać bakteryjny supernatant i zmierzyć OD600 (OD600 powinien wynosić od 0,6-0,8) i fluorescencję GFP (wartość RFU) za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia stężenia bakterii. Obliczyć miano zawiesiny, używając referencyjnej linii regresji wyświetlającej wartość RFU = f (wartość CFU), która została wygenerowana przed eksperymentem na innej hodowli, która została przygotowana w tych samych warunkach. Przygotować zawiesinę bakteryjną zawierającą 2,4 x 106 bakterii/ml, co odpowiada wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5.
  13. Usunąć pożywkę z 384-dołkowej płytki testowej i dodać 25 μl świeżo przygotowanej zawiesiny bakteryjnej.
  14. Inkubować 384-dołkową płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 godzin w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  15. Usuń pożywkę i delikatnie umyj ogniwa pożywką RPMI uzupełnioną 10% FBS 3x.
  16. Aby zabić pozostałe bakterie zewnątrzkomórkowe, należy potraktować komórki 50 μl świeżej pożywki RPMI-FBS zawierającej 50 μg/ml amikacyny w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  17. Usuń pożywkę zawierającą amikacynę i dodaj 50 μl świeżej pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS. Inkubować 384-dołkową płytkę testową w temperaturze 37 °C przez 5 dni w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  18. Przed uzyskaniem obrazu dodać 10 μl świeżo przygotowanych 30 μg/ml DAPI w PBS (stężenie końcowe 5 μg/ml) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  19. Załaduj płytkę do automatycznego mikroskopu konfokalnego.
    figure-protocol-1
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  20. Ustaw parametry ekspozycji. Zapis fluorescencji DAPI za pomocą lasera wzbudzającego 405 nm z filtrem emisyjnym 450 nm oraz fluorescencji GFP za pomocą lasera wzbudzającego 488 nm z filtrem emisyjnym 520 nm.
    figure-protocol-2
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
    figure-protocol-3
    Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
  21. Wybierz studzienki i pola w każdym dołku, które mają zostać pobrane, które są następnie określane jako parametry układu i podukładu.
    figure-protocol-4
    Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
    figure-protocol-5
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  22. Wygeneruj plik eksperymentu przy użyciu parametrów z kroków 1.20 i 1.21, a następnie uruchom automatyczne pobieranie.
    figure-protocol-6
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
    figure-protocol-7
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  23. Przesyłanie obrazów do serwera zdalnego.
    figure-protocol-8
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  24. Oceniaj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Wykryj jądra komórkowe z kanału DAPI za pomocą algorytmu wykrywania jąder i obszar bakteryjny z kanału GFP za pomocą algorytmu właściwości intensywności pikseli (ryc. 4A).

Uwaga: Ten protokół jest zoptymalizowany do badania wpływu wyciszania genów na wewnątrzkomórkowy wzrost Mtb. Mtb to bakteria o powolnym wzroście, która dzieli się co 20 godzin w optymalnych warunkach. Po 5 dniach od zakażenia ilość zewnątrzkomórkowego Mtb jest nadal niska przy braku lizy komórek i nie wpłynęła na jakość analizy. Protokół ten musi zostać zoptymalizowany pod względem długości antybiotykoterapii i czasu inkubacji, aby można go było dostosować do badań przesiewowych siRNA przy użyciu szybko rosnących bakterii, takich jak Mycobacteria smegmatis i Escherichia coli, które są szeroko uwalniane i mogą infekować nowe komórki.

2. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków

Badania przesiewowe przeprowadzone na komórkach gospodarza zakażonych Mtb H37Rv. Procedura ta została opisana na rysunku 1B.

  1. Rozmrozić 384-dołkowe płytki macierzyste zawierające bibliotekę związków rozpuszczoną w DMSO 100%. Przenieść 0,5 μl związków do 384-dołkowych płytek potomnych zawierających 10 μl pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS.
  2. Przepłukać dwutygodniową hodowlę Mtb H37Rv wykazującą ekspresję GFP za pomocą D-PBS (wolnego od MgCl2 i CaCl2) przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 5 minut i wyrzucić popłuczyny. Powtórz ten krok 3 razy (warunki hodowli GFP-Mtb H37Rv patrz Protokół 3).
  3. Zawiesić osad bakteryjny w 10 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i zdekantować na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić osadzenie się agregatów bakteryjnych.
  4. Zebrać bakteryjny supernatant i zmierzyć OD600 (OD600 powinien wynosić od 0,6-0,8) i fluorescencję GFP (wartość RFU) za pomocą czytnika mikropłytek. Obliczyć miano zawiesiny za pomocą referencyjnej linii regresji wyświetlającej wartość RFU = f (wartość CFU), która została wygenerowana przed eksperymentem. Typowe stężenie to 1 x 108 bakterii/ml.
  5. Zbierz 6-dniowe pierwotne ludzkie makrofagi w 4 x 10 5 komórek/ml w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 50 ng / ml rekombinowanym ludzkim M-CSF (dla oczyszczania ludzkich komórek monocytów krwi obwodowej i różnicowania makrofagów, patrz Protokół 4).
  6. Inkubować rozcieńczone komórki pierwszorzędowe z pałeczkami w różnych MOI, w zakresie 1-5, w zawiesinie z łagodnym wstrząsaniem przy 90 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  7. Umyj zainfekowane komórki przez odwirowanie przy 350 x g w celu usunięcia bakterii zewnątrzkomórkowych. Po każdym etapie wirowania ponownie zawiesić osad w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS. Powtórz ten krok 2 razy.
  8. Zawiesić zakażone komórki w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i amikacyną w stężeniu 50 μg/ml i inkubować zawiesinę, lekko wstrząsając, przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  9. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą amikacynę przez odwirowanie przy 350 x g i przemyć zakażone komórki kompletną pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 10% FBS i 50 ng/ml rekombinowanym ludzkim M-CSF. Powtórz raz.
  10. Dodać 40 μl zakażonej zawiesiny makrofagów do tej samej płytki testowej w kroku 2.1, która zawiera już 10 μl rozcieńczeń związku. Końcowe stężenie DMSO w każdym odwiercie osiągnęło obecnie 1%.
  11. Inkubować płytki do oznaczania przez 5 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  12. Wybarwić żywe komórki barwnikiem fluorescencyjnym dalekiej czerwieni przepuszczanym przez komórkę.
  13. Załaduj płytkę do automatycznego mikroskopu konfokalnego.
    figure-protocol-9
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  14. Ustaw parametry ekspozycji. Zapis dalekiej czerwonej fluorescencji za pomocą lasera wzbudzającego 640 nm z filtrem emisyjnym 690 nm i fluorescencji GFP za pomocą lasera wzbudzającego 488 nm z filtrem emisyjnym 520 nm.
    figure-protocol-10
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
    figure-protocol-11
    Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
  15. Wybierz studzienki i pola w każdym dołku, które mają zostać pobrane, które są następnie określane jako parametry układu i podukładu.
    figure-protocol-12
    Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
    figure-protocol-13
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  16. Wygeneruj plik eksperymentu przy użyciu parametrów z kroków 2.14 i 2.15 i uruchom automatyczne pobieranie.
    figure-protocol-14
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
    figure-protocol-15
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  17. Przesyłanie obrazów do serwera zdalnego.
    figure-protocol-16
    Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.
  18. Oceniaj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Wykryj obszar komórki z kanału dalekiej czerwieni za pomocą algorytmu właściwości intensywności piksela i obszar bakteryjny z kanału GFP za pomocą algorytmu właściwości intensywności piksela (rysunek 4B).

Uwaga: Ten protokół może być dostosowany do badań przesiewowych biblioteki mutantów Mtb poprzez zastąpienie związków mutantami wyrażającymi białko fluorescencyjne (Jeden dołek/Jeden mutant) (Rysunek 1C, zobacz także Brodin i wsp.4). Mutanty fluorescencyjne są najpierw wysiewane w studzienkach (20 μl zawiesiny bakteryjnej na studzienkę). Bakterie są następnie odzyskiwane przez 30 μl zawiesiny komórkowej. Po odwirowaniu przy 350 x g przez 1 min, płytkę inkubuje się w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 . Czas inkubacji i MOI zależą od testu. Na przykład, w celu wizualizacji wczesnych zdarzeń komórkowych, takich jak zakwaszenie fagosomów, komórki mogą być zakażone przez 2 godziny MOI w zakresie od 1 do 20. Lizosomy są barwione przy użyciu barwnika Lysotracker w temperaturze 2 μM przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 , a następnie utrwalane za pomocą 10% formaliny lub 4% paraformaldehydu (PFA). Obrazy konfokalne są pozyskiwane i ostatecznie analizowane za pomocą skryptów analizy obrazu zawierających odpowiednie algorytmy wykrywania lizosomów i lokalizacji subkomórkowej4.

3. Warunki hodowli białka zielonej fluorescencji wyrażającego Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv)

Do długotrwałego przechowywania, GFP-H37Rv zostały zamrożone w D-PBS (około 1 x 108 prątków na fiolkę).

  1. Zawiesić jedną zamrożoną fiolkę GFP-H37Rv w kolbie Erlenmeyera zawierającej 50 ml pożywki bulionowej 7H9 uzupełnionej wzbogaceniem Middlebrook OADC 10%, glicerolem 0,5%, Tween-80 0,05% i higromycyną B (50 μg/ml).
  2. Inkubować przez 8 dni w temperaturze 37 °C.
  3. Zmierz OD600 w kulturze GFP-H37Rv.
  4. Rozcieńczyć kulturę GFP-H37Rv, aby uzyskać OD600 = 0,1 w świeżym podłożu bulionowym 7H9 uzupełnionym wzbogaceniem Middlebrook OADC 10%, glicerolem 0,5%, Tween-80 0,05% i higromycyną B (50 μg / ml).
  5. Inkubować GFP-H37Rv w temperaturze 37 °C jeszcze przez 8 dni przed użyciem do testu.

4. Oczyszczanie ludzkich komórek monocytowych krwi obwodowej z preparatu pełnej krwi lub kożucha

  1. Rozcieńczyć woreczek z krwią 2x w 1x D-PBS (wolny od MgCl2 i CaCl2) zawierający 1% FBS.
  2. Izolować monocyty przez wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll przy 400 x g przez 20 minut.
  3. Zbierz wyizolowane monocyty.
  4. Przemyć monocyty 3x 1x D-PBS (wolny od MgCl2 i CaCl2) zawierający 1% FBS przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Skoncentrować komórki do 1 x 107 komórek/ml.
  6. Oczyść monocyty za pomocą kulek magnetycznych CD14 zgodnie z protokołem producenta (patrz Materiały).
  7. Po oczyszczeniu monocytów CD14 wysiewać komórki w temperaturze 1,5 x 106 komórek/ml w RPMI 1640 uzupełnionym 10% FBS i 40 ng/ml ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (hM-CSF) i inkubować przez 4 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  8. Po 4 dniach zastąpić pożywkę świeżym RPMI 1640 uzupełnionym 10% FBS i 40 ng/ml hM-CSF i inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  9. Po 6 dniach komórki można wykorzystać do testu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe siRNA całego genomu

Mtb jest w stanie skolonizować komórki odpornościowe in vitro, jak również kilka innych komórek nabłonka płuc. Na przykład Mtbjest w stanie infekować i uszkadzać komórki nabłonkowe A549, które są powszechnie stosowane jako model dla ludzkich pneumocytów typu II5-7. Dektyna-1 została zgłoszona jako receptor komórki gospodarza zaangażowany w wychwyt Mtb, odpowiedź prozapalną i działanie przeciwb...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metody wymagane do testu fenotypowego z wykorzystaniem szczepu Mtb H37Rv z ekspresją GFP do infekowania znakowanych fluorescencyjnie komórek gospodarza, co czyni go odpowiednim do badań przesiewowych o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy związków, sond fluorescencyjnych i mutantów Mtb . Dla każdego opisanego powyżej protokołu można przeprowadzić etapy fiksacji i znakowania immunologicznego przed akwizycją obrazu. Do pozyskiwania ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla tej pracy zostało zapewnione przez Wspólnotę Europejską (Grant ERC-STG INTRACELLTB nr 260901, Grant MM4TB nr 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) oraz Region Nord Pas de Calais. Wyrażamy wdzięczność za pomoc techniczną ze strony Gasparda Deloisona, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanniego i Franka Lafonta z platformy BICeL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
&mikro; przezroczysta płytka, 384-dołkowaGreiner Bio-One781091127,8/86/15 MM z pokrywką,
384-dołkowa płytka CellCarrierPerkinElmer6007550, przezroczysta z dnem, z pokrywką, z dnem w kształcie litery V poddanym obróbce TC
, biała, płytka 384-dołkowaGreiner Bio-One781280 
taśma uszczelniająca, oddychająca, sterylnaCorning3345 
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150Odczynnik do transfekcji
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010Pożywka do hodowli komórkowych
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco' s Bufor do zasolenia fosforanów
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco' s Bufor fosforanowy Salin
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll do oczyszczania komórek monocytów krwi obwodowej
Mikrogranulki CD14, ludzkieMiltenyi130-050-201Oczyszczanie monocytów CD14 +
Ludzki M-CSF, premium gr. (1000 μ g)Miltenyi130-096-493Kolumny LS czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów
Miltenyi130-042-401Kolumny do izolacji monocytów CD14 +
Tween 80Euromedex2002-AKultura prątków
Glicerol o wysokiej czystości Euromedex50405-EXHodowla prątków
  Wzbogacenie Middlebrook OADCBecton-Dickinson211886Hodowla prątków
7H9Becton-DickinsonW1701PKultura prątków
Versene 1xLife Technologies15040033Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek
DAPILife TechnologiesD1306Barwnik jąder
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570Barwnik jąder
Syto60Life TechnologiesS11342Barwnik jądrowy/cytoplazmatyczny
FormalinaSigma-AldrichHT5014Roztwór do utrwalania komórek
siRNA ukierunkowany na Dectin-1Santa-Cruzsc-63276 
*siGenome* Nieukierunkowana pula siRNA DharmaconD-001206-14 
RyfampicynaSigma-AldrichR3501antybiotyk
Izoniazyd (INH)Sigma-AldrichI3377-50Gantybiotyk
Hygromycyna BLife Technologies10687-010antybiotyk
AmikacynaSigma-AldrichA1774antybiotyk
Automatyczny mikroskop konfokalny OPERAPerkinElmerAkwizycja obrazu
Columbus 2.3.1 Serwerowa baza danychPerkinElmerPrzesyłanie, przechowywanie i analiza danych
Oprogramowanie Acapella 2.6PerkinElmerAnaliza obrazowa
Oprogramowanie GraphPad Prism5GraphPadAnaliza statystyczna
Excel 2010MicrosoftAnaliza statystyczna
z powłoką TC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intracellular Mycobacteria QuantificationHigh throughput ScreeningConfocal MicroscopyGFP expressing MycobacteriumHost Cell InfectionsiRNA Library ScreeningChemical Compound ScreeningAutomated Image AnalysisBacterial Area Per CellDose Response Curve

Related Articles