Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo dostępności terapii i szczepionek, gruźlica (TB) pozostaje jedną z najbardziej śmiertelnych i rozpowszechnionych infekcji bakteryjnych na świecie. Od kilkudziesięciu lat nagły wybuch szczepów wielolekoopornych i intensywnie lekoopornych stanowi poważne zagrożenie dla zwalczania gruźlicy. W związku z tym konieczne jest zidentyfikowanie nowych celów i szlaków krytycznych dla czynnika wywołującego gruźlicę, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), oraz poszukiwanie nowych substancji chemicznych, które mogłyby stać się lekami na gruźlicę. Jednym z podejść jest stworzenie metod odpowiednich dla genetycznych i chemicznych badań przesiewowych w dużych bibliotekach umożliwiających poszukiwanie igły w stogu siana. W tym celu opracowaliśmy test fenotypowy polegający na wykrywaniu znakowanego fluorescencyjnie Mtb w znakowanych fluorescencyjnie komórkach gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej. Ten test in vitro pozwala na ilościową identyfikację procesu kolonizacji Mtb do gospodarza na podstawie obrazu i został zoptymalizowany pod kątem formatu mikropłytki 384-dołkowej, który jest odpowiedni dla badań przesiewowych bibliotek siRNA, związków chemicznych lub mutantów Mtb. Obrazy są następnie przetwarzane do analizy wieloparametrycznej, która umożliwia odczytanie wniosków na temat patogenezy Mtb w komórkach gospodarza.
Wprowadzenie
Wśród pojawiających się i ponownie pojawiających się patogenów zakaźnych zgłoszonych w ostatnich latach, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) zajmuje czołowe miejsce, odpowiadając za 1,4 miliona zgonów i 8,7 miliona nowych infekcji w 2011 roku (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Pomimo dostępności terapii wielolekowych, liczba zakażonych osób wciąż rośnie, a wielolekooporne (MDR) oraz wysoce lekooporne (XDR) Mtb szybko rozprzestrzeniają się na całym świecie1. Co więcej, biorąc pod uwagę obecność antygenów Mtb, oczywiste jest, że jedna trzecia światowej populacji jest uważana za utajoną zakażoną Mtb. Statystycznie w jednym przypadku na dziesięć następuje ewolucja w kierunku aktywnej postaci choroby z późniejszymi objawami klinicznymi2. Dlatego pilnie potrzebne są nowe środki do walki z Mtb. W tym kontekście opracowaliśmy wizualny test fenotypowy in vitro, opierający się na monitorowaniu inwazji i namnażania Mtb do komórek gospodarza za pomocą zautomatyzowanej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej3. Adaptacja testu na 384-dołkowych płytkach mikromiareczkowych w połączeniu z automatyczną akwizycją i analizą obrazu umożliwiła przeprowadzenie badań przesiewowych o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości (HC/HTS) bibliotek średniego skali związków, siRNA i mutantów bakteryjnych. Badania przesiewowe biblioteki RNAi obejmującej cały genom w tym teście fenotypowym umożliwiły zatem identyfikację kluczowych czynników gospodarza zaangażowanych w transport Mtb i replikację wewnątrzkomórkową, ale także wyjaśnienie szlaków gospodarza wykorzystywanych przez prątki gruźlicy. Kolejną adaptacją tego konkretnego testu fenotypowego była identyfikacja czynników bakteryjnych niezbędnych do utrzymania się Mtb w obrębie fagosomalów. Na przykład zatrzymanie dojrzewania fagosomów jest uważane za jeden z głównych mechanizmów ułatwiających przetrwanie i replikację Mtb w makrofagach. Monitorowanie subkomórkowej lokalizacji mutantów nokautujących Mtb w znakowanych fluorescencyjnie kompartmentach kwasowych pozwoliło na identyfikację genów bakteryjnych zaangażowanych w proces przeżycia4. Wreszcie, obrazowanie Mtb o wysokiej zawartości stanowi również doskonałą metodę ilościowego określania skuteczności leku w hamowaniu różnych zjawisk, takich jak wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii3. Ogólnie rzecz biorąc, ten rodzaj wysokoprzepustowego testu fenotypowego pozwala przyspieszyć odkrywanie leków przeciwko gruźlicy, a dane zebrane za pomocą tych różnych podejść przyczyniają się do lepszego zrozumienia manipulacji gospodarza wywieranej przez Mtb.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wysoko-przepustowy przesiew siRNA w całym genomie
Przesiew przeprowadzony w modelu ludzkich pneumocytów typu II (linia komórkowa A549) po zakażeniu szczepem Mtb H37Rv wykazującym ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Procedura ta została przedstawiona na Rysunku 1A.
- Resuspend liofilizowaną bibliotekę siRNA przechowywaną na płytkach matkami (płytki 96-dołkowe) w 1x buforze siRNA do osiągnięcia stężenia 4 μM, a następnie przenieś 10 μl mieszaniny do 384-dołkowej płytki potomnej (płytka potomna 1).
- Dodaj 10 μl 1x buforu siRNA do płytki potomnej 1, aby dwukrotnie rozcieńczyć siRNA. Po resuspensji siRNA płytki należy zamknąć odrywaną aluminiową folią uszczelniającą; można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy, a maksymalnie 2-3 lata, jednak czas przechowywania może różnić się w zależności od zaleceń producenta biblioteki siRNA.
- Rozcieńcz siRNA z płytki potomnej 1 do płytki potomnej 2, aby osiągnąć stężenie 500 nM. Po resuspensji siRNA płytki należy zamknąć odrywaną aluminiową folią uszczelniającą; można je przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy, a maksymalnie 2-3 lata, jednak czas przechowywania może różnić się w zależności od zaleceń producenta biblioteki siRNA.
- Przed użyciem odmroź płytkę potomną 2 w temperaturze pokojowej.
- Pobierz 2,5 μl siRNA z płytki potomnej 2 i przenieś do 384-dołkowej płytki analitycznej.
- Do tej samej 384-dołkowej płytki analitycznej z kroku 1.5 dodaj 2,5 μl siRNA kontroli negatywnej i pozytywnej do odpowiednich dołków.
- Rozcieńcz odczyn do transfekcji w 1x D-PBS, aby uzyskać ilość roztworu pozwalającą na dodanie 0,1 μl odczynu do transfekcji do każdego dołka, a następnie inkubuj rozcieńczony roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 min.
- Dodaj 7,5 μl mieszaniny odczynu do transfekcji z roztworem PBS do każdego dołka w płytce analitycznej i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 40 μl komórek A549 (1 500 komórek/dołek) zawieszonych w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubuj komórki przez 3 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Komórki te dzielą się co 24 h, zatem trzy dni po transfekcji w dołkach znajduje się około 12 000 komórek.
- Wypłucz dwutygodniową kulturę Mtb H37Rv ekspresującą GFP za pomocą D-PBS (wolnego od MgCl2 i CaCl2), wirując przy 4 000 x g przez 5 min, a następnie odlej płukanki. Powtórz ten krok 3x. (Warunki hodowli kultury GFP-Mtb H37Rv opisano w Protokole 3).
- Zawieś osad bakteryjny w 10 ml podłoża RPMI 1640 uzupełnionego o 10% FBS i pozostaw na 1 h w temperaturze pokojowej, aby agregaty bakteryjne mogły ososiąść.
- Zbierz nadsącz bakteryjny i zmierz OD600 (OD600 powinno wynosić od 0,6 do 0,8) oraz fluorescencję GFP (wartość RFU) za pomocą czytnika mikroplatek, aby określić stężenie bakterii. Oblicz miano zawiesiny, korzystając z referencyjnej linii regresji dla wartości RFU = f (wartości CFU), która została wygenerowana przed eksperymentem dla innej kultury przygotowanej w tych samych warunkach. Przygotuj zawiesinę bakteryjną zawierającą 2,4 x 106 bakterii/ml, co odpowiada wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5.
- Usuń podłoże z 384-dołkowej płytki analitycznej i dodaj 25 μl świeżo przygotowanej zawiesiny bakteryjnej.
- Inkubuj 384-dołkową płytkę analityczną w temperaturze 37 °C przez 5 h w atmosferze zawierającej 5% CO2.
- Usuń podłoże i delikatnie wypłucz komórki 3x podłożem RPMI uzupełnionym o 10% FBS.
- Aby zabić pozostałe bakterie pozakomórkowe, potraktuj komórki 50 μl świeżego podłoża RPMI-FBS zawierającego 50 μg/ml amikacyny w temperaturze 37 °C przez 1 h w atmosferze zawierającej 5% CO2.
- Usuń podłoże zawierające amikacynę i dodaj 50 μl świeżego podłoża RPMI uzupełnionego o 10% FBS. Inkubuj 384-dołkową płytkę analityczną w temperaturze 37 °C przez 5 dni w atmosferze zawierającej 5% CO2.
- Przed akwizycją obrazów dodaj 10 μl świeżo przygotowanego roztworu DAPI o stężeniu 30 μg/ml w PBS (stężenie końcowe 5 μg/ml) i inkubuj przez 10 min w temperaturze 37 °C.
- Włóż płytkę do automatycznego mikroskopu konfokalnego.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz. - Ustaw parametry ekspozycji. Zarejestruj fluorescencję DAPI, używając lasera wzbudzającego 405 nm z filtrem emisyjnym 450 nm, oraz fluorescencję GFP, używając lasera wzbudzającego 488 nm z filtrem emisyjnym 520 nm.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz. - Wybierz dołki oraz pola w każdym dołku, które mają zostać zarejestrowane; parametry te określa się jako layout i sublayout.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz. - Wygeneruj plik eksperymentu, korzystając z parametrów z kroków 1.20 i 1.21, i uruchom automatyczną akwizycję obrazów.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz. - Prześlij obrazy na zdalny serwer.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz. - Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Wykryj jądra komórkowe z kanału DAPI, korzystając z algorytmu detekcji jąder, oraz obszary bakteryjne z kanału GFP, korzystając z algorytmu właściwości intensywności pikseli (Ryc. 4A).
Uwaga: Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem badania wpływu wyciszania genów na wewnątrzkomórkowy wzrost Mtb. Mtb jest bakterią wolno rosnącą, która w optymalnych warunkach dzieli się co 20 hr. Po 5 dniach od zakażenia ilość zewnątrzkomórkowych Mtb w przypadku braku lizy komórek jest wciąż niska i nie wpływa na jakość analizy. Protokół ten musi zostać zoptymalizowany pod kątem czasu leczenia antybiotykiem oraz czasu inkubacji, aby można go było zaadaptować do przesiewów siRNA z wykorzystaniem szybko rosnących bakterii, takich jak Mycobacteria smegmatis i Escherichia coli, które są w dużym stopniu uwalniane i mogą infekować nowe komórki.
2. Wysokoprzepustowy screening związków
Przesiew wykonany na komórkach gospodarza zainfekowanych Mtb H37Rv. Procedura ta została przedstawiona na Rysunku 1B.
- Rozmrozić płytki macierzyste 384-dołkowe zawierające bibliotekę związków rozpuszczonych w 100% DMSO. Przenieść 0,5 μl związków do płytek potomnych 384-dołkowych zawierających 10 μl pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS.
- Wypłukać dwutygodniową kulturę Mtb H37Rv wykazującą ekspresję GFP za pomocą D-PBS (wolnego od MgCl2 i CaCl2), wirując przy 4 000 x g przez 5 min, a następnie usunąć płukania. Powtórzyć ten krok 3x (Warunki hodowli kultury GFP-Mtb H37Rv opisano w Protokole 3).
- Resuspendować pellet bakteryjny w 10 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS i pozostawić na 1 h w temperaturze pokojowej, aby agregaty bakteryjne mogły osadzić się na dnie.
- Zebrać supernatant bakteryjny i zmierzyć OD600 (OD600 powinno wynosić od 0,6 do 0,8) oraz fluorescencję GFP (wartość RFU) za pomocą czytnika mikropłytek. Obliczyć miano zawiesiny, korzystając z referencyjnej linii regresji przedstawiającej zależność RFU = f (wartość CFU), która została wygenerowana przed eksperymentem. Typowe stężenie wynosi 1 x 108 bakterii/ml.
- Zebrać 6-dniowe pierwotne ludzkie makrofagi w stężeniu 4 x 105 komórek/ml w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płatowej surowicy bydlęcej (FBS) i 50 ng/ml rekombinowanego ludzkiego M-CSF (Oczyszczanie ludzkich monocytów z krwi obwodowej i różnicowanie makrofagów opisano w Protokole 4).
- Inkubować rozcieńczone komórki pierwotne z prątkami przy różnych MOI, w zakresie od 1 do 5, w zawiesinie przy łagodnym wytrząsaniu z prędkością 90 rpm przez 2 h w 37 °C.
- Wypłukać zainfekowane komórki poprzez wirowanie przy 350 x g, aby usunąć bakterie z przestrzeni pozakomórkowej. Po każdym etapie wirowania resuspendować pellet w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS. Powtórzyć ten krok 2x.
- Resuspendować zainfekowane komórki w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS oraz amikacynę w stężeniu 50 μg/ml i inkubować zawiesinę przy łagodnym wytrząsaniu przez 1 h w 37 °C.
- Usunąć pożywkę hodowlaną zawierającą amikacynę poprzez wirowanie przy 350 x g i wypłukać zainfekowane komórki pełną pożywką RPMI 1640 uzupełnioną o 10% FBS i 50 ng/ml rekombinowanego ludzkiego M-CSF. Powtórzyć raz.
- Dodać 40 μl zawiesiny zainfekowanych makrofagów do tej samej płytki testowej z kroku 2.1, która zawiera już 10 μl rozcieńczeń związków. Końcowe stężenie DMSO w każdej studience osiągnęło teraz poziom 1%.
- Inkubować płytki testowe przez 5 dni w 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2.
- Przebarwić żywe komórki przenikającym przez błony komórkowe dalekoczerwonym barwnikiem fluorescencyjnym.
- Włożyć płytkę do zautomatyzowanego mikroskopu konfokalnego.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Ustawić parametry ekspozycji. Rejestrować fluorescencję dalekoczerwoną przy użyciu lasera wzbudzającego 640 nm z filtrem emisyjnym 690 nm oraz fluorescencję GFP przy użyciu lasera wzbudzającego 488 nm z filtrem emisyjnym 520 nm.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Wybrać studzienki oraz pola w każdej studience do akwizycji, co określa się jako parametry układu (layout) i podukładu (sublayout).
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Wygenerować plik eksperymentu, korzystając z parametrów z kroków 2.14 i 2.15, i uruchomić automatyczną akwizycję.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Przenieść obrazy na serwer zdalny.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz. - Przeanalizować obrazy przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Wykryć obszar komórek z kanału dalekoczerwonego za pomocą algorytmu właściwości intensywności pikseli oraz obszar bakteryjny z kanału GFP za pomocą algorytmu właściwości intensywności pikseli (Rysunek 4B).
Uwaga: Protokół ten można dostosować do przesiewu biblioteki mutantów Mtb, zastępując związki mutantami wykazującymi ekspresję białka fluorescencyjnego (jedna studzienka/jeden mutant) (Rysunek 1C, patrz również Brodin et al.4). Mutanty fluorescencyjne są najpierw wysiewane do studni (20 μl zawiesiny bakteryjnej na studninkę). Następnie bakterie są odzyskiwane za pomocą 30 μl zawiesiny komórkowej. Po wirowaniu przy 350 x g przez 1 min płytkę inkubuje się w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Czas inkubacji oraz MOI zależą od rodzaju analizy. Przykładowo, w celu wizualizacji wczesnych zdarzeń komórkowych, takich jak zakwaszanie fagosomu, komórki mogą być infekowane przez 2 hr przy MOI w zakresie 1-20. Lizosomy barwi się barwnikiem Lysotracker w stężeniu 2 μM przez 1,5 hr w 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2, a następnie utrwala za pomocą 10% formaliny lub 4% paraformaldehydu (PFA). Nabywa się obrazy konfokalne, które następnie analizuje się za pomocą skryptów analizy obrazu wykorzystujących odpowiednie algorytmy do detekcji lizosomów i lokalizacji wewnątrzkomórkowej4.
3. Warunki hodowli szczepu Mycobacterium tuberculosis H37Rv wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP-H37Rv)
Do długoterminowego przechowywania szczepy GFP-H37Rv zamrożono w D-PBS (około 1 x 108 prątków na fiolkę).
- Resuspenduj jedną zamrożoną ampułkę z zapasem GFP-H37Rv w kolbie Erlenmeyera zawierającej 50 ml pożywki płynnej 7H9 uzupełnionej o 10% wzbogacacza Middlebrook OADC, 0,5% glicerolu, 0,05% Tween-80 oraz hygromycinę B (50 μg/ml).
- Inkubuj przez 8 dni w temperaturze 37 °C.
- Zmierz OD600 hodowli GFP-H37Rv.
- Rozcieńcz hodowlę GFP-H37Rv, aby uzyskać OD600 = 0,1 w świeżej pożywce płynnej 7H9 uzupełnionej o 10% wzbogacacza Middlebrook OADC, 0,5% glicerolu, 0,05% Tween-80 oraz hygromycinę B (50 μg/ml).
- Inkubuj GFP-H37Rv w temperaturze 37 °C przez kolejne 8 dni przed użyciem do analizy.
4. Oczyszczanie monocytów z krwi obwodowej człowieka z krwi pełnej lub preparatu warstwy leukocytarnej
- Rozcieńczyć worek z krwią 2x w 1x D-PBS (wolnym od MgCl2 i CaCl2) zawierającym 1% FBS.
- Wyizolować monocyty za pomocą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll przy 400 x g przez 20 min.
- Zebrać wyizolowane monocyty.
- Przemyć monocyty 3x za pomocą 1x D-PBS (wolnego od MgCl2 i CaCl2) zawierającego 1% FBS, wirując przy 400 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
- Skoncentrować komórki do stężenia 1 x 107 komórek/ml.
- Oczyścić monocyty przy użyciu kulek magnetycznych CD14 zgodnie z protokołem producenta (patrz Materiały).
- Po oczyszczaniu monocytów CD14 wysiać komórki w stężeniu 1,5 x 106 komórek/ml w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS i 40 ng/ml ludzkiego czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów (hM-CSF), a następnie inkubować przez 4 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2.
- Po 4 dniach wymienić pożywkę na świeżą RPMI 1640 uzupełnioną o 10% FBS i 40 ng/ml hM-CSF i inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2.
- Po 6 dniach komórki można wykorzystać do analizy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wysokoprzepustowy screening siRNA w całym genomie
Mtb jest w stanie kolonizować komórki odpornościowe in vitro, jak również kilka innych komórek nabłonkowych płuc. Na przykład Mtb potrafi infekować i uszkadzać komórki nabłonkowe A549, które są powszechnie stosowane jako model ludzkich pneumocytów typu II5-7. Wykazano, że Dectin-1 jest receptorem komórkowym gospodarza zaangażowanym w pobieranie Mtb, odpowiedź prozapalną oraz efekt przeciwbakteryjny w ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy tutaj metody wymagane do testu fenotypowego z wykorzystaniem szczepu Mtb H37Rv z ekspresją GFP do infekowania znakowanych fluorescencyjnie komórek gospodarza, co czyni go odpowiednim do badań przesiewowych o wysokiej zawartości/wysokiej przepustowości. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy związków, sond fluorescencyjnych i mutantów Mtb . Dla każdego opisanego powyżej protokołu można przeprowadzić etapy fiksacji i znakowania immunologicznego przed akwizycją obrazu. Do pozyskiwania ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Wsparcie finansowe dla tej pracy zostało zapewnione przez Wspólnotę Europejską (Grant ERC-STG INTRACELLTB nr 260901, Grant MM4TB nr 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) oraz Region Nord Pas de Calais. Wyrażamy wdzięczność za pomoc techniczną ze strony Gasparda Deloisona, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanniego i Franka Lafonta z platformy BICeL.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| &mikro; przezroczysta płytka, 384-dołkowa | Greiner Bio-One | 781091 | 127,8/86/15 MM z pokrywką, |
| 384-dołkowa płytka CellCarrier | PerkinElmer | 6007550 | , przezroczysta z dnem, z pokrywką, z dnem w kształcie litery V poddanym obróbce TC |
| , biała, płytka 384-dołkowa | Greiner Bio-One | 781280 | |
| taśma uszczelniająca, oddychająca, sterylna | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Odczynnik do transfekcji |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Pożywka do hodowli komórkowych |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco' s Bufor do zasolenia fosforanów |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco' s Bufor fosforanowy Salin |
| Płodowa surowica bydlęca | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll do oczyszczania komórek monocytów krwi obwodowej |
| Mikrogranulki CD14, ludzkie | Miltenyi | 130-050-201 | Oczyszczanie monocytów CD14 + |
| Ludzki M-CSF, premium gr. (1000 μ g) | Miltenyi | 130-096-493 | Kolumny LS czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów |
| Miltenyi | 130-042-401 | Kolumny do izolacji monocytów CD14 + | |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Kultura prątków |
| Glicerol o wysokiej czystości | Euromedex | 50405-EX | Hodowla prątków |
| Wzbogacenie Middlebrook OADC | Becton-Dickinson | 211886 | Hodowla prątków |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Kultura prątków |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Barwnik jąder |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Barwnik jąder |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Barwnik jądrowy/cytoplazmatyczny |
| Formalina | Sigma-Aldrich | HT5014 | Roztwór do utrwalania komórek |
| siRNA ukierunkowany na Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nieukierunkowana pula siRNA | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Ryfampicyna | Sigma-Aldrich | R3501 | antybiotyk |
| Izoniazyd (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antybiotyk |
| Hygromycyna B | Life Technologies | 10687-010 | antybiotyk |
| Amikacyna | Sigma-Aldrich | A1774 | antybiotyk |
| Automatyczny mikroskop konfokalny OPERA | PerkinElmer | Akwizycja obrazu | |
| Columbus 2.3.1 Serwerowa baza danych | PerkinElmer | Przesyłanie, przechowywanie i analiza danych | |
| Oprogramowanie Acapella 2.6 | PerkinElmer | Analiza obrazowa | |
| Oprogramowanie GraphPad Prism5 | GraphPad | Analiza statystyczna | |
| Excel 2010 | Microsoft | Analiza statystyczna |
Bibliografia
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych mykobakteriiwysokoprzepustowe przesiewaniemikroskopia konfokalnaMycobacterium wyrażające GFPinfekcja komórek gospodarzaprzesiewanie biblioteki siRNAprzesiewanie związków chemicznychzautomatyzowana analiza obrazupowierzchnia bakteryjna na komórkękrzywa zależności dawka-odpowiedź
