Produkcja RNA do analizy transkryptomicznej z ciał komórek neuronów ruchowych rdzenia kręgowego myszy za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego

Podsumowanie

Wysokiej jakości całkowite RNA zostało przygotowane z ciał komórkowych mysich neuronów ruchowych rdzenia kręgowego za pomocą laserowej mikrodysekcji po zabarwieniu odcinków rdzenia kręgowego Azure B w 70% etanolu. Wystarczająca ilość RNA (~40-60 ng) jest odzyskiwana z 3 000-4 000 neuronów ruchowych, aby umożliwić dalszą analizę RNA za pomocą sekwencji RNA i qRT-PCR.

Streszczenie

Przygotowanie wysokiej jakości RNA z interesujących komórek jest kluczowe dla precyzyjnej i znaczącej analizy różnic transkrypcyjnych między typami komórek lub między tym samym typem komórki w zdrowiu i chorobie lub po leczeniu farmakologicznym. W rdzeniu kręgowym takie przygotowanie z neuronów ruchowych, celu zainteresowania w wielu chorobach neurologicznych i neurodegeneracyjnych, komplikuje fakt, że neurony ruchowe stanowią <10% całej populacji komórek. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LMD) została opracowana w celu rozwiązania tego problemu. Tutaj opisujemy protokół szybkiego odzyskiwania, zamrażania i cięcia rdzenia kręgowego myszy w celu uniknięcia uszkodzenia RNA przez endogenne i egzogenne RNazy, a następnie barwienie Azure B w 70% etanolu w celu identyfikacji neuronów ruchowych przy jednoczesnym utrzymaniu endogennej RNazy w stanie zahamowania. LMD jest następnie używany do wychwytywania barwionych neuronów bezpośrednio do buforu lizy tiocyjanianu guanidyny, utrzymanie integralności RNA. Standardowe techniki są stosowane do odzyskiwania całkowitego RNA i pomiaru jego integralności. Materiał ten może być następnie wykorzystany do dalszej analizy transkryptów za pomocą sekwencji RNA i qRT-PCR.

Wprowadzenie

W tkankach ssaków składających się z wielu różnych typów komórek, pojawienie się oprzyrządowania do mikrodysekcji wychwytu laserowego (LMD) dało możliwość wybrania określonego typu komórki do analizy na poziomie RNA lub białka. Obecnie techniki amplifikacji i sekwencjonowania nowej generacji umożliwiają wykorzystanie puli całkowitego RNA z kilku tysięcy komórek w celu uzyskania stosunkowo dokładnej inwentaryzacji transkryptomu. w tym ocena względnych poziomów RNA i identyfikacja różnych form splicingowych. Do tej pory analizy proteomiczne kilku tysięcy komórek sięgały tylko do liczniejszych gatunków. Na przykład zidentyfikowaliśmy <1000 najliczniejszych białek z 3000-4000 ciał komórkowych neuronów ruchowych (nie pokazano), a Zhu i współpracownicy niedawno poinformowali o zidentyfikowaniu 2665 białek z ~15 000 komórek nowotworowych¹. Jednak wraz z dalszym rozwojem spektrometrii mas jest prawdopodobne, że takie analizy będą obejmować znacznie większą głębokość.

W tym miejscu przedstawiamy specyficzny protokół stosowany do LMD ciał komórek neuronów ruchowych z rdzenia kręgowego myszy, a następnie przygotowania RNA. Protokół ten został wykorzystany w kontekście porównania RNA z neuronów ruchowych myszy z przedobjawowym transgenicznym mutantem dysmutazy ponadtlenkowej (SOD)1 stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) z RNA przygotowanymi z transgenicznego szczepu SOD1 typu dzikiego zarówno przez walidację sekwencjonowania RNA, jak i qRT-PCR². Warto zauważyć, że neurony ruchowe w przednim rogu istoty szarej rdzenia kręgowego stanowią <10% całej populacji komórek, otoczonych morzem astrocytów, i jako takie, ich profilu transkrypcyjnego nie można łatwo rozwikłać na podstawie badań całego rdzenia. Podejście do wychwytywania laserowego jest zatem idealne do analizy ekspresji RNA w tych komórkach. z fizjologią zachowaną przez szybkie wycięcie i zamrożenie pępowiny po krótkiej wewnątrzsercowej perfuzji soli fizjologicznej. Somaty neuronów ruchowych są duże i dlatego są łatwo wykrywalne, tutaj przy użyciu barwnika, który ma silne powinowactwo do neuronów³. Ponadto, przy takiej wielkości, komórki te dostarczają stosunkowo dużą ilość RNA na przechwyconą komórkę. Zastosowana procedura, Jak opisano poniżej, można je łatwo dostosować w celu uzyskania innych typów komórek neuronalnych, a także potencjalnie innych typów komórek, specyficznie zidentyfikowanych za pomocą technik barwienia barwnikiem lub barwienia przeciwciałami.

Protokół

Opisane tutaj procedury znieczulenia, eutanazji i perfuzji serca myszy zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yale.

1. Przygotowanie urządzeń i roztworów wolnych od RNaz

1. RNaza jest powszechnym zanieczyszczeniem wszystkich powierzchni laboratoryjnych, w tym blatów stołowych, mikropipet i badacza.
   1. Często zmieniaj rękawiczki lub regularnie przecieraj roztworem odkażającym RNAzą.
   2. Narzędzia do preparowania i naczynia szklane ze stali nierdzewnej mogą być wolne od RNaz poprzez ogrzewanie w temperaturze >200 °C przez 1 godzinę lub dłużej. Uwaga: Sterylizacja parowa nie niszczy RNazy. Alternatywnie przetrzyj roztworem odkażającym RNazę, a następnie 70% etanolem bez RNaz i wysusz na powietrzu.
   3. Przetrzyj blaty stołów, inne powierzchnie laboratoryjne i mikropipety roztworem odkażającym RNazę, a następnie 70% etanolem wolnym od RNaz. Wyznacz konkretny stół laboratoryjny lub obszar roboczy do odzyskiwania i analizy RNA. Uwaga: Przed wytarciem trzonków pipetorów należy wyjąć wyrzutniki końcówek i pozostawić je zdjęte, jeśli to możliwe.
   4. Używaj probówek, probówek do mikrowirówek, pipet i końcówek do mikropipet, które są certyfikowane przez producenta jako wolne od RNaz. Zaleca się stosowanie końcówek i mikroprobówek o bardzo niskim poziomie wiązania. Jeśli to możliwe, używaj świeżo otwartych pudełek lub toreb z tymi składnikami i przechowuj je oddzielnie od ogólnego zaopatrzenia laboratoryjnego.
   5. Uzyskaj roztwory wolne od RNaz [PBS (PBS) bez wapnia i magnezu firmy Dulbecco, etanol, 70% etanol bez RNaz] ze źródeł komercyjnych. Do każdego eksperymentu używaj nowo otwartych butelek.
2. Źródło barwnika Azure B ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego odzyskania nienaruszonego RNA. Przetestuj każdą partię barwnika przed przekazaniem cennych próbek do barwienia i zbierania. Zbierz kilka tysięcy neuronów od zwierzęcia niedoświadczalnego, przygotuj RNA i określ integralność RNA zgodnie z poniższym opisem, aby znaleźć taki, który konsekwentnie wytwarza liczby RIN powyżej 8,5.
   1. Rozpuść barwnik Azure B (1%, wag./obj.) w 70% etanolu bez RNaz, zwykle 0,3 g w 30 ml etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj na bujaku w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu, gdy wszystkie cząstki się rozpuszczą. Jedna tubka tego roztworu może być używana do barwienia wielu szkiełek bez wpływu na intensywność barwienia.
   2. Na wszelki wypadek należy użyć innej tubki z barwnikiem dla każdej kontrpróby biologicznej.
3. Użyj krioform i O.C.T. do zatapiania odcinków przewodu bez dalszej obróbki.
4. Utrzymywać kriostat w temperaturze od -20 do -24 °C. Po pokrojeniu na sekcje umieścić szkiełka w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż do przygotowania wystarczającej liczby. Przygotowanie RNA należy rozpocząć jak najszybciej po wykonaniu preparatów. W przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać niepodzielone lub częściowo podzielone bloki OCT, a nie szkiełka, w temperaturze 80 °C.
5. Przygotuj bufor tiocyjanianu guanidyny do przygotowania RNA z wypreparowanych neuronów ruchowych, korzystając z roztworów dostarczonych przez producenta zestawu do przygotowania RNA zgodnie z jego wskazówkami.

2. Przygotowanie odcinków rdzenia kręgowego od myszy (Rysunek 1A)

1. Wyczyść wszystkie narzędzia do preparowania, szkiełka szklane, żyletki i platformę preparacyjną, piecząc lub wycierając roztworem odkażającym RNazę, a następnie 70% etanolem wolnym od RNaz. Pozostaw do wyschnięcia na 2 minuty. Utrzymuj wszystko wolne od kurzu, przykrywając chusteczkami laboratoryjnymi.
2. Procedury obchodzenia się ze zwierzętami, w tym znieczulenie, perfuzja serca i eutanazja, powinny być przeprowadzane zgodnie z wymaganiami lokalnego instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC), w celu szybkiego doprowadzenia zwierzęcia do punktu rozwarstwienia rdzenia kręgowego.
   1. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (ip) wstrzyknięcie śmiertelnej dawki ketaminy (450 mg/kg).
   2. Po osiągnięciu głębokiego poziomu znieczulenia i potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca, umieść mysz brzuszną stroną do góry na platformie preparacyjnej (na przykład płycie styropianowej), otwórz jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce i włóż igłę motylkową 27 G z zestawu do infuzji do lewej komory (która znajduje się po prawej stronie badacza). Naciąć prawy przedsionek ostrymi kleszczami i perfuzjonować PBS z szybkością 5-7 ml/min przez około 2 minuty za pomocą pompy perystaltycznej. Płyn wypływający z przedsionka powinien być w tym miejscu w dużej mierze wolny od krwi.
   3. Wyjmij igłę perfuzyjną, odetnij głowę myszy i odwróć ją na desce do sekcji. Otwórz skórę, aby odsłonić kręgosłup, użyj małych nożyczek i kleszczy, aby usunąć kręgi i wyjmij rdzeń kręgowy, przecinając korzenie nerwowe ostrymi kleszczami. Szybkość i praktyka są niezbędne w poruszaniu się od początku perfuzji do usunięcia pępowiny; Nie powinno to zająć więcej niż 7 minut.
   4. Opłucz pępowinę przez 10 sekund w wodzie wolnej od RNaz, aby zmyć resztki krwi. Połóż rdzeń kręgowy na szkiełku podstawowym bez RNaz za pomocą zakrzywionych kleszczy bardzo delikatnie, ale szybko. Podziel rdzeń kręgowy poprzecznie za pomocą czystej żyletki na 9-10 części.
   5. Umieść kawałki w krioformsie wypełnionym O.C.T. za pomocą tych samych kleszczy i wyrównaj je pionowo za pomocą czystej igły. Umieść formę w płytkiej tacy zawierającej 2-metylobutan wstępnie schłodzony ciekłym azotem, a następnie umieść tacę w kąpieli z ciekłym azotem, aby szybko zamrozić kawałki rdzenia kręgowego, aby uniknąć degradacji RNA.
   6. Blok osadzony w OCT należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy przed cięciem. Proces od pobrania pępowiny do zamrożenia powinien zostać przeprowadzony w ciągu 5 minut, aby zachować integralność RNA.
3. Kriosekcja bloku osadzonego w O.C.T. w temperaturze -20 °C za pomocą kriostatu w celu wytworzenia 20 μm warstw, z których każda zawiera 9-10 przekrojów poprzecznych rdzenia kręgowego, na wolnych od RNaz membranach PEN 2 μm utrzymywanych początkowo w temperaturze pokojowej, aby zapewnić, że sekcje przylegają do szkiełka. Natychmiast ponownie zamrozić sekcję na powierzchni o temperaturze -20 °C wewnątrz kriostatu. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Barwienie odcinków rdzenia kręgowego (Rysunek 1A)

1. Na czystym ruszcie ułóż sześć stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Napełnij je wszystkie 25-30 ml 70% etanolu bez RNaz, tak aby głębokość była wystarczająca do pokrycia wszystkich sekcji na szkiełku, gdy szkiełko jest zanurzone. Przygotuj 30-35 ml 1% roztworu Azure B zgodnie z wcześniejszym opisem i trzymaj go na tym samym stojaku, aby zminimalizować czas między wymianą roztworów podczas prania lub barwienia. Trzymaj trzy lub cztery chusteczki laboratoryjne przed stojakiem, aby szybko spuścić dodatkowy roztwór.
2. Wyjmij szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C na suchy lód. Rozmrozić jedno szkiełko, umieszczając je na dłoni w rękawiczce. Usuń większość wilgoci i kondensatu ze szkiełka, wycierając je chusteczką laboratoryjną, uważając, aby nie dotknąć sekcji. Umieść szkiełko na świeżym środku osuszającym z żelem krzemionkowym na szalce Petriego na 30-40 sekund do całkowitego wyschnięcia. Jeśli wilgotność w laboratorium jest wysoka, można zastosować krótkie leczenie w eksykatorze próżniowym w celu szybszego wysuszenia szkiełka.
3. Mycie i barwienie.
   1. Zanurz wysuszone szkiełko w pierwszej probówce z 70% etanolem bez RNaz. Namocz szkiełko przez 30 sekund, a następnie umyj szkiełko, aby usunąć OCT, zanurzając je w górę iw dół na 45-60 sekund . Wyjmij szkiełko z roztworu i spuść nadmiar płynu na chusteczki laboratoryjne. Powtórz ten sam proces, zanurzając szkiełko w drugiej probówce z 70% etanolem. Jeśli OCT wokół odcinków rdzenia kręgowego nie zniknął całkowicie, powtórz mycie w trzeciej rurce.
   2. Po spuszczeniu nadmiaru płynu zanurz szkiełko w 1% roztworze Azure B w 70% etanolu wolnym od RNaz na 30-45 sekund. Odcedź nadmiar Azure B na chusteczce laboratoryjnej; w tym momencie cały slajd będzie niebieski.
   3. Zanurz szkiełko w następnej tubce z 70% etanolem i zanurz szybko w górę iw dół 3-4 razy, aby usunąć nadmiar barwnika i uwidocznić specyficzne zabarwienie neuronów ruchowych. Jeśli skrawki wyglądają na bardzo ciemno poplamione, powtórz etap odbarwiania w świeżej tubce z 70% etanolem. Jeśli zabarwienie wydaje się zbyt jasne, włóż szkiełko z powrotem do roztworu Azure B na kolejne 30 sekund i powtórz odbarwienie. Zetrzyj nadmiar etanolu i wysusz szkiełko na powietrzu przez ~40 sekund, aż cały płyn zniknie. Istota szara będzie jasnoniebieska, podczas gdy neurony ruchowe będą zabarwione na ciemnoniebiesko, co jest łatwo widoczne. Natychmiast rozpocznij preparację.

4. Mikrodysekcja laserowa (LMD) (Rysunek 1B)

1. Włącz mikroskop i rozładuj uchwyt probówki, aby założyć nasadkę probówki do mikrofugi o pojemności 0,6 ml w celu pobrania próbki. Umieść 30 μl buforu do lizy tiocyjanianu guanidyny w nasadce probówki do mikrofugi o pojemności 0,6 ml. Pokryj powierzchnię nakrętki płynem, rozprowadzając roztwór za pomocą końcówki pipety. W ten sposób wszystkie zebrane neurony zostaną rozpuszczone w roztworze rozpuszczającym podczas ich sekcji. Dopasuj nasadkę do otworu, a obiektyw do oprogramowania mikroskopu. Trzymaj nasadkę w zakrytej pozycji do momentu rozpoczęcia przechwytywania laserowego.
2. Umieść wysuszony na powietrzu szkiełko na stoliku mikroskopu LMD do góry nogami, tak aby membrana szkiełka PEN była skierowana w dół. Membrana z sekcjami powinna być skierowana w stronę otworu, pod którym znajduje się rurka zbiorcza.
3. Włącz laser na 10 minut przed rozpoczęciem przygotowania preparatów. Skoncentruj się na odcinku rdzenia kręgowego za pomocą obiektywu 5X. Przejdź do celu 20X, aby przeprowadzić sekcję.
   1. Zaznacz "fikcyjny" obszar pisakiem świetlnym i pozwól laserowi wyciąć go bez zbierania. Rozluźnia to błonę PEN i umożliwia kolejno zaznaczanie i wycinanie wielu obszarów.
   2. Ponownie skoncentruj się i zidentyfikuj neurony ruchowe w brzusznym obszarze rogu. Neurony te można rozpoznać po ich lokalizacji, morfologii piramidalnej, dużym rozmiarze i ciemnoniebieskim zabarwieniu lazurem B (ryc. 2).
   3. Za pomocą pióra świetlnego wybierz narzędzie do rysowania i zaznacz wzdłuż krawędzi neuronów ruchowych, tworząc pełny kontur. Staraj się, aby kontur znajdował się jak najbliżej neuronu ruchowego, aby uniknąć zanieczyszczenia komórkami innymi niż neuron ruchowy. (Przetestuj wcześniej niektóre sekcje, aby zobaczyć, jak szeroka jest linia cięcia lasera i w razie potrzeby dostosuj prześwit.) Zaznacz wiele komórek przed cięciem; Oprogramowanie zapamięta pozycje.
   4. Umieść nasadkę pod pozycją cięcia, klikając pozycję nasadki. Kliknij przycisk start, aby rozpocząć sekcję neuronów ruchowych za pomocą lasera. Zbierz wszystkie neurony ruchowe ze wszystkich sekcji na jednym szkiełku do nasadki jednej rurki do mikrofuge.
   5. Po zakończeniu zbierania wyjmij probówkę do mikrofugi z uchwytu, rozładowując tackę i delikatnie wyjmując tubkę. Całkowicie rozpuść neurony ruchowe w buforze, pipetując roztwór w górę iw dół. Przenieść roztwór do korpusu probówki, odwirowując przy 14 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Natychmiast zamrozić próbkę w suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Proces ten, od barwienia szkiełka do pobrania neuronów ruchowych, powinien być wykonany w ciągu 30 minut na jeden slajd, aby zminimalizować degradację RNA.

5. Przygotowanie RNA z neuronów ruchowych

Rozmrozić wszystkie zebrane neurony od jednego zwierzęcia i połączyć je razem, aby wyekstrahować RNA. Próbki mogą wyglądać bladoniebiesko w zależności od liczby neuronów ruchowych (zabarwionych lazurem B) w nich. Ekstrahować RNA za pomocą odpowiedniego zestawu zgodnie z protokołem przewidzianym dla tkanki LMD, eluując w minimalnej możliwej objętości. Pobrać 1 μl, aby sprawdzić ilość i integralność próbki. Szybko zamrozić pozostałe RNA na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Określanie jakości i ilości RNA

Oznaczyć jakość RNA za pomocą próbki o objętości 1 μl na chipie mikroprzepływowym do elektroforezy kapilarnej zgodnie z protokołem producenta. Całkowite preparaty RNA o liczbie integralności RNA (RIN) powyżej 8,5 mogą być stosowane do sekwencjonowania RNA i qRT-PCR. Dane wyjściowe zazwyczaj obejmują również przybliżone stężenie próbki.

Wyniki

Protokół opisany powyżej oraz na Rysunku 1 powinien pozwolić na uzyskanie 50 ng lub więcej całkowitego RNA o wartości RIN >8,5 z 3000-4000 ciał neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, wypreparowanych z 9-10 plastrów o grubości 20 µm z około 20 szkiełek PEN. Ponieważ ta liczba szkiełek stanowi mniej niż 10% bloku rdzenia kręgowego myszy zatopionego w O.C.T., możliwe jest powrotne wykorzystanie bloku przechowywanego w temperaturze -80 °C i wycięcie kolejnych plastrów do następnej serii preparatyki RNA. Jeśli do analizy wymagane są większe ilości RNA, lepiej jest przygotowywać za jednym razem tylko taką liczbę szkiełek (np. 20), które można poddać dyssekcji i preparatyce RNA w ciągu kilku dni, a następnie przygotować kolejne szkiełka w drugiej serii i połączyć otrzymane produkty. Przed połączeniem należy upewnić się, sprawdzając wartość RIN każdej preparatyki, aby uniknąć zmieszania próbki wysokiej jakości z próbką zdegradowaną. Metody RNA-seq stają się coraz bardziej czułe, a nowe technologie PCR obiecują wyższą czułość niż obecnie stosowane rozwiązania. W związku z tym wymagane będzie mniej RNA z mniejszej liczby ciał neuronów, co pozwoli na większą głębokość sekwencjonowania i bardziej kompleksową walidację interesujących wyników. Z drugiej strony, pełne przestrzeganie zaleceń MIQE w przypadku analizy i walidacji metodą qRT-PCR⁴ może wymagać większych ilości materiału, aby umożliwić przeprowadzenie niezbędnych reakcji kontrolnych dla rzadkich RNA.

Rysunek 2 przedstawia typową serię obrazów fragmentu przekroju przedniego rogu rdzenia kręgowego po barwieniu błękitem Azure B i dyssekcji. Na panelu A duże, ciemno zabarwione ciała komórek to neurony ruchowe, co potwierdzono barwieniem przeciwciałem anty-Chat²; są one łatwo odróżnialne od mniejszych komórek sąsiadujących. Panel B pokazuje ten sam obszar, gdzie poszczególne ciała komórek zostały obrysowane za pomocą pióra świetlnego i ponumerowane przez oprogramowanie mikroskopu. Obrysy ściśle podążają za krawędziami ciał komórek, z niewielkim naddatkiem uwzględniającym szerokość cięcia laserowego. Odstęp ten musi zostać określony dla każdego ustawienia mocy lasera, aby zminimalizować włączenie obcego materiału, unikając jednocześnie utraty cytozolu neuronów ruchowych. Panele C i D pokazują przekrój po wykonaniu cięcia laserowego i wypadnięciu poszczególnych ciał komórek do kapsuły zbierającej. Zauważmy, że margines cięcia w panelu C nie pokrywa się dokładnie z obrysem pióra świetlnego, ale w dużej mierze pozostaje poza nim. Ta nieregularność jest widoczna w panelu D, podobnie jak przyciemniony obszar wokół każdego cięcia, który odzwierciedla uszkodzenia cieplne tkanki spowodowane przez laser. Z tego powodu, jeśli dwa ciała komórek znajdują się bardzo blisko siebie, lepiej obrysować je jako jedną całość do jednego cięcia, zamiast próbować wycinać je osobno i ryzykować utratę RNA w wyniku uszkodzeń termicznych w miejscu ich bliskiego kontaktu.

Rysunek 3 przedstawia typowe wyniki analizy elektroforetycznej integralności RNA w próbce RNA przygotowanej z około 4 000 ciał neuronów ruchowych myszy pobranych za pomocą LMD. Górny panel to elektroferogram uzyskany z 1 µl całkowitego RNA; wstawka po prawej stronie to obraz żelu. W obu przypadkach widoczne są wyraźne piki RNA rybosomalnego. Dolny panel to elektroferogram ścieżki zawierającej standardy wielkości RNA. Oprogramowanie analityczne obliczyło dla tej próbki wartość RIN wynoszącą 9,8 przy stężeniu 4,9 ng/µl. Po analizie dostępnych było łącznie 13 µl tego roztworu, co dostarczyło 64 ng RNA do późniejszej walidacji ilości transkryptów metodą qRT-PCR. Dla typowej analizy qRT-PCR transkryptów o umiarkowanej liczbie kopii wystarczy 0,15-0,20 ng całkowitego RNA do uzyskania dokładnego oquantytatywnego pomiaru², zatem ilość RNA dostępna z tej preparatyki jest wystarczająca do walidacji wielu transkryptów z wykorzystaniem wielu zestawów starterów, zgodnie z zaleceniami⁴. Oczywiście można zastosować większe ilości RNA wejściowego, aby umożliwić walidację rzadkich transkryptów. Ilość ta jest również więcej niż wystarczająca do przygotowania bibliotek i sekwencjonowania RNA nowej generacji (RNA-seq).

Rycina 1. Przegląd procesu przygotowania przekrojów rdzenia kręgowego oraz mikrodysekcji laserowej ciał neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. A) Główne etapy przygotowania przekrojów i barwienia. B) Schematyczny widok przekroju rdzenia kręgowego i dysekcji laserowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 2. Zdjęcia przed i po mikrodysekcji laserowej ciał komórkowych neuronów ruchowych barwionych błękitem Azure B. A) Fragment rogu przedniego zabarwionego przekroju. Zwróćmy uwagę na cztery duże, ciemno zabarwione komórki. Widoczne są również nieliczne, słabiej zabarwione i nieco mniejsze komórki, które nie są neuronami ruchowymi (potwierdzone barwieniem przeciwciałami anty-Chat; nie pokazano, ale patrz Bandyopadhyay²) i nie zostaną wybrane do dysekcji. Wiele małych, ciemnych punktów to prawdopodobnie wypustki neuronalne (dendryty i aksony), jednak nie zostało to potwierdzone. B) Cztery ciała komórkowe obrysowane za pomocą pióra świetlnego. Należy zauważyć, że obrysy ściśle podążają za krawędziami komórek, zachowując minimalny odstęp między nimi. Odległość tę należy ustalić empirycznie dla każdego mikroskopu i lasera. Oprogramowanie numeruje poszczególne neurony, co ułatwia monitorowanie liczby zebranych komórek. C i D) Po przecięciu laserem i opadnięciu fragmentów zawierających ciała komórkowe do nasadki zbierającej. Zwróćmy uwagę, że pozostawiony otwór jest nieco większy od obrysu i ma nieregularny kształt. Odzwierciedla to szerokość wiązki lasera oraz jego nieco zmienną wydajność cięcia w zależności od lokalnego składu tkanki. Widoczny jest również rant przyciemnionej tkanki otaczający każdy otwór, będący wynikiem lokalnego uszkodzenia termicznego spowodowanego działaniem lasera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz.

Rysunek 3. Analiza elektroforetyczna integralności RNA przygotowanego z próbek LMD. A) Alikwot 1 µl RNA przygotowanego z około 4 000 ciał neuronów ruchowych zgodnie z powyższym protokołem został przeanalizowany metodą elektroforezy mikrokapilarnej na chipie mikrofluidycznym. Przedstawiono elektroferogram z wyraźnymi pikami RNA rybosomalnego. Po prawej stronie znajduje się obraz żelu. B) Przedstawiono elektroferogram standardów wielkości z odpowiadającą mu ścieżką żelu po prawej stronie. Oprogramowanie urządzenia obliczyło dla tej próbki wartość RIN wynoszącą 9,8 oraz stężenie 4,9 ng/µl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

Najbardziej znaczącą miarą sukcesu tego protokołu w wytwarzaniu całkowitego RNA za pomocą laserowej mikrodysekcji wycinków rdzenia kręgowego jest wartość RIN⁵. W przypadku próbek RNA od wyższych eukariontów wartości powyżej 8,5 regularnie dają wysokiej jakości dane sekwencjonowania i qRT-PCR. Jeśli plon jest niski, ale jakość jest wysoka, powtórz przygotowanie. Jeśli jednak integralność jest niższa (nawet 7,5-8), lepiej znaleźć źródło problemu i spróbować ponownie. Jest wiele etapów, w których coś może pójść nie tak, ale tak naprawdę tylko dwa źródła problemu - endogenne zanieczyszczenie RNazą lub egzogenne zanieczyszczenie RNazą. Pierwszym z nich można rozwiązać poprzez praktykę, dzięki czemu czas od poświęcenia myszy do zamrożenia jej przewodu wbudowanego w O.C.T jest zminimalizowany. Innym punktem protokołu, w którym endogenna RNaza może przyczynić się do słabego wyniku, jest przygotowanie plasterków. Każdy plasterek powinien szybko przylegać do szkiełka PEN o temperaturze pokojowej, ale stopi się (OCT stanie się przezroczysty). Im szybciej plasterek zostanie ponownie zamrożony, tym lepiej. Używany przez nas kriostat ma płaskie powierzchnie wewnątrz komory, które mają temperaturę -20 °C, których używamy do szybkiego ponownego zamrożenia plastra. Znajdź podobne miejsce w używanym kriosacie i upewnij się, że plasterek szybko staje się ponownie nieprzezroczysty.

Śledzenie źródeł egzogennej RNazy może być trudne, ponieważ istnieje tak wiele możliwości. Jedynymi używanymi odczynnikami, które nie są wyraźnie wolne od RNazy, są O.C.T. i Azure B. Jeśli Azure B działał wcześniej zadowalająco, wypróbuj świeżą butelkę O.C.T., chociaż ten odczynnik nigdy nie stanowił problemu. Odczynniki wolne od RNaz można również wymienić, nawet od innego dostawcy. O wiele bardziej prawdopodobnym źródłem jest badacz. Oprócz dokładnego oczyszczenia obszaru roboczego, często przydatne jest, aby inny pracownik laboratorium śledził i obserwował wszystkie kroki procedury. Nawet jeśli jest to ktoś, kto nie wykonuje rutynowo tej procedury, świeże oczy mogą wykryć niezauważone źródło zanieczyszczenia.

Rozszerzenie tego protokołu na odzyskiwanie RNA z innych komórek rdzenia kręgowego, z komórek rdzenia kręgowego innych gatunków lub z określonych typów komórek w innych narządach będzie wymagało modyfikacji w kilku obszarach ukierunkowanych na osiągnięcie jasnej identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, przy jednoczesnym wyeliminowaniu lub przynajmniej zminimalizowaniu wpływu endogennej RNazy. W tym protokole szybkie usunięcie i zamrożenie pępowiny, w połączeniu z barwieniem Azure B w 70% etanolu, pozwoliło zarówno zminimalizować degradację RNA, jak i łatwą identyfikację ciał komórek neuronu ruchowego. Azure B jest dobrze znanym barwnikiem histochemicznym neuronów, który wydaje się wiązać z RNA³ i został wykorzystany do oceny zawartości RNA neuronów w próbkach autopsyjnych tkanki mózgowej od pacjentów z chorobą neurodegeneracyjną⁶. Warto zauważyć, że barwienie Azure B nie wpłynęło ani na integralność oczyszczonego RNA, ani na jego zdolność do odwrotnej transkrypcji i analizy. Inne barwniki, takie jak fiolet krezylowy⁷ i błękit toluidynowy⁸ były używane w podobnych protokołach LMD. Zebranie ciał komórkowych bezpośrednio do roztworu tiocyjanianu guanidyny podczas ich preparacji stanowiło ostatni krok, który doprowadził do rutynowego odzyskania nienaruszonego RNA.

Podobne podejścia można przewidzieć dla innych komórek i narządów, uznając, że identyfikacja komórek będących przedmiotem zainteresowania przy jednoczesnym zminimalizowaniu lub, najlepiej, zapobieganiu degradacji RNA przez endogenne RNazy jest krytycznym wymogiem udanej analizy. W tkankach o wysokim poziomie RNazy, takich jak trzustka, szybka obsługa i niska temperatura zostały połączone, aby umożliwić odzyskanie RNA z komórek β. wykorzystanie ich naturalnej autofluorescencji do wizualizacji⁹. Procedury wykorzystujące barwienie przeciwciał do identyfikacji również zostały zgłoszone¹⁰, ale nie były w pełni udane w naszych rękach. Wreszcie, dostępnych jest wiele modeli mysich, które eksprymują fluorescencyjne białka fuzyjne (tj. GFP, YFP, RFP) w komórkach będących przedmiotem zainteresowania, które można wykorzystać do ich identyfikacji w skrawkach tkanek pod mikroskopem LMD. W rzeczywistości, szczepy myszy, które analizowaliśmy za pomocą tego protokołu, wyrażają białko fuzyjne między SOD1 i YFP¹¹, a ich neurony ruchowe rdzenia kręgowego są wysoce fluorescencyjne. Nie byliśmy jednak w stanie znaleźć zestawu warunków płukania etanolem i / lub odwodnienia, które jednocześnie usuwałyby O.C.T., hamowały aktywność RNazy i konsekwentnie utrzymywały wystarczającą fluorescencję YFP, aby umożliwić wizualizację neuronów ruchowych i ich regenerację przez LMD. Być może Można znaleźć nowe białko fluorescencyjne lub wariant dostępnych, który utrzymuje fluorescencję w rozpuszczalnikach organicznych, aby przezwyciężyć to ograniczenie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina	Webster Veterinary	26637041101	Każde źródło zatwierdzone przez instytucjonalną służbę weterynaryjną
Narzędzia do preparowania (nożyczki, kleszcze,  etc.)			Każde dogodne źródło wysokiej jakości narzędzi preparacyjnych
Kriostat	Leica Microsystem	CM3050S	Inne kriostaty powinny być odpowiednie
LMD6000 B	Leica Microsystem		Inne systemy LMD nie zostały przetestowane
Membrana PEN wolna od RNaz 2 i mu; M Zjeżdżalnie	Leica Microsystem	11505189	Inne typy prowadnic zostały przetestowane i nie działają dobrze
Zestaw RNeasy Micro (50)	Qiagen	74004	Można użyć dowolnego zestawu, który wykorzystuje bufor do lizy tiocyjanianu guanidyny i został przetestowany pod kątem odzyskiwania małych ilości RNA
Agilent 2100 BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2939A
Certyfikat Azure B	MP Biomedicals	190520	Krytyczny! Produkt z dowolnego źródła musi zostać przetestowany przed użyciem pod kątem jego zdolności do utrzymania integralności RNA
PBS	Sigma Life Science	D8537	Każde wiarygodne źródło wolnego od RNaz PBS
RNA Etanol 70% (wykonany z wody uzdatnionej DEPC)	American Bioanalytical	AB04010-00500	Każde wiarygodne źródło, może być wyprodukowane w laboratorium
Woda, wolna od RNaz, testowana na endotoksynach (traktowana DEPC w celu wyeliminowania RNazy)	American Bioanalytical	AB02128-00500	Każde wiarygodne źródło, może być laboratoryjnie wykonane
RNase AWAY	Invitrogen Life Technologies	10328-011	Inne podobne odczynniki do usuwania RNazy, takie jak RNaseZAP (również z Invitrogen) mogą być używane
2-metylobutan	Mikroskopia elektronowa Nauki	78-78-4	Dowolne
źródło Probówki do mikrofug Maxymum Recovery (0,6 i 1,5 ml) i końcówki do pipet	Axygen	311-03-051 & 311-09-051	Rurki i końcówki o bardzo niskiej retencji, wolne od RNaz; przetestuj produkty innych producentów przed użyciem
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583
Cryomold Intermediate Size	Tissue-Tek	4566
(Kimwipes)	KIMTECH	34155

Chusteczki laboratoryjne