Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Podsumowanie

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Streszczenie

W erze biologii obliczeniowej, nowe systemy eksperymentalne o wysokiej przepustowości są niezbędne do wypełniania i udoskonalania modeli, tak aby można je było walidować do celów predykcyjnych. Idealnie byłoby, gdyby takie systemy były niskoobjętościowe, co wyklucza pobieranie próbek i analizy niszczące, gdy mają być uzyskane dane dotyczące przebiegu w czasie. Potrzebne jest narzędzie do monitorowania in situ, które może przekazywać niezbędne informacje w czasie rzeczywistym i w sposób nieinwazyjny. Ciekawą opcją jest zastosowanie fluorescencyjnych, opartych na białkach czujników biologicznych in vivo jako reporterów stężeń wewnątrzkomórkowych. Jedna szczególna klasa biosensorów in vivo, która znalazła zastosowanie w kwantyfikacji metabolitów, opiera się na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) między dwoma białkami fluorescencyjnymi połączonymi domeną wiążącą ligand. Zintegrowane czujniki biologiczne FRET (FIBS) są wytwarzane konstytutywnie w linii komórkowej, mają krótkie czasy reakcji, a ich charakterystyka widmowa zmienia się w zależności od stężenia metabolitu w komórce. W pracy opisano metodę konstruowania linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO), które konstytutywnie wyrażają FIBS dla glukozy i glutaminy oraz kalibracji FIBS in vivo w okresowej hodowli komórkowej w celu umożliwienia przyszłej kwantyfikacji stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych. Dane z hodowli komórkowych CHO podawanych partiami pokazują, że FIBS był w stanie w każdym przypadku wykryć wynikającą z tego zmianę stężenia wewnątrzkomórkowego. Wykorzystując sygnał fluorescencyjny z FIBS i wcześniej skonstruowaną krzywą kalibracyjną, dokładnie określono stężenie wewnątrzkomórkowe, co zostało potwierdzone niezależnym testem enzymatycznym.

Wprowadzenie

Monitorowanie metabolitów ma różne zastosowania w bioprzetwarzaniu, w tym w rozwoju procesów, projektowaniu mediów i pasz oraz inżynierii metabolicznej. Dostępne są różne metody pomiaru stężenia przy użyciu testów enzymatycznych¹, chemicznych² lub wiążących³. Ciekawą opcją jest wykorzystanie fluorescencyjnych, białkowych czujników biologicznych in vivo jako reporterów wewnątrzkomórkowego stężenia kluczowych metabolitów. W testach o bardzo małej objętości fluorescencja jest wygodnym narzędziem, ponieważ miniaturyzacja faktycznie poprawia stosunek sygnału do szumu^4,5, a czujniki oparte na białkach mogą być kodowane genetycznie, co oznacza, że do analizy metabolitów nie są potrzebne żadne odczynniki egzogenne. Biosensory Förster Resonance Energy Transfer (FRET) składają się z dwóch białek fluorescencyjnych połączonych domeną wiążącą ligand. FRET to niepromieniste przeniesienie energii z fotowzbudzonego donora do akceptorowej cząsteczki fluorescencyjnej znajdującej się w bliskiej odległości (<100). Rozszczepienie lub wiązanie liganda powoduje zmianę konformacyjną w czujniku, która z kolei indukuje zmianę w pobliżu fluoroforów, prowadząc do zmiany wydajności FRET mierzonej zmianą widma emisyjnego. Zintegrowane czujniki biologiczne FRET (FIBS) są wytwarzane konstytutywnie w linii komórkowej, a ich charakterystyka widmowa zmienia się w zależności od stężenia metabolitu w komórce. FIBS mają krótkie czasy reakcji, dzięki czemu idealnie nadają się do wykonywania pomiarów dla modeli dynamicznych⁶. Wcześniejsze zastosowania obejmowały monitorowanie pojedynczych^7-9 i wielu^{metabolitów 10} oraz dostarczanie danych na temat dystrybucji czasoprzestrzennej¹¹. FIBS można tworzyć w dwóch konfiguracjach: Apo-Max, gdzie wiązanie ligandów zakłóca bliskość fluoroforów, obniżając transfer energii i Apo-Min, gdzie wiązanie ligandów zbliża dwa fluorofory do bliższego kontaktu (ryc. 1).

W tej pracy przedstawiono protokół budowy linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO), które konstytutywnie wyrażają FIBS dla metabolitu, glukozy lub glutaminy. Ustanowiono metodologię kalibracji czujnika in vivo, aby umożliwić przyszłe pomiary ilościowe stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych, jak pokazano na rysunku 2. Na tej podstawie można określić wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy lub glutaminy w hodowlach komórkowych CHO podawanych partiowo, do których dodano dwa składniki odżywcze w wysokich stężeniach w procesie. Wyniki pokazują, że przy użyciu sygnału fluorescencyjnego z FIBS i wcześniej skonstruowanej krzywej kalibracyjnej możliwe jest dokładne przewidywanie stężenia wewnątrzkomórkowego, co potwierdza niezależny test enzymatyczny. Metoda ta oferuje znaczne korzyści w porównaniu z obecnymi technologiami analitycznymi, ponieważ jest nieinwazyjna, tania i szybka, dając sygnał FIBS w czasie rzeczywistym, który można monitorować w całej hodowli.

Protokół

1. Rewitalizacja i utrzymanie linii komórkowych

1. Rewitalizować komórki CHO w 9 ml pożywki CD-CHO uzupełnionej o 8 mM L-Glutaminy oraz 10 ml/L 100x suplementu hypoksantyny/tymidyny (pełna pożywka wzrostowa).
2. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
3. Resuspender komórki w 10 ml świeżej pełnej pożywki wzrostowej.
4. Pobrać próbkę 1 ml i oznaczyć stężenie żywych komórek za pomocą mikroskopii świetlnej z wykorzystaniem metody wykluczania barwnika trypan blue w hemocytometrze.
5. Inicjować hodowlę przy gęstości zasiewu 3 x 10⁵ komórek/ml w kolbach inkubacyjnych o pojemności 125 ml.
6. Utrzymywać hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, w nawilżonej atmosferze z 5% CO₂, na platformie wytrząsowej obracającej się z prędkością 120 rpm.
7. Przesiewać co 3-4 dni w pełnej pożywce wzrostowej przy gęstości zasiewu 2 x 10⁵ komórek/ml.

2. Transfekcja linii komórkowej plazmidem zawierającym gen biosensora

1. Przygotować plazmidowe DNA przy użyciu zestawu do wielkoskalowego oczyszczania plazmidów.
2. Utrzymywać komórki w odpowiednich warunkach (37 °C, 5% CO₂) przez 12-24 hr przed transfekcją, aby zapewnić, że komórki aktywnie się dzielą w momencie transfekcji.
3. Policzyć komórki metodą wykluczania barwnika trypan blue, a następnie przygotować objętość roboczą 20 ml hodowli komórkowej w kolbie wytrząsowej o pojemności 125 ml przy stężeniu 1 x 10⁶ cells/ml.
4. Użyć odpowiedniego zestawu do transfekcji dla stosowanej linii komórkowej. Stosunek plazmidowego DNA do odczynników do transfekcji będzie zależał od linii komórkowej i wektora. Zaleca się optymalizację tego parametru poprzez przetestowanie zakresu stosunków określonych przez producenta przed przeprowadzeniem ostatecznych transfekcji. Należy również utrzymać co najmniej jedną kulturę kontrolną ujemną zawierającą komórki, ale bez DNA.
5. Inkubować przez 4 dni w trybie statycznym, a następnie przenieść na platformę wytrząsową obracającą się z prędkością 125 rpm.
6. Dodać odpowiedni antybiotyk do selekcji plazmidu w stężeniu ustalonym na podstawie krzywej przeżywalności (kill curve). W niniejszym badaniu zeocyn dodano do stężenia końcowego 400 μg/ml w celu selekcji komórek transfekowanych.
7. Wymieniać medium w odpowiednich odstępach czasu dla danej linii komórkowej, za każdym razem dodając antybiotyk, aż do momentu obumarcia komórek w studni kontrolnej.
8. Wybrać studnie o największej konfluencji w celu przejścia do hodowli wytrząsowych.
9. Utworzyć bank komórek poprzez zamrożenie komórek w fiolkach kriogenicznych zawierających 10⁷  żywych komórek w 1 ml mieszaniny do mrożenia. W niniejszej pracy mieszanina ta składa się z 92,5% medium wzrostowego i 7,5% dimetylosulfotlenku.

3. Krzywa wzrostu komórek w hodowli okresowej i w hodowli z dopływem

1. Zgodnie z powyższymi instrukcjami dotyczącymi utrzymania komórek, przygotować potrójne hodowle transfekowanych komórek CHO w kolbach wytrząsowych o pojemności 250 ml, przy objętości roboczej 50 ml.
2. Hodowle utrzymywać w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂, na platformie wytrząsowej z obrotem 125 rpm, pobierając próbki o objętości 4,1 ml z każdej rosnącej hodowli w odstępach 24-godzinnych.
3. Wykorzystać 100 μl próbki do oznaczenia stężenia żywych komórek oraz żywotności komórek metodą wykluczania barwnika trypan blue.
4. Powtarzać procedurę do momentu, aż stężenie żywych komórek spadnie do zera.
5. Powtórzyć procedurę dla hodowli komórkowych w systemie fed-batch, uzupełniając w 6. dniu odpowiednią ilość glukozy lub glutaminy, aby przywrócić ich stężenia do wartości początkowych, odpowiednio 36 mM i 4 mM. Zaleca się prowadzenie dodatkowych hodowli kontrolnych, do których należy dodawać taką samą objętość (w tym przypadku 12 ml) czystej wody.

4. Pomiary stosunku FRET

1. Odmierz 2 ml próbek pobranych codziennie w kroku 3.2 powyżej i wiruj przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
2. Resuspenduj osad komórkowy w 2 ml lodowatego roztworu soli fosforanowo-buforowanego (PBS). Przenieś zawiesinę do płytki 6-dołkowej i do jednego z dołków dodaj próbkę ślepą niezawierającą komórek.
3. Niezwłocznie zmierz poziomy fluorescencji niebieskiej i żółtej przy długości fali wzbudzenia 430/435 nm oraz długościach fali emisji 465/435 nm (niebieska) i 520/510 nm (żółta).
4. Oblicz stosunki FRET (stosunek wykrytej fluorescencji żółtej do wykrytej fluorescencji niebieskiej).

5. Analizy metabolitów

1. Pobrać 2 ml próbek dziennych pobranych w kroku 3.2 powyżej i wirować przy 100 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz.
2. Resuspender osad komórkowy w 3 ml lodowatego PBS i ponownie wirować przy 100 x g przez 5 min.
3. Usunąć nadsącz i resuspender osad komórkowy w 3 ml lodowatego PBS jak opisano powyżej. Sonicować próbkę 5x przez 3 min każdorazowo, stosując impulsy 15 s włączony i 15 s wyłączony. Na tym etapie ekstrakty komórkowe można zamrozić, jeśli jest to pożądane.
4. Zastosować odpowiedni zestaw do oznaczania glukozy zgodnie z instrukcją producenta na próbkach ekstraktów komórkowych, aby określić wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy (patrz tabela materiałów).
   Uwaga: Użyć odpowiednich wzorców do sporządzenia krzywej wzorcowej. W niniejszej pracy stężenie wzorców mieściło się w zakresie 0-100 mM.
5. Wykorzystując odczyty dla wzorców, sporządzić krzywą wzorcową i wyznaczyć liniowe równanie regresji (w tym przypadku: y = 1310,51x - 723,43, gdzie y to odczyt absorbancji, a x to stężenie glukozy).
6. Obliczyć stężenia glukozy, korzystając z krzywej wzorcowej i uwzględniając rozcieńczenie. Wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy można następnie obliczyć za pomocą następującego równania:
   
   Dla komórek CHO objętość pojedynczej komórki obliczono, przyjmując średnicę komórki wynoszącą 12 μM ¹².
7. Zastosować odpowiedni zestaw do oznaczania glutaminy zgodnie z instrukcją producenta na próbkach ekstraktów komórkowych, aby określić wewnątrzkomórkowe stężenie glutaminy (patrz tabela materiałów).
   Uwaga: Użyć odpowiednich wzorców do sporządzenia krzywej wzorcowej. W niniejszej pracy stężenie wzorców mieściło się w zakresie 0-2 mM.
8. Analogicznie do punktu 5.5 powyżej, sporządzić krzywą kalibracyjną (w tym przypadku y = 203,1x + 17,1, gdzie y to odczyt absorbancji, a x to stężenie glukozy)
9. Korzystając z krzywej wzorcowej, obliczyć stężenie glutaminy w próbkach, uwzględniając rozcieńczenie. Wewnątrzkomórkowe stężenie glutaminy można obliczyć za pomocą powyższego Równania 1.

Wyniki

Przegląd metodologii przedstawiono na Rysunku 2. W niniejszej pracy komórki CHO przetransfekowano wektorem FIBS, a stabilne linie komórkowe wyselekcjonowano przy ciśnieniu antybiotykowym 400 μg/ml zeocyny. W ten sposób stworzono dwie oddzielne stabilne linie komórkowe konstytutywnie ekspresujące sensory glukozy i glutaminy. Rysunek 1 przedstawia konfiguracje dwóch biosensorów użytych w tym badaniu. Sensor glukozy opiera się na zasadzie Apo-Max, a odpowiadający mu plazmid to pRSET-FLIPglu...

Dyskusja

FIBS umożliwiają ilościowe oznaczanie in vivo i in situ kluczowych cząsteczek, w tym przypadku składników odżywczych ograniczających wzrost, usuwając niepewności wynikające z metod hartowania i ekstrakcji. Wyniki sugerują, że istnieje dobra korelacja między sygnałem FIBS a stężeniami wewnątrzkomórkowymi w zakresie 1-5 mM dla glukozy i 0,3-2 mM dla glutaminy. W okresowej hodowli komórkowej CHO stężenia te występują w fazie wykładniczej, stacjonarnej i wczesnego zaniku. Faza wykładnicza i stacjonarna są n...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	Linia komórkowa będzie się różnić w zależności od celów badania wektora
pCDNA4/DO	Life Tecnologies
Odczynnik do transfekcji TransIT-PRO	Mirus Bio	MIR 5700	Transfekcje można wykonać przy użyciu dowolnej metody odpowiedniej dla badanej linii komórkowej
Pożywka Zeocin	Invivogen
CD-CHO	Life Technologies	10743-011	Pożywka do wzrostu komórek zależy od badanych komórek
100x HT Suplement	Żywotność Technologie	11067-030
L-glutamina 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Czytnik płytek InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Każdy 96-dołkowy czytnik płytek fluorescencyjnych, który ma dostęp do wymaganych długości fal, może zostać zastąpiony
Filtry do czytnika płytek	Tecan	30000463
Maxiprep Zestaw do oczyszczania plazmidu	Qiagen	12163	Każdy odpowiedni zestaw może zostać zastąpiony
Zestaw do oznaczania glukozy/oksydazy glukozowo-glukozowej Amplex Red	Invitrogen	A22189	Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić
EnzyChrom  Zestaw do oznaczania glutaminy Systemy	testów biologicznych	EOAC-100	Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić
Ulepszony hemocytometr Neubauer	Inkubator Fisher Scientific	MNK-420-010N
	Nuaire	NU-5510E