Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Summary

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Abstract

W erze biologii obliczeniowej, nowe systemy eksperymentalne o wysokiej przepustowości są niezbędne do wypełniania i udoskonalania modeli, tak aby można je było walidować do celów predykcyjnych. Idealnie byłoby, gdyby takie systemy były niskoobjętościowe, co wyklucza pobieranie próbek i analizy niszczące, gdy mają być uzyskane dane dotyczące przebiegu w czasie. Potrzebne jest narzędzie do monitorowania in situ, które może przekazywać niezbędne informacje w czasie rzeczywistym i w sposób nieinwazyjny. Ciekawą opcją jest zastosowanie fluorescencyjnych, opartych na białkach czujników biologicznych in vivo jako reporterów stężeń wewnątrzkomórkowych. Jedna szczególna klasa biosensorów in vivo, która znalazła zastosowanie w kwantyfikacji metabolitów, opiera się na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) między dwoma białkami fluorescencyjnymi połączonymi domeną wiążącą ligand. Zintegrowane czujniki biologiczne FRET (FIBS) są wytwarzane konstytutywnie w linii komórkowej, mają krótkie czasy reakcji, a ich charakterystyka widmowa zmienia się w zależności od stężenia metabolitu w komórce. W pracy opisano metodę konstruowania linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO), które konstytutywnie wyrażają FIBS dla glukozy i glutaminy oraz kalibracji FIBS in vivo w okresowej hodowli komórkowej w celu umożliwienia przyszłej kwantyfikacji stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych. Dane z hodowli komórkowych CHO podawanych partiami pokazują, że FIBS był w stanie w każdym przypadku wykryć wynikającą z tego zmianę stężenia wewnątrzkomórkowego. Wykorzystując sygnał fluorescencyjny z FIBS i wcześniej skonstruowaną krzywą kalibracyjną, dokładnie określono stężenie wewnątrzkomórkowe, co zostało potwierdzone niezależnym testem enzymatycznym.

Introduction

Monitorowanie metabolitów ma różne zastosowania w bioprzetwarzaniu, w tym w rozwoju procesów, projektowaniu mediów i pasz oraz inżynierii metabolicznej. Dostępne są różne metody pomiaru stężenia przy użyciu testów enzymatycznych¹, chemicznych² lub wiążących³. Ciekawą opcją jest wykorzystanie fluorescencyjnych, białkowych czujników biologicznych in vivo jako reporterów wewnątrzkomórkowego stężenia kluczowych metabolitów. W testach o bardzo małej objętości fluorescencja jest wygodnym narzędziem, ponieważ miniaturyzacja faktycznie poprawia stosunek sygnału do szumu^4,5, a czujniki oparte na białkach mogą być kodowane ge....

Protocol

1. Ożywienie i utrzymanie linii komórkowych

1. Ożyw komórki CHO w 9 ml pożywce CD-CHO uzupełnionej 8 mM L-Glutaminą i 10 ml/L 100x suplementem hipoksantyny/tymidyny (kompletna pożywka wzrostowa).
2. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
3. Zawiesić komórki w 10 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.
4. Pobrać próbkę o objętości 1 ml i określić stężenie komórek żywotnych za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego w hemocytometrze.
5. Rozpocząć hodowlę przy gęstości wysiewu 3 x 10⁵ komórek/ml w kolbach wstrząsowych o pojemności 125 ml.
6. Utrzymywać hodowlę w inkubato....

Results

Przegląd metodologii jest przedstawiony na rysunku 2. W prezentowanej pracy komórki CHO transfekowano wektorem FIBS i wybrano stabilne linie komórkowe pod ciśnieniem antybiotyku 400 μg/ml zeocyny. W związku z tym stworzono dwie oddzielne, stabilne linie komórkowe konstytutywnie wyrażające czujniki glukozy i glutaminy. Rysunek 1 przedstawia konfiguracje dwóch biosensorów wykorzystanych w tym badaniu. Czujnik glukozy oparty jest na zasadzie Apo-Max, a odpowiadający mu plazmid to pRSET-FLIP.......

Discussion

FIBS umożliwiają ilościowe oznaczanie in vivo i in situ kluczowych cząsteczek, w tym przypadku składników odżywczych ograniczających wzrost, usuwając niepewności wynikające z metod hartowania i ekstrakcji. Wyniki sugerują, że istnieje dobra korelacja między sygnałem FIBS a stężeniami wewnątrzkomórkowymi w zakresie 1-5 mM dla glukozy i 0,3-2 mM dla glutaminy. W okresowej hodowli komórkowej CHO stężenia te występują w fazie wykładniczej, stacjonarnej i wczesnego zaniku. Faza wykładnicza i stacjonarna są n.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	Linia komórkowa będzie się różnić w zależności od celów badania wektora
pCDNA4/DO	Life Tecnologies
Odczynnik do transfekcji TransIT-PRO	Mirus Bio	MIR 5700	Transfekcje można wykonać przy użyciu dowolnej metody odpowiedniej dla badanej linii komórkowej
Pożywka Zeocin	Invivogen
CD-CHO	Life Technologies	10743-011	Pożywka do wzrostu komórek zależy od badanych komórek
100x HT Suplement	Żywotność Technologie	11067-030
L-glutamina 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Czytnik płytek InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Każdy 96-dołkowy czytnik płytek fluorescencyjnych, który ma dostęp do wymaganych długości fal, może zostać zastąpiony
Filtry do czytnika płytek	Tecan	30000463
Maxiprep Zestaw do oczyszczania plazmidu	Qiagen	12163	Każdy odpowiedni zestaw może zostać zastąpiony
Zestaw do oznaczania glukozy/oksydazy glukozowo-glukozowej Amplex Red	Invitrogen	A22189	Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić
EnzyChrom  Zestaw do oznaczania glutaminy Systemy	testów biologicznych	EOAC-100	Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić
Ulepszony hemocytometr Neubauer	Inkubator Fisher Scientific	MNK-420-010N
	Nuaire	NU-5510E