Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Summary

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Abstract

W erze biologii obliczeniowej, nowe systemy eksperymentalne o wysokiej przepustowości są niezbędne do wypełniania i udoskonalania modeli, tak aby można je było walidować do celów predykcyjnych. Idealnie byłoby, gdyby takie systemy były niskoobjętościowe, co wyklucza pobieranie próbek i analizy niszczące, gdy mają być uzyskane dane dotyczące przebiegu w czasie. Potrzebne jest narzędzie do monitorowania in situ, które może przekazywać niezbędne informacje w czasie rzeczywistym i w sposób nieinwazyjny. Ciekawą opcją jest zastosowanie fluorescencyjnych, opartych na białkach czujników biologicznych in vivo jako reporterów stężeń wewnątrzkomórkowych. Jedna szczególna klasa biosensorów in vivo, która znalazła zastosowanie w kwantyfikacji metabolitów, opiera się na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) między dwoma białkami fluorescencyjnymi połączonymi domeną wiążącą ligand. Zintegrowane czujniki biologiczne FRET (FIBS) są wytwarzane konstytutywnie w linii komórkowej, mają krótkie czasy reakcji, a ich charakterystyka widmowa zmienia się w zależności od stężenia metabolitu w komórce. W pracy opisano metodę konstruowania linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO), które konstytutywnie wyrażają FIBS dla glukozy i glutaminy oraz kalibracji FIBS in vivo w okresowej hodowli komórkowej w celu umożliwienia przyszłej kwantyfikacji stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych. Dane z hodowli komórkowych CHO podawanych partiami pokazują, że FIBS był w stanie w każdym przypadku wykryć wynikającą z tego zmianę stężenia wewnątrzkomórkowego. Wykorzystując sygnał fluorescencyjny z FIBS i wcześniej skonstruowaną krzywą kalibracyjną, dokładnie określono stężenie wewnątrzkomórkowe, co zostało potwierdzone niezależnym testem enzymatycznym.

Introduction

Monitorowanie metabolitów ma różne zastosowania w bioprzetwarzaniu, w tym w rozwoju procesów, projektowaniu mediów i pasz oraz inżynierii metabolicznej. Dostępne są różne metody pomiaru stężenia przy użyciu testów enzymatycznych¹, chemicznych² lub wiążących³. Ciekawą opcją jest wykorzystanie fluorescencyjnych, białkowych czujników biologicznych in vivo jako reporterów wewnątrzkomórkowego stężenia kluczowych metabolitów. W testach o bardzo małej objętości fluorescencja jest wygodnym narzędziem, ponieważ miniaturyzacja faktycznie poprawia stosunek sygnału do szumu^4,5, a czujniki oparte na białkach mogą być kodowane genetycznie, co oznacza, że do analizy metabolitów nie są potrzebne żadne odczynniki egzogenne. Biosensory Förster Resonance Energy Transfer (FRET) składają się z dwóch białek fluorescencyjnych połączonych domeną wiążącą ligand. FRET to niepromieniste przeniesienie energii z fotowzbudzonego donora do akceptorowej cząsteczki fluorescencyjnej znajdującej się w bliskiej odległości (<100). Rozszczepienie lub wiązanie liganda powoduje zmianę konformacyjną w czujniku, która z kolei indukuje zmianę w pobliżu fluoroforów, prowadząc do zmiany wydajności FRET mierzonej zmianą widma emisyjnego. Zintegrowane czujniki biologiczne FRET (FIBS) są wytwarzane konstytutywnie w linii komórkowej, a ich charakterystyka widmowa zmienia się w zależności od stężenia metabolitu w komórce. FIBS mają krótkie czasy reakcji, dzięki czemu idealnie nadają się do wykonywania pomiarów dla modeli dynamicznych⁶. Wcześniejsze zastosowania obejmowały monitorowanie pojedynczych^7-9 i wielu^{metabolitów 10} oraz dostarczanie danych na temat dystrybucji czasoprzestrzennej¹¹. FIBS można tworzyć w dwóch konfiguracjach: Apo-Max, gdzie wiązanie ligandów zakłóca bliskość fluoroforów, obniżając transfer energii i Apo-Min, gdzie wiązanie ligandów zbliża dwa fluorofory do bliższego kontaktu (ryc. 1).

W tej pracy przedstawiono protokół budowy linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO), które konstytutywnie wyrażają FIBS dla metabolitu, glukozy lub glutaminy. Ustanowiono metodologię kalibracji czujnika in vivo, aby umożliwić przyszłe pomiary ilościowe stężenia metabolitów wewnątrzkomórkowych, jak pokazano na rysunku 2. Na tej podstawie można określić wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy lub glutaminy w hodowlach komórkowych CHO podawanych partiowo, do których dodano dwa składniki odżywcze w wysokich stężeniach w procesie. Wyniki pokazują, że przy użyciu sygnału fluorescencyjnego z FIBS i wcześniej skonstruowanej krzywej kalibracyjnej możliwe jest dokładne przewidywanie stężenia wewnątrzkomórkowego, co potwierdza niezależny test enzymatyczny. Metoda ta oferuje znaczne korzyści w porównaniu z obecnymi technologiami analitycznymi, ponieważ jest nieinwazyjna, tania i szybka, dając sygnał FIBS w czasie rzeczywistym, który można monitorować w całej hodowli.

Protocol

1. Ożywienie i utrzymanie linii komórkowych

1. Ożyw komórki CHO w 9 ml pożywce CD-CHO uzupełnionej 8 mM L-Glutaminą i 10 ml/L 100x suplementem hipoksantyny/tymidyny (kompletna pożywka wzrostowa).
2. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
3. Zawiesić komórki w 10 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.
4. Pobrać próbkę o objętości 1 ml i określić stężenie komórek żywotnych za pomocą mikroskopii świetlnej przy użyciu metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego w hemocytometrze.
5. Rozpocząć hodowlę przy gęstości wysiewu 3 x 10⁵ komórek/ml w kolbach wstrząsowych o pojemności 125 ml.
6. Utrzymywać hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO_{2 ,} na orbitalnej platformie wibracyjnej obracającej się z prędkością 120 obr./min.
7. Subkultura co 3-4 dni w kompletnym podłożu wzrostowym przy gęstości wysiewu 2 x 10⁵ komórek/ml.

2. Transfekcja linii komórkowej plazmidem zawierającym gen biosensora

1. Przygotuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu na dużą skalę.
2. Utrzymuj komórki w odpowiednich warunkach (37 °C, 5% CO_{2 )} 12-24 godziny przed transfekcją, aby upewnić się, że komórki aktywnie dzielą się w czasie transfekcji.
3. Policzyć komórki przy użyciu metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego, a następnie przygotować objętość roboczą 20 ml kultury komórkowej w kolbie wstrząsowej o pojemności 125 ml o stężeniu 1 x 10,6 komórek/ml.
4. Użyj odpowiedniego zestawu do transfekcji dla używanej linii komórkowej. Stosunek plazmidowego DNA do odczynników do transfekcji będzie zależał od linii komórkowej i wektora. Zaleca się, aby zoptymalizować to poprzez przetestowanie zakresu proporcji w zakresie określonym przez producenta przed przeprowadzeniem końcowych transfekcji. Należy również utrzymywać co najmniej jedną hodowlę kontrolną ujemną zawierającą komórki, ale bez DNA.
5. Inkubować przez 4 dni w trybie statycznym, a następnie przenieść na platformę wibracyjną obracającą się z prędkością 125 obr./min.
6. Dodaj odpowiedni antybiotyk do selekcji plazmidu do odpowiedniego stężenia, zgodnie z krzywą zabijania. W tym badaniu zeocynę dodano do końcowego stężenia 400 μg/ml w celu selekcji transfekowanych komórek.
7. Zmieniaj pożywkę w odpowiednich odstępach czasu dla linii komórkowej, dodając antybiotyk za każdym razem, aż komórki dobrze kontrolowane obumrą.
8. Użyj najbardziej zlewających się studni, aby przejść do potrząsania kulturami.
9. Ustanowić bank komórek, zamrażając komórki w fiolkach kriogenicznych zawierających 10⁷ żywotnych komórek w 1 ml mieszanki do zamrażania. W tej pracy składa się to z 92,5% pożywki wzrostowej i 7,5% dimetylosulfotlenku.

3. Krzywa wzrostu komórek wsadowych i wsadowych

1. Postępować zgodnie z powyższymi instrukcjami dotyczącymi utrzymania komórek, aby ustalić potrójne hodowle komórkowe transfekowanych komórek CHO w kolbach wstrząsowych o pojemności 250 ml o objętości roboczej 50 ml.
2. Utrzymywać kultury w nawilżanym inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, z 5% CO_{2 ,} na orbitalnej platformie wytrząsającej obracającej się z prędkością 125 obr./min i usuwać 4,1 ml próbek z każdej hodowli w odstępach 24 godzin.
3. Użyć 100 μl próbki do określenia stężenia komórek żywotnych i żywotności komórek za pomocą metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego.
4. Powtarzaj, aż stężenie żywotnych komórek zmniejszy się do zera.
5. Powtórzyć dla karmionych partiami kultur komórkowych uzupełniających odpowiednią ilością glukozy lub glutaminy w dniu 6, aby przywrócić ich stężenia do początkowych wartości odpowiednio 36 mM i 4 mM. Zaleca się również utrzymywanie dodatkowych kultur kontrolnych, które mają być karmione tą samą objętością (w tym przypadku 12 ml) czystej wody.

4. Pomiary współczynnika FRET

1. Pobrać 2 ml próbek pobranych z dnia roboczego w kroku 3.2 powyżej i odwirować przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
2. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Przenieś to do płytki 6-dołkowej i dodaj ślepą próbkę bez komórek do jednego dołka.
3. Zmierz poziomy niebieskiej i żółtej fluorescencji natychmiast przy długości fali wzbudzenia 430/435 nm i długości fali emisji 465/435 nm (niebieski) i 520/510 nm (żółty).
4. Obliczyć współczynniki FRET (stosunek wykrytej żółtej fluorescencji do wykrytej niebieskiej fluorescencji).

5. Testy metabolitów

1. Pobrać 2 ml próbek pobranych z dobów w kroku 3.2 powyżej i odwirować przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć sklarowany osad.
2. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml lodowatego PBS i ponownie odwirować przy 100 x g przez 5 minut.
3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 3 ml lodowatego PBS, jak powyżej. Sonduj próbkę 5 razy przez 3 minuty przy impulsie 15 sekund włączenia i 15 sekund wyłączenia. W tym momencie ekstrakty komórkowe można w razie potrzeby zamrozić.
4. Użyj odpowiedniego zestawu do oznaczania stężenia glukozy zgodnie z instrukcjami producenta na próbkach ekstraktów komórkowych w celu określenia wewnątrzkomórkowego stężenia glukozy (patrz tabela materiałów).
   Uwaga: Użyj odpowiednich standardów, aby skonstruować krzywą standardową. W tej pracy stężenie wzorców mieściło się w zakresie 0-100 mM.
5. Korzystając z odczytów wzorców, skonstruuj krzywą wzorcową i znajdź równanie liniowe najlepszego dopasowania (w tym przypadku: y = 1310,51x - 723,43, gdzie y to odczyt absorbancji, a x to stężenie glukozy).
6. Obliczyć stężenia glukozy, stosując krzywą wzorcową i biorąc pod uwagę rozcieńczenie. Wewnątrzkomórkowe stężenie glukozy można następnie obliczyć za pomocą tego równania:
   
   W przypadku komórek CHO objętość pojedynczej komórki obliczono przy użyciu średnicy komórki 12 μM ¹².
7. Użyj odpowiedniego zestawu do oznaczania glutaminy zgodnie z instrukcjami producenta na próbkach ekstraktów komórkowych, aby określić wewnątrzkomórkowe stężenie glutaminy (patrz tabela materiałów).
   Uwaga: Użyj odpowiednich standardów, aby skonstruować krzywą standardową. W tej pracy stężenie wzorców mieściło się w zakresie 0-2 mM.
8. Podobnie jak w ppkt 5.5 powyżej, należy skonstruować krzywą kalibracyjną (w tym przypadku y = 203,1x + 17,1, gdzie y jest odczytem absorbancji, a x jest stężeniem glukozy)
9. Korzystając z krzywej wzorcowej, obliczyć stężenie glutaminy w próbkach, biorąc pod uwagę rozcieńczenie. Wewnątrzkomórkowe stężenie glutaminy można obliczyć za pomocą równania 1 powyżej.

Results

Przegląd metodologii jest przedstawiony na rysunku 2. W prezentowanej pracy komórki CHO transfekowano wektorem FIBS i wybrano stabilne linie komórkowe pod ciśnieniem antybiotyku 400 μg/ml zeocyny. W związku z tym stworzono dwie oddzielne, stabilne linie komórkowe konstytutywnie wyrażające czujniki glukozy i glutaminy. Rysunek 1 przedstawia konfiguracje dwóch biosensorów wykorzystanych w tym badaniu. Czujnik glukozy oparty jest na zasadzie Apo-Max, a odpowiadający mu plazmid to pRSET-FLIP...

Discussion

FIBS umożliwiają ilościowe oznaczanie in vivo i in situ kluczowych cząsteczek, w tym przypadku składników odżywczych ograniczających wzrost, usuwając niepewności wynikające z metod hartowania i ekstrakcji. Wyniki sugerują, że istnieje dobra korelacja między sygnałem FIBS a stężeniami wewnątrzkomórkowymi w zakresie 1-5 mM dla glukozy i 0,3-2 mM dla glutaminy. W okresowej hodowli komórkowej CHO stężenia te występują w fazie wykładniczej, stacjonarnej i wczesnego zaniku. Faza wykładnicza i stacjonarna są n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	Linia komórkowa będzie się różnić w zależności od celów badania wektora
pCDNA4/DO	Life Tecnologies
Odczynnik do transfekcji TransIT-PRO	Mirus Bio	MIR 5700	Transfekcje można wykonać przy użyciu dowolnej metody odpowiedniej dla badanej linii komórkowej
Pożywka Zeocin	Invivogen
CD-CHO	Life Technologies	10743-011	Pożywka do wzrostu komórek zależy od badanych komórek
100x HT Suplement	Żywotność Technologie	11067-030
L-glutamina 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Czytnik płytek InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Każdy 96-dołkowy czytnik płytek fluorescencyjnych, który ma dostęp do wymaganych długości fal, może zostać zastąpiony
Filtry do czytnika płytek	Tecan	30000463
Maxiprep Zestaw do oczyszczania plazmidu	Qiagen	12163	Każdy odpowiedni zestaw może zostać zastąpiony
Zestaw do oznaczania glukozy/oksydazy glukozowo-glukozowej Amplex Red	Invitrogen	A22189	Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić
EnzyChrom  Zestaw do oznaczania glutaminy Systemy	testów biologicznych	EOAC-100	Każdy odpowiedni zestaw można zastąpić
Ulepszony hemocytometr Neubauer	Inkubator Fisher Scientific	MNK-420-010N
	Nuaire	NU-5510E