Pomiar doustnych progów kwasów tłuszczowych, percepcji tłuszczu, upodobania do tłustych potraw i gęstości brodawek u ludzi

Podsumowanie

Doustna chemorecepcja kwasów tłuszczowych i związek z dietą i preferencjami dotyczącymi tłustych potraw może umożliwić identyfikację mechanizmów związanych z rozwojem otyłości i dlaczego zmiany w diecie mogą być trudne dla wielu osób.

Streszczenie

Pojawiające się dowody z wielu laboratoriów wskazują, że ludzie mają zdolność do identyfikowania kwasów tłuszczowych w jamie ustnej, przypuszczalnie za pomocą receptorów kwasów tłuszczowych znajdujących się na komórkach smakowych. Wcześniejsze badania wykazały, że wrażliwość jamy ustnej danej osoby na kwasy tłuszczowe, w szczególności kwas oleinowy (C18:1) jest związana ze wskaźnikiem masy ciała (BMI), spożyciem tłuszczu w diecie i zdolnością do identyfikacji tłuszczu w żywności. Opracowaliśmy wiarygodną i powtarzalną metodę oceny doustnej chemorecepcji kwasów tłuszczowych przy użyciu mleka i emulsji C18:1 wraz z procedurą rosnącego trójkąta wymuszonego wyboru. Równolegle opracowano matrycę pokarmową do oceny zdolności danej osoby do postrzegania tłuszczu, a także prostą metodę oceny upodobania do tłustych potraw. Jako dodatkową miarę fotografia języka jest używana do oceny gęstości brodawek, przy czym większa gęstość często wiąże się ze zwiększoną wrażliwością smakową.

Wprowadzenie

Nadmierne spożycie tłuszczu w diecie jest potencjalnym czynnikiem przyczyniającym się do przyrostu masy ciała^1-3, a otyłość stała się współczesną globalną epidemią. Badania sugerują, że wyższy poziom spożycia tłuszczu, szczególnie w ramach diety ad libitum, może wiązać się z wyższym BMI^2,3, jednak czynniki wpływające na spożycie tłuszczu w diecie i preferencje są dalekie od jasności. Poszukiwanie mechanizmów leżących u podstaw spożywania tłuszczu jest zatem oczywistym celem, a szczególnie interesujący jest doustny mechanizm odpowiedzialny za wykrywanie tłuszczu, potocznie określany jako "smak kwasów tłuszczowych"².

Z ewolucyjnego punktu widzenia, system smakowy prawdopodobnie służył jako strażnik układu trawiennego, kierując zużyciem składników odżywczych o dużej gęstości energetycznej i wydalaniem potencjalnie toksycznych związków⁴. Zmysł smaku jest wywoływany przez wyspecjalizowane komórki receptorów smaku, które są rozmieszczone w trzech typach brodawek językowych; brodawki grzybotwórcze, liściaste i okołorozdzielcze, z których każda może zawierać do kilkuset kubków smakowych⁵. Oprócz powszechnie akceptowanych pięciu prototypowych smaków (słodki, słony, kwaśny, gorzki i umami), nie jest całkowicie zaskakujące, że zasugerowano doustny mechanizm wykrywania tłuszczów lub, co bardziej prawdopodobne, produktów ich rozkładu kwasów tłuszczowych⁶.

Poprzednie badania konsekwentnie wykazywały, że kwasy tłuszczowe mogą być wykrywane w jamie ustnej w zakresie^{stężeń 7-11}, pomimo faktu, że nie jest to 'smak' w tradycyjnym sensie, ponieważ nie ma z nim jednej dostrzegalnej jakości percepcyjnej (tj. słodkiej)¹². Prace przeprowadzone w naszym laboratorium zwróciły uwagę na funkcjonalne implikacje upośledzonej chemorecepcji kwasów tłuszczowych, a mianowicie na masę ciała i spożycie tłuszczu w diecie. Osoby, które są mniej zdolne do wykrywania kwasów tłuszczowych (hipowrażliwe), wydają się mieć wyższy wskaźnik masy ciała (BMI) i zużywają więcej energii⁹, podczas gdy zaobserwowano również związek między doustną wrażliwością na kwasy tłuszczowe a spożyciem tłuszczu w diecie; Oznacza to, że wykazano, że osoby niedowrażliwe na kwasy tłuszczowe spożywają więcej tłuszczów zwierzęcych, w tym mięsa, wysokotłuszczowego nabiału i tłustych past do smarowania, z których wszystkie są uważane za czynniki przyczyniające się^{do przyrostu} masy ciała. Ponadto osoby, które są bardziej wrażliwe na kwasy tłuszczowe, wydają się być lepiej przygotowane do rozróżniania próbek o różnej zawartości tłuszczu⁹. Podczas gdy innym grupom badawczym nie udało się znaleźć podobnych powiązań^10,14,15, ten rosnący obszar badań pozostaje intrygujący.

Te indywidualne różnice w chemorecepcji kwasów tłuszczowych wydają się być nieco modulowane przez czynniki środowiskowe, w tym dietę. Nawykowe spożycie tłuszczu wiąże się z upośledzoną chemorecepcją doustnych kwasów tłuszczowych, a w konsekwencji ze zwiększoną preferencją i zwiększonym spożyciem tłuszczu w diecie¹⁶. Oprócz adaptacji smakowej, przewód pokarmowy (GI) wydaje się również reagować na takie zmiany w spożyciu tłuszczu¹⁷, a upośledzona wrażliwość na kwasy tłuszczowe w przewodzie pokarmowym może być związana z niezdolnością do generowania odpowiednich reakcji sygnalizujących sytość, które zniechęcają do nadmiernego zużycia energii¹⁸.

Oprócz czynników środowiskowych, chemorecepcja kwasów tłuszczowych może być również podyktowana genetycznymi lub fizjologicznymi różnicami między osobami, w tym koncentracją gęstości brodawek grzybowych (i przypuszczalnie receptorów smaku) na języku danej osoby¹⁹. Większa gęstość grzybowatych brodawek językowych została powiązana ze zwiększoną wrażliwością doustną na liczne związki wykrywane doustnie, w tym 6-n-propylotiouracyl (PROP)²⁰, cukier²¹ i sól²², podczas gdy inni zauważyli również związek z percepcją kremu²³. Superdegustatorzy PROP (którzy przypuszczalnie mają większą liczbę brodawek grzybowatych) są w stanie odróżnić sosy sałatkowe o wysokiej zawartości tłuszczu od niskotłuszczowych²⁴ i są w stanie dokładniej rozróżnić zawartość tłuszczu i kremowość produktów mlecznych niż osoby niedegustujące^23,25. Na tym etapie jednak związek między gęstością brodawek grzybowatych a wykrywaniem "smaku" doustnych kwasów tłuszczowych jest nieznany.

Podstawą badań nad chemorecepcją doustnych kwasów tłuszczowych u ludzi jest zastosowanie różnych technik sensorycznych. Identyfikacja indywidualnej zmienności w wykrywaniu doustnych kwasów tłuszczowych jest głównym celem i w dużej mierze zależy od określenia progów wykrywania kwasów tłuszczowych, czyli najniższego punktu, w którym można wykryć kwas tłuszczowy w roztworze⁹. Podczas gdy konkretna metoda testowania i zastosowany nośnik bodźca różnią się w zależności od literatury i grup badawczych, typowa procedura polega na przedstawieniu uczestnikowi zestawu zemulgowanych roztworów kwasów tłuszczowych i kontrolnych (bez kwasów tłuszczowych) i określeniu, która próbka jest "nieparzysta". W tym miejscu przedstawiamy sprawdzoną, wiarygodną i powtarzalną metodę wyznaczania progu¹⁰ przy użyciu zemulgowanych roztworów mleka i procedury rosnącego trójkąta wymuszonego wyboru.

Zakres, w jakim doustna wrażliwość na kwasy tłuszczowe wpływa na dietę, a mianowicie na spożywanie tłustych potraw i zdolność do dostrzegania tłuszczu w żywności, jest również interesujący i tutaj również informujemy o dwóch dodatkowych sprawdzonych technikach, aby jeszcze bardziej poszerzyć nasze zrozumienie chemorecepcji kwasów tłuszczowych. Upodobanie do tłustych potraw można zidentyfikować, dostarczając osobom próbki dostępnych na rynku produktów spożywczych, zarówno zwykłych, jak i niskotłuszczowych, które są proszone o wskazanie upodobań do każdej^{z 16}. Jeśli chodzi o percepcję tłuszczu, nasze laboratorium opracowało zadanie rankingowe tłuszczu, mające na celu ocenę zdolności danej osoby do wykrywania tłuszczu w budyniu, typowej matrycy żywnościowej¹⁶. Aby ocenić genetyczne lub fizjologiczne różnice między osobnikami, powszechnie stosowana metoda fotografii języka polega na barwieniu, fotografowaniu i ilościowym określaniu brodawek grzybowatych²⁶. Chociaż stosowanie tej techniki w badaniach nad kwasami tłuszczowymi jest w powijakach, rosnące zastosowanie, zwłaszcza w grupach populacji szczupłych, z nadwagą / otyłością, może pomóc w zidentyfikowaniu nieodłącznych przyczyn nadmiernego spożycia tłuszczu.

Protokół

Poniższe techniki zostały zatwierdzone do użytku przez Komisję Etyki Badań nad Ludźmi Uniwersytetu Deakin.

1. Demografia i antropometria

1. Zarejestruj dane demograficzne uczestników, w tym datę urodzenia oraz płeć.
2. W punkcie wyjściowym (oraz w innych punktach badania, jeśli projekt zakłada badanie czasowe) dokonaj pomiaru wzrostu i masy ciała. Upewnij się, że uczestnicy zdjęli obuwie, ciężkie kurtki lub inne elementy garderoby oraz wyjęli z kieszeni wszystkie ciężkie przedmioty.
   1. Zmierz wzrost uczestnika za pomocą stadiometru. Zapisz pomiar z dokładnością do 1 cm.
   2. Zważ uczestników przy użyciu odpowiedniej wagi. Zapisz masę ciała z dokładnością do 1 g.
   3. Oblicz BMI korzystając z równania: masa ciała (kg)/wzrost² (m²). Na tej podstawie podziel uczestników zgodnie ze standardowymi wartościami definicji BMI: prawidłowa masa ciała 18,5-25 kg/m², nadwaga 25-30 kg/m² lub otyłość >30 kg/m^{2 27}.

2. Przygotowanie próbek do oceny progu percepcji kwasów tłuszczowych w jamie ustnej

1. W charakterze bazy do oceny progu smakowego kwasów tłuszczowych należy zastosować chude mleko UHT. Produkt można nabyć i przechowywać w dużych ilościach, jeśli jest to konieczne; w zamkniętym opakowaniu zachowuje trwałość do 6 miesięcy lub do daty ważności. Należy przygotować 2 rodzaje nośników: nośnik z dodatkiem kwasu tłuszczowego oraz nośnik kontrolny. Objętość roztworów przygotowanych do badań zależy od liczby uczestników. Poniższy protokół podaje typowe ilości dla 2 uczestników.
2. Przygotować bazowy roztwór mleka do wykorzystania zarówno w nośniku kontrolnym, jak i w nośniku z kwasem tłuszczowym, umieszczając 5% w:v gumę arabską klasy spożywczej (np. 100 g na 2 L mleka) w zlewce szklanej o pojemności 3 L. W razie potrzeby należy nawodnić gumę przed użyciem (zależy to od producenta gumy).
3. Do gumy dodać 0,01% w:v EDTA, aby zapobiec utlenianiu (np. 200 mg na 2 L mleka).
4. Przeznaczyć około 1 L chudego mleka na jednego uczestnika (np. dla 2 uczestników użyć 2 L mleka) i wlać do zlewki.
5. Za pomocą mieszadła laboratoryjnego z sitkiem emulgującym homogenizować roztwór przy 12 000 rpm przez 2 min. Odstawić roztwór.
6. Przygotować roztwory kwasów tłuszczowych, używając C18:1 klasy spożywczej. W razie potrzeby stopień utlenienia można ocenić za pomocą chromatografii gazowej.
7. Przygotować serię 13 wariantów nośnika kwasu tłuszczowego (chude mleko UHT) z rosnącymi stężeniami C18:1 (0,02, 0,06, 1, 1,4, 2, 2,8, 3,8, 5, 6,4, 8, 9,8, 12 i 20 mM/L). W tym celu należy oznakować zlewki szklane o pojemności 250 ml odpowiednimi stężeniami.
8. Do każdej zlewki dodać 5% parafiny ciekłej (np. 5 ml parafiny na 100 ml roztworu mleka).
9. W zależności od stężenia C18:1 dodać do każdej zlewki odpowiednią ilość C18:1 (patrz Tabela 1).

Stężenie C18:1 (mM)	μl/100 ml
0.02	0.56
0.06	1.9
1	31.5
1.4	44.1
2	63.1
2.8	88.4
3.8	119.9
5	157.8
6.4	202
8	250
9.8	309
12	380
20	631.2

Tabela 1. Przykład stężenia C18:1 na 100 ml roztworu. Do przygotowania serii 13 emulsji do testowania progu wrażliwości na kwasy tłuszczowe drogą doustną wykorzystuje się zwiększające się stężenia (µl/L) C18:1.

10. Po użyciu napełnić pojemnik z C18:1 azotem N₂ w celu zminimalizowania utleniania i przechowywać w temperaturze poniżej 4 °C.
11. Dodać podstawowy roztwór mleka do każdego zlewków z kwasami tłuszczowymi do uzyskania całkowitej objętości 100 ml. Odstawić.
12. Z pozostałego roztworu podstawowego przygotować nośnik kontrolny. W szklanym zlewku o pojemności 2 L dodać 5% pozostałej objętości w postaci parafiny ciekłej (np. 35 ml parafiny ciekłej przy końcowej objętości 750 ml) wraz z pozostałym roztworem podstawowym i homogenizować przez 30 s na każde 100 ml cieczy.
13. Homogenizować nośnik kontrolny przez 30 s na każde 100 ml. Ten krok wykonuje się przed przygotowaniem roztworów kwasów tłuszczowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu C18:1.
14. Homogenizować każdy nośnik kwasu tłuszczowego, zaczynając od najniższego stężenia, przez 30 s na każde 100 ml.
15. Zdezynfekować homogenizator zarówno przed, jak i po przeprowadzonych badaniach.
16. Ponieważ proces homogenizacji może podnieść temperaturę roztworów, należy sprawdzić temperaturę próbek kontrolnych oraz C18:1 za pomocą termometru. Wszystkie próbki podawać w temperaturze pokojowej (RT, 20 °C).
17. Próbki mleka muszą być świeżo przygotowane w dniu przeprowadzania badań. Przed testami należy spróbować każdego roztworu, aby ocenić jego świeżość i przydatność.
    Uwaga: W zależności od wymaganej objętości, przygotowanie roztworów zajmie minimum 60 min.

3. Testy progu smakowego kwasów tłuszczowych podawanych doustnie

1. Upewnij się, że uczestnicy powstrzymali się od jedzenia i picia (w tym kawy, gumy do żucia, płynu do płukania ust itp.) przez co najmniej 1 hr przed badaniem.
2. Zminimalizuj bodźce pozasmakowe, przeprowadzając badanie w czerwonym oświetleniu, przy czym uczestnicy powinni nosić żepki do nosa.
3. W celu wyznaczenia oralnych progów detekcji kwasów tłuszczowych zastosuj procedurę wznoszącego trójkąta z wymuszonym wyborem. Plastikowe kubeczki o pojemności 30-ml oznakuj trzycyfrowym numerem identyfikacyjnym. Dostarcz każdemu uczestnikowi zestaw trzech roztworów o objętości 20-ml w losowej kolejności: dwa nośniki kontrolne i jeden nośnik kwasu tłuszczowego o najniższym stężeniu C18:1 (0.02 mM).
4. Aby wyznaczyć oralny próg detekcji kwasu tłuszczowego u uczestnika, poleć mu skosztowanie każdego roztworu od lewej do prawej i wyplucie go do zlewu. Poproś uczestników, aby nie połykali próbek.
5. Poproś uczestnika o wskazanie, która z 3 próbek jest „odstająca” lub „różna”; w przypadku niepewności uczestnik musi dokonać wyboru (wymuszony wybór).
6. Uczestnicy powinni płukać jamę ustną wodą zdejonizowaną po każdym zestawie próbek.
7. W przypadku poprawnej identyfikacji dostarcz uczestnikowi drugi zestaw 3 roztworów (2 kontrolnych i 1 roztwór kwasu tłuszczowego w losowej kolejności) o tym samym stężeniu kwasu tłuszczowego. W przypadku błędnej identyfikacji dostarcz uczestnikowi drugi zestaw 3 roztworów, ale z następnym wyższym stężeniem C18:1 (0.06 mM).
8. Kontynuuj tę procedurę, dopóki uczestnik nie będzie w stanie poprawnie zidentyfikować „odstającej” próbki 3 razy z rzędu przy tym samym stężeniu. Stężenie, przy którym uczestnik jest w stanie poprawnie zidentyfikować „odstającą” próbkę, zapisuje się jako próg detekcji C18:1 u uczestnika. Graficzną reprezentację tego procesu przedstawiono na Rysunku 1.
9. Na podstawie progu detekcji zaklasyfikuj uczestników jako nadwrażliwych lub niedowrażliwych na C18:1. Zgodnie z dotychczasową literaturą osoby nadwrażliwe mogą wykryć C18:1 przy stężeniach <3.8 mM, natomiast osoby niedowrażliwe wymagają stężeń >3.8 mM.
   Uwaga: W zależności od liczby błędnych odpowiedzi procedura badawcza może trwać od 10 do 30 min.

Rycina 1. Wstępująca procedura trójkąta wymuszonego wyboru stosowana do wyznaczania progów detekcji kwasów tłuszczowych. Uczestnicy otrzymują trzy roztwory (dwa roztwory kontrolne i jeden roztwór C18:1 o określonym stężeniu) i proszeni są o zidentyfikowanie „próbki odmiennej”. W przypadku poprawnej odpowiedzi uczestnicy otrzymują drugi zestaw próbek z tym samym stężeniem C18:1. W przypadku błędnej odpowiedzi uczestnik otrzymuje kolejny zestaw próbek o wyższym stężeniu C18:1. Procedura ta jest kontynuowana do momentu poprawnej identyfikacji trzech „odmiennych” roztworów przy danym stężeniu. Punkt ten uznaje się za „próg detekcji kwasów tłuszczowych” danej osoby.

4. Zadanie rankingowe dotyczące tłuszczów

Zadanie to polega na degustacji przez uczestników czterech próbek budyniu instant o różnej zawartości tłuszczu (0, 2, 6 i 10%) oraz uszeregowaniu ich w kolejności rosnącego postrzeganego stężenia tłuszczu.

1. Przygotuj jedną partię budyniu, używając beztłuszczowego instant waniliowego proszku do budyniu zgodnie z instrukcją na opakowaniu. W misce nadającej się do użytku w kuchence mikrofalowej wymieszaj 2 łyżki proszku do budyniu, 1 łyżkę cukru i 2 szklanki beztłuszczowego mleka. Jeśli sugerowany produkt jest niedostępny, można go zastąpić podobnym beztłuszczowym produktem typu instant (np. budyniem gotowym do spożycia).
2. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej o mocy 1 400 W na wysokiej mocy w odstępach 30 s przez łącznie około 5 min lub do zagęstnienia. Czas ten może się różnić w zależności od marki budyniu i mocy użytej kuchenki mikrofalowej. Pozostaw budyń do ostygnięcia.
3. Oznacz cztery miski kuchenne o pojemności 500 ml (lub podobne) wartościami procentowymi zawartości tłuszczu.
4. Podziel budyń na 4 oddzielne porcje po 100 g.
5. Do każdej miski dodaj odpowiednio 0, 2, 6 i 10% oleju roślinnego, aby uzyskać pożądane zawartości tłuszczu (np. w partii 100 g dodaj 0 ml, 2 ml, 6 ml i 10 ml oleju roślinnego, aby osiągnąć odpowiednie wartości procentowe tłuszczu) i wymieszaj. Dokładnie wymieszaj każdą próbkę, aby upewnić się, że wszystkie składniki zostały całkowicie połączone.
6. Oznacz cztery plastikowe kubeczki porcjowe o pojemności 30 ml zrandomizowanymi liczbami trzycyfrowymi. Napełnij kubeczki 20 g każdego budyniu (jeden rodzaj budyniu na kubeczek).
7. Przechowuj próbki w lodówce przed testowaniem i podawaj schłodzone (4 °C).
8. Przeprowadź testy przy czerwonym świetle, aby zminimalizować wskazówki wizualne.
9. Poproś uczestników o spróbowanie, przełknięcie i uszeregowanie 4 budyni od postrzeganej najniższej do najwyższej zawartości tłuszczu; w zależności od ich odpowiedzi otrzymają ocenę w skali do 5.
10. Sposób punktowania dla tego zadania przedstawiono w Tabeli 2.
    Uwaga: Przybliżony czas przygotowania próbek budyniu wynosi 30 min. Zadanie polegające na szeregowaniu zawartości tłuszczu nie powinno zająć więcej niż 10 min.

Kolejność rankingu	Wynik
0, 2, 6, 10	5
2, 0, 6, 10	4
0, 2, 10, 6	3
0, 6, 2, 10	2
1, 6, 10, 2	1
6, 0, 2, 10	1
2, 10, 6, 0	1
2, 6, 0, 10	0
6, 2, 10, 0	0
0, 10, 2, 6	0

Tabela 2. Punktacja w zadaniu rankingowym zawartości tłuszczu. Uczestnicy otrzymują 4 próbki budyniu z dodatkiem 0, 2, 6 lub 10% tłuszczu. Uczestnicy są proszeni o uszeregowanie próbek od najniższej do najwyższej zawartości tłuszczu i przyznanie od 0 do 5 punktów (gdzie 5 jest wartością maksymalną).

5. Preferencja do tłustych pokarmów

1. Przygotuj małe próbki (5-20 g) produktów spożywczych dostępnych w sprzedaży, w wersjach standardowych i niskotłuszczowych. Produkty obejmują wersje standardowe i niskotłuszczowe następujących artykułów: serek kremowy (podany na krakersie), mus czekoladowy, ser, suche ciastka, dip z masła orzechowego podany na kawałku marchewki, majonez, sos sałatkowy (podany na plastrze ogórka) oraz jogurt.
2. Oznacz każdą próbkę losowym trzema cyfrowym numerem w celu identyfikacji.
3. Przedstawiaj próbki w losowej kolejności, aby zapobiec efektom kolejności.
4. Poinstruuj uczestników, aby degustowali każdą próbkę indywidualnie. Produkty są spożywane, przy czym uczestnicy mogą zjeść tyle z każdej próbki, ile chcą.
5. Poproś uczestników o ocenę, w jakim stopniu każda próbka im smakuje lub nie smakuje. Poziom preferencji zmierz za pomocą 100-mm hedonicznej uogólnionej skali wielkości (gLMS; patrz Rysunek 2), obejmującej zakres od najsilniejszego możliwego niesmaku do najsilniejszej możliwej przyjemności. Zapisz ocenę, stawiając pionową kreskę w punkcie reprezentującym stopień uznania lub niechęci uczestnika do danego produktu.

Rysunek 2. Hedoniczna gLMS. Hedoniczna gLMS^30,31 wykorzystywana do oceny preferencji zarówno w stosunku do zwykłych, jak i niskotłuszczowych produktów spożywczych dostępnych w handlu. Uczestnicy degustują i oceniają każdą próbkę, stawiając pionową linię w punkcie, który najlepiej reprezentuje ich poziom lubienia lub niechęć do próbki.

6. W tym zadaniu nie minimalizuje się bodźców niesmakowych, dlatego należy je przeprowadzić przy normalnym oświetleniu i nie nakładać na uczestników klipsów na nos.

6. Fotografia języka

1. Przygotuj aparat fotograficzny i statyw do wykonywania zdjęć. Wystarczające będzie zwykłe oświetlenie wnętrza.
2. Ustaw aparat w trybie makro (lub podobnym) do fotografowania z bliskiej odległości.
3. Za pomocą dziurkacza wytnij otwór o średnicy 6 mm w kwadracie z papieru filtracyjnego o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm (lub podobnych). Oznacz papier numerem identyfikacyjnym uczestnika.
4. W zlewce o pojemności 50 ml wymieszaj niebieski barwnik spożywczy z wodą dejonizowaną w stosunku 1:20. Na każdego uczestnika wymagana jest niewielka ilość roztworu.
5. Wlej 30 ml etanolu klasy spożywczej do zlewki o pojemności 50 ml w celu sterylizacji pęsety.
6. Za pomocą taśmy maskującej wyznacz prostokąt o wymiarach 20 cm x 30 cm na boku stołu testowego (powinien on mieć standardową wysokość biurka), jak pokazano na Rysunku 3a.

Rysunek 3. A) Przygotowanie do fotografowania języka. Prezentacja ustawienia stołu wymaganego przed wykonaniem zdjęć języka. B) Fotografowanie języka. Prezentacja metody fotografowania języka

7. Poproś uczestników, aby położyli łokcie na wyznaczonych narożnikach prostokąta, oparli brodę na dłoniach i wygodnie wysunęli język, stabilizując tę pozycję za pomocą warg (Rysunek 3b). Uczestnik musi pozostać w tej pozycji przez cały czas trwania badania.
8. Używając prostokątnego (1,5 cm x 3 cm) paska papieru filtracyjnego, krótko osusz dolną część języka.
9. Zanurz patyczek higieniczny w roztworze barwnika spożywczego z wodą i nanieś niewielką ilość barwnika na przednią powierzchnię grzbietową języka, bezpośrednio po prawej stronie linii środkowej i blisko wierzchołka (patrz Rysunek 4). Ponownie osusz język papierem filtracyjnym.
10. Osusz ręcznikiem papierowym pęsetę wysterylizowaną etanolem i za pomocą pęsety umieść wcześniej oznakowany papier filtracyjny o powierzchni 1,5 cm² na języku uczestnika, tak aby otwór o średnicy 6 mm znajdował się nad niebieskim barwnikiem spożywczym (patrz Rysunek 4).
11. Używając lampy błyskowej, wykonaj trzy cyfrowe zdjęcia języka uczestnika. W celu zachowania poufności upewnij się, że widoczne są jedynie usta i język uczestnika.
12. Usuń papier filtracyjny o powierzchni 1,5 cm² z języka uczestnika pęsetą ponownie wysterylizowaną etanolem spożywczym. Prześlij zdjęcia do programu do edycji zdjęć i za pomocą funkcji powiększania policz wszystkie widoczne brodawki grzybowate.
13. Odróżnij brodawki grzybowate od innych brodawek jako większe, wyniesione struktury w kształcie grzyba. Nie chłoną one roztworu barwnika tak silnie, przez co mają znacznie jaśniejszy kolor.
    Uwaga: Fotografowanie języka nie powinno trwać dłużej niż 10 min.

Rycina 4. Kwantyfikacja gęstości brodawek grzybowatych. Lokalizacja obszaru o średnicy 6 mm do oceny brodawek grzybowatych. Przy użyciu oprogramowania do edycji zdjęć naniesiono numery wskazujące każdą brodawkę grzybowatą.

Wyniki

Opisane powyżej metody są istotne, ponieważ pojawiające się dowody wskazują, że zaburzona chemorecepcja kwasów tłuszczowych w jamie ustnej i przewodzie pokarmowym może być powiązana ze wzrostem BMI oraz rozwojem otyłości¹⁷. W kilku badaniach wykorzystano opisane protokoły do analizy wykrywania kwasów tłuszczowych w jamie ustnej, a nasza niedawna publikacja wykazała, że metoda ta jest zarówno wiarygodna, jak i powtarzalna¹⁰. Badania z zastosowaniem tej metodologii pozwoliły na wiarygodne określenie indywidualnych progów wykrywania kwasów tłuszczowych w jamie ustnej poprzez zidentyfikowanie punktu, w którym uczestnicy są w stanie wykryć różnicę między próbkami mleka⁹. Po trzech sesjach testowych z wykorzystaniem tego protokołu, Stewart et al.⁹ stwierdzili, że średni próg wykrywania dla C18:1 wynosił 2,2 ± 0,1, przy progach wykrywania w zakresie 1-6,4 mM (patrz Rycina 5). Niedawno ustaliliśmy zakres progu wykrywania C18:1 od 0,26-12 mM (średnia: 2,64 ± 0,7 mM)¹⁰. Wyniki te potwierdzają tezę, że kwasy tłuszczowe mogą być wykrywane w jamie ustnej i że istnieją wyraźne różnice indywidualne w wrażliwości na C18:1. Na podstawie tych wyników jesteśmy w stanie zaklasyfikować osoby jako nadwrażliwe lub niedowrażliwe na C18:1. Osoby nadwrażliwe są w stanie prawidłowo zidentyfikować C18:1 <3,8 mM, podczas gdy osoby niedowrażliwe wymagają stężeń >3,8 mM. Badania w naszym laboratorium wykazały, że wrażliwość w jamie ustnej na C18:1 jest powiązana ze spożyciem tłuszczów w diecie oraz z BMI (Rycina 6), przy czym osoby niedowrażliwe na C18:1 spożywają więcej nasyconych tłuszczów oraz tłuszczów zwierzęcych i mają wyższe BMI¹³. Co ciekawe, w badaniu przeprowadzonym przez Stewarta i Keasta¹⁶ stwierdzono, że stosowanie diety niskotłuszczowej skutkowało zwiększoną wrażliwością na C18:1 zarówno u uczestników szczupłych, jak i z nadwagą (Rycina 7). Jednak badanie to wykazało również, że gdy uczestnicy stosowali dietę wysokotłuszczową, u osób szczupłych stwierdzono zmniejszoną wrażliwość na C18:1, podczas gdy u osób z nadwagą nie odnotowano zmian w wrażliwości smakowej (Rycina 8). Sugeruje to, że nawykowe spożywanie diety wysokotłuszczowej, co jest bardziej prawdopodobne u osób z nadwagą, może prowadzić do osłabienia chemorecepcji kwasów tłuszczowych²⁸. Jednak ze względu na brak różnic w wrażliwości wyjściowej między uczestnikami szczupłymi a osobami z nadwagą, wyniki te mogą wskazywać na to, że osoby szczupłe są po prostu bardziej podatne na zmiany dietetyczne w zakresie spożycia tłuszczów. Może to również sugerować, że to obecność konkretnej interwencji (dieta wysokotłuszczowa vs niskotłuszczowa) mogła wpłynąć na wyniki, a nie nawykowe diety, które mogły lub nie mogły różnić się od diety interwencyjnej. Mimo to badanie to wskazuje, że istnieją pewne fundamentalne różnice między osobami szczupłymi a osobami z nadwagą w zakresie wrażliwości smakowej na kwasy tłuszczowe, co wymaga dalszych badań.

Rycina 5. Progi detekcji smaku C18:1. Wykazano znaczną zmienność w czułości na C18:1, przy czym uczestnicy byli w stanie wykryć C18:1 w szerokim zakresie stężeń (1 mM-6,4 mM).

Rycina 6. Progi detekcji smaku C18:1 i ich powiązanie z BMI. Wykazano związek między zdolnością do wykrywania C18:1 a składem ciała, zgodnie z którym osoby z wyższymi progami detekcji (osobniki hipoczułe) mają istotnie wyższe wartości BMI (P = 0,002, r²= 0,467).

Rysunek 7. Progi detekcji C18:1 po zastosowaniu niskotłuszczowej diety. Po 4 tygodniowym spożywaniu niskotłuszczowej diety progi detekcji C18:1 wzrosły zarówno u osób szczupłych, jak i z otyłością.

Rysunek 8. Progi detekcji C18:1 po zastosowaniu wysokotłuszczowej diety. Po 4 tygodniach stosowania wysokotłuszczowej diety u osób szczupłych odnotowano obniżoną wrażliwość na C18:1 (P = 0,006), natomiast u osób z nadwagą nie stwierdzono zmian (P = 0,609).

Podobnie jak w przypadku wpływu diety na progi detekcji kwasów tłuszczowych, istnieją badania sugerujące, że preferencje smakowe mogą być plastyczne i zmieniać się pod wpływem ekspozycji. Na przykład wydaje się, że dieta wysokotłuszczowa zwiększa preferencję dla produktów o wyższej zawartości tłuszczu, natomiast efekt odwrotny występuje po spożywaniu diety niskotłuszczowej¹⁶. Jednakże zmiany te nie były spójne w literaturze. Wydaje się, że zmiany preferencji są zależne od czasu, przez który badana osoba stosowała dietę wysokotłuszczową lub niskotłuszczową. W szczególności Mattes²⁹ stwierdził istotne zmiany w preferencjach żywieniowych uczestników po 12 tygodniach stosowania diety o zredukowanej zawartości tłuszczu, podczas gdy Stewart i Keast¹⁶ odnotowali jedynie sporadyczne i marginalne zmiany po czterech tygodniach stosowania podobnej diety. Spożywanie diety wysokotłuszczowej zmieniło preferencje uczestników w odniesieniu do jogurtu, przy czym preferencje dla jogurtu niskotłuszczowego wzrosły, co było sprzeczne z oczekiwanymi wynikami (Baseline (BL): 19,44 ± 5,73, Tydzień 4 (WK4): 21,94 ± 5,21, P = 0,046). Ponadto, po czterech tygodniach diety niskotłuszczowej, preferencje dla masła niskotłuszczowego wzrosły u wszystkich uczestników (BL: 6,23 ± 4,26, WK4: 7,32 ± 3,04, P = 0,046). Preferencje dla jogurtu niskotłuszczowego wzrosły tylko u uczestników szczupłych (BL: 2,51 ± 3,26, WK4: 3,68 ± 4,94, P = 0,07), natomiast preferencje dla musu niskotłuszczowego spadły u wszystkich uczestników (P = 0,01).

Zdolność do wykrywania tłuszczu w żywności ocenia się, prosząc uczestników o skosztowanie i uszeregowanie serii kremów budyniowych o różnej zawartości tłuszczu. Percepcję tłuszczu określa się na podstawie tego, jak dobrze uczestnicy potrafili uszeregować próbki. Znane jest, że percepcja tłuszczu zmienia się pod wpływem diety; na przykład stosowanie diety niskotłuszczowej doprowadziło do poprawy wyników uczestników w prawidłowym identyfikowaniu i szeregowaniu stopnia zatłuszczenia w każdej próbce budyniu¹¹. Ponadto wydaje się, że istnieje związek między wrażliwością na C18:1 a identyfikacją i szeregowaniem zawartości tłuszczu⁴. Rzeczywiście, osoby nadwrażliwe na C18:1 radziły sobie znacząco lepiej w zadaniu szeregowania tłuszczu (4,3 ± 0,6) w porównaniu do osób niedowrażliwych (2,3 ± 0,1, P = 0,02) (wyniki w skali do maksymalnie pięciu punktów)⁹. Wskazuje to, że osoby bardziej wrażliwe na kwasy tłuszczowe lepiej odróżniały cztery różne stężenia tłuszczu w budyniu. Chociaż zaobserwowano tendencję do poprawy wyników po czterotygodniowym stosowaniu diety niskotłuszczowej, zmiana ta nie była istotna statystycznie (BL: 1,3 ± 0,3, WK4: 2 ± 0,3, P = 0,077)¹⁶.

Gęstość brodawek, tj. liczba brodawek (a tym samym pączków smakowych) występujących na języku, różni się między osobnikami i jest wskaźnikiem funkcji smakowej. Wyższa gęstość brodawek grzybowatych została powiązana ze zwiększoną wrażliwością smakową na związki obejmujące sacharozę²¹ oraz gorzką substancję PROP²⁰. Gęstość brodawek językowych, określona na podstawie fotografii języka, znacznie różni się między badanymi. Na przykład Zhang et al.²¹ stwierdzili istotne różnice indywidualne między uczestnikami, w zakresie od stężenia 7,07 ± 0,35/cm² do 233,43 ± 0,00/cm² (dane dotyczyły jednego uczestnika), podczas gdy inni²⁶ wykazali, że średnie stężenie brodawek grzybowatych wynosi 156,00 ± 5,86/cm². Ponadto stwierdzono, że struktura brodawek może różnić się znacząco między osobnikami pod względem wysokości, szerokości i kształtu,²¹ choć dowody dotyczące możliwych konsekwencji tych różnic są ograniczone. Biorąc pod uwagę wcześniejsze odkrycia łączące liczbę brodawek z wrażliwością smakową, prawdopodobne jest, że podobna zależność może istnieć również w przypadku wrażliwości jamy ustnej na kwasy tłuszczowe, gdzie osoby bardziej wrażliwe na kwasy tłuszczowe mogą mieć wyższą gęstość brodawek smakowych, a zatem większą liczbę receptorów kwasów tłuszczowych w jamie ustnej. Chociaż powiązanie to nie zostało jeszcze ustalone, stanowi ono nowy obszar badań, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw nadmiernego spożycia tłuszczów.

Dyskusja

Techniki opisane do określania progów doustnych kwasów tłuszczowych, upodobania do tłustych potraw i gęstości brodawek języka zostały zwalidowane i wykorzystane w wielu opublikowanych pracach w ostatnich latach i sugerujemy, aby ocena progu doustnych kwasów tłuszczowych, zadanie klasyfikacji tłuszczu i upodobanie do tłustych potraw były wykonywane w dwóch egzemplarzach w każdym odpowiednim punkcie czasowym badania. Toczy się dyskusja na temat optymalnej metody oceny progów wykrywalności³². W szczególności skład stosowanych rozwiązań różni się w zależności od laboratorium, podobnie jak sama metodologia. W szczególności kwas tłuszczowy zastosowany w tym protokole, C18:1, uważamy, że jest ogólnie reprezentatywnym i łatwym w użyciu kwasem tłuszczowym, w przeciwieństwie do innych kwasów tłuszczowych, w tym kwasu linolowego (C18:2) i kwasu laurynowego (C12:0), które były stosowane wcześniej⁹. C18:1 jest powszechnie stosowany w żywności i w przeciwieństwie do C12:0 jest płynny w temperaturze pokojowej i jest bardziej odporny na utlenianie niż C18:2⁹. Wykazano również, że C18:1 dostarcza wiarygodnych danych z wielu sesji testowych i jest silnie skorelowany z C18:2 i C12:0¹⁰. Co więcej, C18:1 został szeroko zbadany w odpowiedniej literaturze i dlatego jest bardziej pomocny w porównaniach.

Główną różnicą między protokołem przedstawionym w niniejszym artykule a innymi procedurami stosowanymi w innych laboratoriach są nośniki używane do prezentowania bodźców kwasów tłuszczowych oraz systematyczne podejście, za pomocą którego określa się progi wykrywalności. Dwa główne nośniki kwasów tłuszczowych stosowane w literaturze to mleko beztłuszczowe^10,17 i emulsje wodne⁶. Chociaż oba wykazały skuteczność w określaniu progu kwasów tłuszczowych, uczestnicy mogą być bardziej skłonni do zidentyfikowania smaku tłuszczu w mleku, to znaczy rzadko zdarza się smak kwasów tłuszczowych w wodzie, co może skutkować niższymi poziomami zewnętrznej trafności w badaniach wykorzystujących bazę wodną. Mleko beztłuszczowe stanowi nośnik chemorecepcji kwasów tłuszczowych, bez uszczerbku dla ważności. Chociaż te dwie metody nie zostały jeszcze bezpośrednio porównane w literaturze, wiadomo, że kwasy tłuszczowe są słabo rozpuszczalne w wodzie³³. Ze względu na rozpuszczalność kwasów tłuszczowych w roztworach na bazie mleka, emulsja ta może być zarówno dłużej przechowywana, jak i bardziej jednorodna niż roztwory na bazie wody, choć nie zostało to jeszcze potwierdzone. Wdrażając tę metodologię, należy pamiętać, że wolne kwasy tłuszczowe mogą być naturalnie obecne w mleku³⁴ i w związku z tym produkt powinien być dobrze zużyty przed upływem terminu ważności, aby zapobiec wzrostowi ilości wolnych kwasów tłuszczowych (które rozwijają się wraz z wiekiem) i potencjalnej ingerencji w działanie progu smakowego. Pomyślne przygotowanie rozwiązań zależy od wielu czynników. Po pierwsze, konieczna jest kolejność, w jakiej dodawane są "składniki". Etapy przygotowania nośnika powinny być dokładnie zgodne z opisanymi wcześniej, aby zapewnić prawidłowy skład nośnika i stabilną emulsję. Po drugie, temperatura musi być kontrolowana. Każda próbka musi zostać przedstawiona uczestnikom w RT, aby upewnić się, że uczestnicy nie wykryją "próbki nieparzystej" z powodu czynników innych niż "smak". Na koniec wszystkie próbki muszą być prawidłowo homogenizowane przez sugerowany okres czasu. Chociaż emulsja kwasów tłuszczowych i mleka beztłuszczowego jest bardziej skuteczna niż w przypadku użycia wody, nadal istnieje szansa na oddzielenie emulsji w próbce.

Należy również wziąć pod uwagę szczególną metodę badawczą stosowaną przy oznaczaniu progu dla doustnych kwasów tłuszczowych. W literaturze powszechnie opisano dwie metody oparte na sensoryce; Jedną z nich jest procedura rosnącego trójkąta wymuszonego wyboru, a alternatywna jest metoda schodowa³⁵. Metodologia rosnącego trójkąta wymuszonego wyboru jest uznaną metodą określania progu smaku i może być uważana za przydatną z kilku powodów, w tym z faktu, że w przeciwieństwie do metody schodowej, metoda rosnąca zaczyna się od najniższego stężenia C18:1 (0,02 mM) i wzrasta, aż uczestnik będzie w stanie wykryć obecność kwasu tłuszczowego w roztworze⁹. I odwrotnie, metoda schodowa polega na zwiększaniu lub zmniejszaniu stężenia kwasów tłuszczowych od z góry ustalonego punktu środkowego¹¹. Jednak rozpoczęcie określania progu w punkcie powyżej progu może spowodować odczulenie odpowiedzi upośledzające zdolność degustacji. Co więcej, metoda rosnąca ma mniejsze prawdopodobieństwo, że losowy przypadek wpłynie na wyniki (3,7%) w porównaniu z metodą schodową (11,1%)¹¹. W związku z tym sugerujemy, że metoda rosnącego trójkąta wymuszonego wyboru, w połączeniu z mlekiem beztłuszczowym jako narzędziem do testowania smaku, wydaje się być skutecznym sposobem dokładnego określania progów w jamie ustnej.

Testowanie akceptacji lub upodobania do żywności jest jedną z prostszych ocen przeprowadzanych w ramach badań sensorycznych i jako takie istnieje niewiele problemów, które zwykle się pojawiają. Jednak rodzaj użytej skali upodobań jest ważnym celem. W tym przypadku najskuteczniejszy jest hedoniczny gLMS, ponieważ ma dobrą moc dyskryminacyjną i jest łatwy w użyciu dla uczestników³⁶. Punkty końcowe hedonicznego gLMS są oznaczone deskryptorami "najsilniejsza wyobrażalna niechęć" i "najsilniejsza wyobrażalna sympatia", a uczestnicy oceniają sympatię w odniesieniu do wszystkich hedonicznych doświadczeń, nie tylko pokarmów^30,31. Jest to skuteczne w kontrolowaniu efektów sufitu wytwarzanych przez standardowe 9-punktowe skale, ponieważ wszystkie doświadczenia są brane pod uwagę i porównywane. Co więcej, hedoniczny gLMS jest bardziej zdolny do wykazania większej wariancji indywidualnej, ponieważ skala jest szersza³⁶. Samo testowanie akceptacji żywności może być ograniczone przez prezentowane produkty spożywcze, w tym sensie, że przedstawiamy tylko dwie opcje dla każdego rodzaju żywności. Dalsze badania mogą obejmować kilka kolejnych marek lub rodzajów każdej żywności, z których każda ma inną zawartość tłuszczu, a być może specjalnie wykonane produkty, w których zawartość tłuszczu może być kontrolowana i jest jedyną zmienną. Należy zauważyć, że interpretacja wszystkich danych musi być dokonywana z ostrożnością. Chociaż potencjalny związek między upodobaniami, preferencjami i spożyciem jest prawdopodobny i intrygujący, wyniki są generowane w środowisku laboratoryjnym i mogą istnieć ograniczenia w zastosowaniu tych ustaleń w rzeczywistych sytuacjach.

Ocena gęstości brodawek za pomocą fotografii języka jest trudniejszym procesem, z określonymi krokami, które należy podjąć, aby uzyskać odpowiednie i możliwe do zastosowania wyniki. W szczególności ważne jest zidentyfikowanie prawidłowego typu brodawek. Na ludzkim języku widoczne są trzy rodzaje brodawek smakowych; grzyby, listowić i okrążać⁴. Brodawki grzybowate można jednak łatwo odróżnić jako struktury w kształcie grzybów²⁶ i są to na ogół brodawki, które są rejestrowane podczas ocen wrażliwości. Brodawki grzybowe mają tendencję do wahania się w stężeniu od 5 do 60 na obszar 6 mm³⁷ (w zależności od wrażliwości), chociaż przeprowadzono badania wskazujące, że niektóre osobniki mogą mieć nawet 230 brodawek na tym samym obszarze²¹. Rodzaj zastosowanej kamery ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania odpowiednich wyników i może odpowiadać za tę zmienność. Przed zastosowaniem fotografii cyfrowej w tej dziedzinie, wideomikroskopia była złotym standardem w identyfikacji i rejestrowaniu gęstości brodawek. Ustalono jednak, że ten sam poziom identyfikacji jest możliwy przy użyciu odpowiedniej kamery cyfrowej²⁶. Co więcej, fotografia cyfrowa zajmuje tylko kilka minut, podczas gdy wideomikroskopia może trwać nawet godzinę²⁶. Nie tylko to, ale fotografia cyfrowa może być znacznie mniej kosztowna i bardziej przenośna, co może być pomocne w użyciu w różnych grupach uczestników²⁶. Wreszcie, chociaż naszym celem jest zmierzenie gęstości brodawek grzybowatych pod kątem powiązań z wykrywaniem doustnych kwasów tłuszczowych, sugerujemy również, aby równolegle przeprowadzać progi smakowe dla pięciu prototypowych smaków. Biorąc pod uwagę wcześniejsze powiązania z gęstością brodawek i funkcją smaku, może to służyć jako dodatkowy "środek kontrolny", który może zwiększyć integralność danych, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że jest to nowy obszar badań.

Obszar badań nad chemorecepcją doustną, szczególnie w odniesieniu do kwasów tłuszczowych, jest rozwijający się i dlatego ważne jest, aby wszystkie badania były wykonywane na wysokim poziomie, najlepiej z wykorzystaniem spójnych protokołów, aby umożliwić bezpośrednie porównania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Guma arabska TIC Wstępnie przetestowana WSTĘPNIE UWODNIONA FT Powder	Alchemy Agencies Ltd. NZ	CFR # 21 CFR 184.1330	Aggum spożywczy
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)	Merck	1.08418 0250	Odwadnianie soli disodowej
Homogenizator L4RT	Silverson Longmedow, MA	L4RT
Płynna parafina	Fauldings		Brak numeru katalogowego, ponieważ ciekła parafina jest zwykłym materiałem eksploatacyjnym
Obiektyw aparatu Nikon AF-S VR Micro Nikkor 105-mm f/2.8G IF-ED Statyw	Nikon	2160
SLIK Sprint Pro II	Slik Corporation	611-849
Aparat cyfrowy Nikon D90 z osłoną LCD	Nikon	BM-10
Nitrogen
Tanita Body Scan Composition Monitor Scale	Tanita, Cloverdale, WA, Australia	BC-551
Seca Stadiometer	Medshop Australia, Fairfield, VIC, Australia	MED435