Artykuł metodologiczny

Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51459

⸱

14 maja 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Transplant and Stem Cell Immunobiology Lab, Cardiovascular Research Center, University Hospital Hamburg, 2Cardiovascular Research Center (CVRC) and DZHK University Hamburg, 3Department of Cardiovascular Surgery, University Heart Center Hamburg, 4Center for Interventional Vascular Therapy, Division of Cardiology, Columbia University, 5Cardiovascular Research Foundation, New York, 6Karolinska Institute, Stockholm, 7Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University School of Medicine, Falk Cardiovascular Research Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten film pokazuje dwa modele rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicach mysich i podkreśla różnice w przeroscie mięśniowo-brzuszkowym i miażdżycy.

Streszczenie

Różne laboratoryjne modele gryzoni in vivo do indukcji zwężenia tętnicy zostały stworzone w celu naśladowania chorób, które obejmują tworzenie się blaszki miażdżycowej tętniczej i zwężenie, co obserwuje się na przykład w chorobie niedokrwiennej serca. Przedstawiono tutaj dwa wysoce powtarzalne modele myszy – oba powodujące zwężenie tętnicy, ale każdy z nich opiera się na innej ścieżce rozwoju. Modele reprezentują dwie najczęstsze przyczyny zwężenia tętnicy; Mianowicie pokazano jeden model mysi dla każdego przerostu mięśniowo-błonowego i miażdżycy. W celu wywołania przerostu mięśniowo-intrymalnego wykonuje się uszkodzenie aorty brzusznej za pomocą cewnika balonowego. Do rozwoju blaszki miażdżycowej stosuje się mysi model ApoE -/- w połączeniu z zachodnią dietą tłuszczową. W niniejszym manuskrypcie wymieniono i opisano różne opcje pomiaru i oceny wyników dostosowane do modelu. Wprowadzenie i porównanie tych dwóch modeli dostarcza informacji dla naukowców, którzy mogą wybrać odpowiedni model zwężenia tętnicy zgodnie z zadanym pytaniem naukowym.

Wprowadzenie

W krajach uprzemysłowionych choroba niedokrwienna serca pozostaje główną przyczyną śmiertelności1. Przyczyny zwężenia tętnicy wieńcowej są wielorakie i obejmują przerost mięśniowo-błony wieńcowej oraz miażdżycę, przy czym najczęstszą strategią leczenia pozostaje rewaskularyzacja2. Modele badawcze, które wyraźnie rozróżniają mechanistyczne szlaki przerostu błony wewnętrznej i miażdżycy, są niezbędne do zbadania procesów patobiologicznych i patofizjologicznych w rozwoju blaszki miażdżycowej. W tym filmie przedstawiono dwa różne modele myszy używane do badania rozwoju przerostu mięśniowo-intimalnej lub miażdżycy.

Postuluje się, że przerost mięśniowo-błonowy powstaje za pomocą paradygmatu "reakcji na uraz", pierwotnie opisanego dla miażdżycy3. Mechaniczne przerwanie warstwy śródbłonka prowadzi do intensywnej przebudowy, wzmocnionej przez efekty parakrynne. Istnieje kilka różnych modeli zwierzęcych powszechnie stosowanych do badania przerostu mięśniowo-wewnętrznego. Niektóre grupy używają metalowych urządzeń w aorcie wstępującejszczurów 4. Model denudacji aorty wykonywany za pomocą cewnika balonowego jest również powszechnie stosowany u szczurów laboratoryjnych5,6. Model przerostu błony wewnętrznej wykonany u myszy laboratoryjnych7 implementuje podwiązanie tętnicy szyjnej i indukuje zmiany mięśniowo-błony włosej8. W naszym laboratorium powszechnie stosuje się model denudacji aorty brzusznej – w celu zbadania rozwoju przerostu mięśniowo-błony włosowej – a także humanizowany model restenozy stentu9. Film ten podkreśla, że wybór odpowiedniego eksperymentalnego modelu zwierzęcego ma kluczowe znaczenie dla mechanistycznych lub patofizjologicznych badań zwężenia tętnicy.

modele przerostu mięśni muszą być odróżniane od modeli miażdżycy. W przypadku tych ostatnich myszy z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE -/-) w połączeniu z zachodnią dietą są powszechnie stosowane w celu wywołania zmian miażdżycowych10,11,12,13. Przedstawiono tutaj przykłady indukcji obu tych typów choroby mięśniowo-wewnętrznej u myszy, wraz z różnymi dostosowanymi do modelu opcjami analizy zwężenia naczyń14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace ze zwierzętami powinny być wykonywane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Uzyskaj zgodę instytucjonalną na pracę ze zwierzętami przed rozpoczęciem protokołu.

1. Model przerostu mięśniowo-intimalnego (A)

Dla modelu przerostu błony wewnętrznej, kup myszy C57BL/6J (numer katalogowy 000664, C57BL/6J) w wieku 8 tygodni o wadze około 25 g. Myszy domowe do tych eksperymentów w konwencjonalnych warunkach; karm myszy standardową karmą dla myszy i dostarczaj wodę ad libitum.

  1. Przygotowanie myszy: Wprowadź mysz w stan znieczulenia za pomocą izofluranu (2%) za pomocą komory indukcyjnej.
    1. Usuń włosy na brzuchu za pomocą trymera do włosów, połóż mysz na plecach i zakryj nos i usta maską na twarz, aby zapewnić znieczulenie.
    2. Za pomocą Provo-Jodine należy uniwersalnie zdezynfekować okolice brzucha, a następnie 80% etanolu, w dwóch cyklach.
    3. Upewnij się, że nie ma odruchów, ściskając tylną kończynę, aby monitorować wystarczającą głębokość znieczulenia.
    4. Oddziel skórę i mięśnie wzdłuż kresy białej w dwóch etapach, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.
    5. Połóż jelita w rękawicy nawilżanej solą fizjologiczną. Owiń rękawicę wokół jelit, aby były wilgotne.
    6. Uważnie usuń tkankę tłuszczową pokrywającą aortę brzuszną. Wystawić aortę podnerkową aż do jej rozwidlenia, uważając, aby nie uszkodzić żadnych naczyń rozgałęzionych.
    7. Najpierw umieść zacisk mikrochirurgiczny na bliższej aorcie podnerkowej, aby zamknąć przepływ krwi. Teraz zastosuj drugi dystalny zacisk obok rozwidlenia aorty.
    8. Gdy przepływ krwi zostanie przerwany, wykonaj małe nacięcie w aorcie w pobliżu bliższego zacisku.
    9. Wprowadzić cewnik zakończony balonem, który został nawilżony 0,9% solą fizjologiczną i przesunąć się w kierunku dystalnego zacisku aorty.
    10. W przypadku uszkodzenia śródbłonka należy obnażyć aortę, ostrożnie napompowując balon i powoli pociągając cewnik w kierunku bliższego zacisku.
    11. Powtórz manewr denudacji dwa razy.
    12. Usuń cewnik i zamknij nacięcie aorty za pomocą szwów biegowych 10-0 z prolenu.
    13. Ostrożnie otwórz dystalny zacisk. W przypadku wystąpienia krwawienia w miejscu aortomii należy ponownie zamknąć zacisk, zlokalizować krwawienie i w razie potrzeby założyć dodatkowe przerwane szwy.
    14. Jeśli nie można zaobserwować krwawienia, powoli otwórz proksymalny zacisk
      15. .
    15. Tętno aortalne powinno być widoczne dystalnie od nacięcia. Teraz jelita mogą być ułożone z powrotem in situ.
    16. Przepłukać jamę brzuszną za pomocą podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej.
    17. Zamknij ścianę brzucha, zaczynając od warstwy mięśniowej, za pomocą szwów biegowych 6-0 prolenowych.
    18. Następnie dostosuj skórę pod pomocą 5-0 prolenu wykonując szwy biegowe.
    19. W czasie, gdy mysz jest jeszcze znieczulona, należy zastosować 4-5 mg/kg karprofenu we wstrzyknięciu podskórnym.
    20. Dodaj Metamizol do wody pitnej (50 mg Metamizolu na 100 ml) w celu kontroli bólu i kontynuuj przez 3 dni po zabiegu. Monitoruj zwierzę przez cały okres rekonwalescencji.
      Uwaga: Okres obserwacji dla tego modelu wynosi 28 dni.

2. Model miażdżycy (B)

Dla modelu miażdżycy, kup myszy z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE -/-) (numer magazynowy 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc/J) w wieku 4 tygodni, a następnie karmić je przez 4-6 miesięcy. myszy domowe do tych eksperymentów w warunkach konwencjonalnych; Po przyjeździe karmić myszy zachodnią dietą o wysokiej zawartości lipidów (Harlan Laboratories TD.88137) i dostarczać wodę ad libitum przez okres od 4 do 6 miesięcy.

  1. Przygotowanie myszy:
    1. Karm myszy ApoE -/- zachodnią dietą począwszy od 4 tygodnia życia. Manipulacja dietetyczna powinna rozpocząć się bezpośrednio po przyjeździe.
    2. Utrzymuj zachodnią dietę przez cały czas trwania eksperymentu.

3. Analiza

  1. Model przerostu mięśniowo-wewnętrznego: (A)
    Obszarem zainteresowania w tym modelu jest "obszar zmiany chorobowej". Opcje analizy obejmują obliterację światła, stosunek I/M (stosunek błony wewnętrznej do pożywki), maksymalną grubość błony mięśniowo-wewnętrznej, obszar mięśniowo-błony, barwienie trichromem w przypadku zwłóknienia oraz barwienie H&E w przypadku komórek jednojądrzastych (jak pokazano na rysunkach 1A-1C). Zgodnie z pytaniem naukowym można zastosować wiele innych barwień, takich jak czerwień Picrosirius dla kolagenu, immunohistochemia i metody konfokalne.
  2. Model miażdżycy (B)
    Obszarami zainteresowania w tym modelu są zastawka aortalna, łuk aorty oraz aorta zstępująca. Opcje do analizy: Barwienie lipidów czerwienią Sudan i barwienie trichromowe zastawki aortalnej, łuku aorty i aorty zstępującej (jak pokazano na rysunku 1D).
    Model ten daje również wiele innych opcji barwienia, takich jak na przykład Oil Red O dla neutralnych lipidów, czerwień Picrosirius, immunohistochemia i metody konfokalne.
    1. Barwienie czerwienią Sudanu: Wykonaj barwienie czerwienią Sudan na świeżo pobranej tkance aorty.
      1. Usuń dietę 6 godzin przed zbiorem.
      2. Wprowadź mysz w stan znieczulenia za pomocą izofluranu (2%) za pomocą komory indukcyjnej. Upewnij się, że nie ma odruchów, ściskając tylną kończynę, aby monitorować wystarczającą głębokość znieczulenia.
      3. Otwórz klatkę piersiową, odetnij wierzchołek serca i przelej przez lewą komorę, najpierw solą fizjologiczną (3 ml), a następnie 4% PFA (3 ml) przez korzeń aorty, aby naprawić aortę.
      4. Uwolnij aortę od korzenia do jej rozwidlenia. Staraj się usunąć tkankę tłuszczową w jak największym stopniu.
      5. Odetnij serce i korzeń aorty i przechowuj je w 4% PFA do badania histologicznego.
      6. W przypadku histologii korzeń aorty należy ostrożnie umieścić w bloku parafinowym w pozycji pionowej, aby umożliwić przecięcie korzenia aorty generując szkiełka, które wyświetlają wszystkie 3 płatki zastawkowe.
      7. Odetnij jeden koniec drzewa aorty i przymocuj go do warstwy silikonu za pomocą cienkich szpilek. Otwórz aortę wzdłużnie i przymocuj tkankę aorty.
      8. Opłucz chusteczkę 50% etanolem. Zanurz tkankę w roztworze barwiącym Sudan III na około 15 minut.
      9. Lekko spłucz 50% etanolem, aby usunąć nadmiar Sudan III. (Uwaga: 50% etanolu może zmyć barwnik.) Spłucz dH2O i zrób zdjęcia do dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia różne opcje analizy oraz indukowany stan chorobowy dla obu modeli. Dla modelu hiperplazji intimy pokazano analizę reprezentatywnych przekrojów poprzecznych w barwieniu trychromem. Z tych przekrojów poprzecznych można zmierzyć i obliczyć takie wyniki jak stosunki I/M, maksymalna grubość blaszki miażdżycowej, maksymalna grubość intimy w świetle naczynia, procentowe zamknięcie światła naczynia oraz powierzchnia blaszki miażdżycowej.

W celu oceny wyników model...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż obie choroby powodują podobne objawy u pacjenta, mechanizmy leżące u podstaw rozwoju płytki nazębnej, a tym samym podejścia do leczenia, są bardzo różne2. W różnych postaciach zwężenia tętnicy objawy kliniczne u pacjentów, a także ramy czasowe rozwoju blaszki miażdżycowej zależą od podstawowego mechanizmu.

W zależności od objawów klinicznych u pacjenta należy zastosować różne metody analizy próbki5,15. Konieczne jest dostosowanie analizy do charakterystycznych zmi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Christiane Pahrmann za pomoc techniczną. S.S. otrzymała dofinansowanie od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 i SCHR992/4-2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bulion tyoglikolanowy 3%Fluka70157proszek
PFA 4%Mikroskopia elektronowa Nauki#157135S20%
roztwór barwiący Sudan IIIproszkowaSigmaAldrich S4131
C57BL/6JJackson LaboratoriesStock # 0006664
mysz ApoE -/-Jackson LaboratoriesStock #002052
Western DietHarlan LaboratoriesTD.88137
maszynka do strzyżenia włosówWAHL8786-451A ARCO SE
ForeneAbbottZacisk
mikrochirurgicznyIsoflurane Fine Science Tools18055-04Micro-Serrefine -
aplikator zaciskowyCewnik
Szew prolenowy 10-0Ethicon788G
Szew prolenowy 6-0Ethicon8709H
Szew prolenowy 5-0EthiconEH7229H
RimadylPfizerCarprofen
Metacam 1,5 mg/mlBoehringer IngelheimMetamizol
Mysz 4 mm Fine Science Tools 18056-14

Bibliografia

  1. Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
  2. ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
  3. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
  4. Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
  5. Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
  6. Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
  7. Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
  8. Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
  9. Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663(2012).
  10. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
  11. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
  12. Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
  13. Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
  14. Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
  15. Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
  16. Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
  17. Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model mia d ycycewnikowanie balonowemyszy z nokautem genu ApoEdieta bogata w t uszcze i cholesterol Western Dietoperacja uszkodzenia aortyanaliza histologicznabarwienie czerwieni Sudanmorfometria komputerowapomiar zw enia wiat a naczynia

Powiązane artykuły