Method Article

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

DOI:

10.3791/51544

⸱

August 6th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnąca świadomość, że zarówno czasowa, jak i przestrzenna regulacja ekspresji genów może mieć istotne konsekwencje dla funkcji komórek, doprowadziła do rozwoju różnorodnych technik wizualizacji indywidualnych transkryptów RNA w pojedynczych żywych komórkach. Jedna z obiecujących technik, która została niedawno opisana, wykorzystuje sondę optyczną opartą na oligonukleotydach, ratiometryczną latarnię dwumolekularną (RBMB), do wykrywania transkryptów RNA, które zostały zaprojektowane tak, aby zawierały co najmniej cztery tandemowe powtórzenia sekwencji docelowej RBMB w regionie 3' bez translacji. RBMB są specjalnie zaprojektowane, aby emitować jasny sygnał fluorescencyjny po hybrydyzacji z komplementarnym RNA, ale poza tym pozostają wygaszone. Zastosowanie syntetycznej sondy w tym podejściu pozwala na użycie fotostabilnych, przesuniętych ku czerwieni i wysoce emisyjnych barwników organicznych do obrazowania. Wiązanie wielu RBMB ze zmodyfikowanymi transkryptami RNA powoduje powstanie dyskretnych plamek fluorescencyjnych podczas oglądania pod mikroskopem fluorescencyjnym o szerokim polu widzenia. W związku z tym ruch poszczególnych transkryptów RNA można łatwo zobrazować w czasie rzeczywistym, wykonując szereg czasowy obrazów fluorescencyjnych. Tutaj opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMBs, dostarczanie do komórek za pomocą mikroporacji oraz obrazowanie pojedynczych transkryptów RNA na żywych komórkach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja i regulacja transkryptów RNA to złożony i dynamiczny proces, który jest w dużej mierze odpowiedzialny za kontrolowanie zachowania i losu komórek. Chociaż znaczenie RNA w dyktowaniu funkcji komórki jest znane od jakiegoś czasu, często trudno jest nakreślić wyraźne powiązania między nimi, ponieważ większość narzędzi do analizy RNA nie ma rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia ważnych zdarzeń regulacyjnych, takich jak pękanie transkrypcji, Handel RNA i zlokalizowane przetwarzanie RNA. Doprowadziło to do pojawienia się kilku technik, które umożliwiają wizualizację poszczególnych transkryptów RNA w żywych komórkach w czasie rzeczywistym1. Być może najbardziej znana z tych technik wykorzystuje białko fuzyjne GFP-MS2 do celowania w RNA, które zostało zaprojektowane tak, aby zawierało tandemowe powtórzenia miejsca wiązania MS2 w 3'-UTR2,3. Dzięki zbliżeniu wielu cząsteczek GFP, poszczególne transkrypty RNA pojawiają się jako jasne fluorescencyjne plamki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. System GFP-MS2 dostarczył bezprecedensowego wglądu w zachowanie RNA, w tym bezpośrednią wizualizację i pomiary pękania transkrypcji4,5, wykrywanie unikalnej lokalizacji subkomórkowej i przetwarzania6-9 oraz obrazowanie transportu RNA w czasie rzeczywistym10. Jednak pomimo ogromnego potencjału systemu GFP-MS2, niezwiązane białka fuzyjne GFP-MS2 mogą tworzyć sygnał fluorescencyjny o wysokim tle, co ogranicza wszechstronność i zakres dynamiczny tej techniki. Opracowano kilka podejść w celu ograniczenia tego sygnału tła, w tym subkomórkową kompartmentalizację niezwiązanego GFP-MS210, komplementację fragmentów białka11 oraz alternatywne białka wiążące RNA i cele12. Jednak wszystkie te podejścia pozostają wrażliwe na względną i całkowitą ekspresję celu RNA i białka fuzyjnego GFP-MS2.

Jako alternatywa dla systemów GFP-MS2, molekularne latarnie zostały również użyte do wykrywania zmodyfikowanych transkryptów RNA z tandemowymi powtórzeniami komplementarnego miejsca wiązania w 3'-UTR13,14. Latarnie molekularne to sondy oligonukleotydowe tworzące spinki do włosów, które są znakowane z jednej strony wygaszaczem, a z drugiej fluorescencyjnym reporterem. Gdy nie są związane z docelowym RNA, fluorescencyjny reporter i wygaszacz pozostają w bliskiej odległości, co skutkuje stanem niskiej fluorescencji. Po hybrydyzacji reporter fluorescencyjny i wygaszacz są wypychane do siebie i fluorescencja zostaje przywrócona. Podobnie jak w przypadku systemu GFP-MS2, wiązanie wielu znaczników molekularnych z pojedynczym transkryptem RNA powoduje powstanie jasnej plamki fluorescencyjnej, którą można zidentyfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; Oczekuje się jednak, że fluorescencja tła będzie znacznie niższa ze względu na wygaszoną konfigurację niezwiązanych latarni molekularnych. Niestety, pomimo sprytnego mechanizmu aktywacji, który jest zawarty w projekcie latarni molekularnej, istnieje obecnie coraz więcej dowodów na to, że niezhybrydyzowane latarnie molekularne nie pozostają w konformacji spinki do włosów po wprowadzeniu do żywych komórek. W konsekwencji generują fałszywie dodatni sygnał, który znacznie zmniejsza sygnał do tła. Aby przezwyciężyć tę wadę, niedawno opracowaliśmy nową syntetyczną sondę do obrazowania RNA w żywych komórkach, ratiometryczne bimolekularne latarnie (RBMB; Rysunek 1A)15,16. RBMB składają się z dwóch nici 2'-O-oligonukleotydów metylowych, które tworzą strukturę hybrydową o cechach zarówno krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA), jak i molekularnych radiolatarni. Mechanizm aktywacji pętli i fluorescencji jest podobny do latarni molekularnej, podczas gdy długa dwuniciowa domena z nawisem 3'-UU jest bardziej charakterystyczna dla shRNA. Cechy shRNA są zaprojektowane tak, aby napędzać eksport jądrowy, co, jak odkryliśmy, wydłuża czas życia wewnątrz komórki do >24 godzin, przy minimalnej obserwowalnej degradacji i zapobiega niespecyficznemu otwarciu pętli. W rezultacie, RBMB wykazują znacznie wyższą komunikację sygnału do tła niż latarnie molekularne.

Należy zauważyć, że RBMB nie mogą być przygotowane przy użyciu oligonukleotydów DNA, ponieważ sondy oparte na DNA nie mają takich samych możliwości eksportu jądra jak sondy oparte na RNA. Strukturalnie pętla RBMB jest zwykle zaprojektowana tak, aby miała długość od 15 do 21 zasad, aby stworzyć równowagę między swoistością a selektywnością podczas hybrydyzacji RNA. Krótka łodyga, która tworzy się z dwóch samouzupełniających się domen, jest zwykle zaprojektowana tak, aby składała się z 4 zasad. Jeśli wybrano dłuższą łodygę, szybkość hybrydyzacji między pętlą RBMB a docelowym RNA jest znacznie spowolniona17,18. I odwrotnie, gdy wybierana jest krótsza sekwencja łodyg, temperatura topnienia jest często zbyt niska, aby utrzymać strukturę pętli łodygi w temperaturze 37 °C, co prowadzi do wysokiego sygnału tła. Specyficzność RBMB jest również zmniejszona wraz ze skróceniem długości trzpienia. Ponieważ sekwencja pętli trzpienia RBMB może również wpływać na wydajność RBMB, musi być starannie dobrana19. W szczególności idealne sekwencje pętli powinny mieć minimalną strukturę drugorzędową, hybrydyzować z sekwencjami RNA o minimalnej strukturze drugorzędowej, unikać miejsc wiązania białek i unikać wiązania poza celem. Przewidywania zarówno struktury drugorzędowej RBMB, jak i RNA można uzyskać za pomocą oprogramowania takiego jak mfold20. Komplementarne miejsca poza celem można zidentyfikować za pomocą narzędzia do wyszukiwania podstawowych przypisań lokalnych nukleotydów (BLAST). Jednak ze względu na niespójności w przewidywaniach modelu i trudności w identyfikacji miejsc licytacji białek, specyficzność wszystkich RBMB musi ostatecznie zostać zweryfikowana eksperymentalnie.

Jeśli jest to pożądane, do RBMB15 można dodać nieugaszony barwnik referencyjny, który jest niewrażliwy na stan hybrydyzacji. Dodanie barwnika referencyjnego może dostarczyć marker do dostarczania sondy i być używane do obrazowania ratiometrycznego, jeśli wymagane są dokładniejsze pomiary całkowitej fluorescencji komórkowej. Barwniki referencyjne pozwalają na dostosowanie pomiarów do różnic w tle spowodowanych różnicami w dostarczaniu między komórkami. Jednakże, podczas obrazowania poszczególnych transkryptów RNA barwnik referencyjny nie jest konieczny. Warto zauważyć, że niektóre barwniki referencyjne mogą zakłócać eksport RBMB z jądra, prowadząc do nieco wyższego sygnału tła w jądrze.

Przy odpowiednim zaprojektowaniu, RBMB mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w pojedynczych żywych komórkach, jeśli docelowe RNA jest zaprojektowane tak, aby zawierało co najmniej cztery miejsca wiązania RBMB (Rysunek 1B)16. RBMB mogą być skutecznie dostarczane do szerokiego zakresu typów komórek za pomocą mikroporacji, przy niewielkim lub zerowym wpływie na żywotność komórek21, a ilościowe pomiary ekspresji genów można uzyskać w ciągu 30 minut. Co więcej, metodologia jest dość niewrażliwa na stężenie RBMB i docelowe poziomy RNA, ponieważ fluorescencja z niezwiązanych RBMB jest skutecznie wygaszana. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis metodologii zastosowanej do przygotowania i oczyszczania RBMB, a także ogólną procedurę dostarczania RBMB do żywych komórek za pomocą mikroporacji i obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, jeden oligonukleotyd (RBMB1) został oznaczony na swoim końcu 5' barwnikiem reporterowym CF640R i ma sekwencję: 5'-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mMMMMMGG mCmAmG mCmAmC mUmU-3'. Domeny samouzupełniające się, które napędzają tworzenie struktury spinki do włosów, są pogrubione. Drugi oligonukleotyd (RBMB2) został oznaczony na końcu 3' wygaszaczem Iowa Black RQ-Sp i ma sekwencję: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.

1. Przygotowanie RBMB

  1. Wykonaj szybkie wirowanie probówek zawierających oligonukleotydy RBMB1 i RBMB2, aby upewnić się, że wysuszony oligonukleotyd znajduje się na dnie probówki, a następnie ponownie zawieś w wodzie wolnej od DNaz i RNaz do końcowego stężenia 100 μM. Na przykład próbkę oligonukleotydu o masie 10 nmoli należy zawiesić w 100 μl wody.
  2. Zmierz dokładne stężenie podstawowych próbek RBMB1 i RBMB2 za pomocą spektroskopii UV-vis.
    1. Zmieszać 3 μl próbki RBMB ze 117 μl DPBS (bez wapnia i magnezu) w probówce do mikrowirówki.
    2. Ślepą próbę spektrofotometru za pomocą DPBS i zmierzyć absorbancję w zakresie 200-800 nm. Uwaga: Szczytowe absorbancje przy 260 nm i 650 nm powinny być widoczne.
    3. Obliczyć stężenie podstawowe próbek RBMB na podstawie absorbancji przy 260 nm (lub 650 nm dla RBMB1), stosując równanie:
      Stężenie podstawowe (M) = A260* współczynnik rozcieńczenia/współczynnik ekstynkcji, gdzie A260 to absorbancja przy 260 nm, a współczynnik rozcieńczenia wynosi 40.
      Uwaga: Współczynnik ekstynkcji dla RBMB można znaleźć w arkuszu specyfikacji dostarczonym przez producenta oligonukleotydów. Współczynnik ekstynkcji CF640R przy 650 nm wynosi 103 000.
  3. Zmieszać 20 μl 100 μM RBMB1, 30 μl 100 μM RBMB2, 6 μl 10x buforu fosforanowego (10x bufor fosforanowy: 480 mM K2HPO4, 45 mM KH2PO4, 140 mM NaH2PO4, pH 7,2) i 4 μl wody wolnej od DNaz i RNaz. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Uwaga: Zazwyczaj wystarcza to na około 50 badań.
  4. Przygotować kolumnę do chromatografii cieczowej przy użyciu 75 stopnia przygotowawczego Superdex w celu usunięcia wszelkich niezhybrydyzowanych oligonukleotydów RBMB2. Użyj kolumny do chromatografii cieczowej o pojemności 8 ml (0,7 x 20 cm) z objętością złoża ~4 ml, aby oczyścić małą objętość zmieszanych sond.
  5. Umyj i zrównoważ Superdex z ~ 50 ml 1x buforu fosforanowego za pomocą pompy strzykawkowej pracującej z przepływem o natężeniu przepływu 0,6 ml / min. Zanim cały płyn dostanie się do objętości złoża, zatrzymaj pompę strzykawkową, odłącz ją i pozwól pozostałej cieczy przejść przez kolumnę grawitacyjnie.
  6. Umieścić mieszaninę RBMB (60 μl) na kolumnie chromatograficznej.
    1. Po całkowitym wprowadzeniu próbki RBMB do złoża, powoli dodaj kolejne 250 μl 1x buforu fosforanowego na wierzch złoża, aby upewnić się, że cała próbka całkowicie weszła do kolumny.
    2. Napełnij kolumnę do krawędzi 1x buforem fosforanowym. Zamknij górną część i uruchom pompę strzykawkową - strzykawkę należy napełnić ~50 ml 1x PBS i pracować z natężeniem przepływu 0,6 ml/min.
    3. Gdy RBMB zbliży się do dna kolumny – próbka RBMB może być zazwyczaj łatwo zwizualizowana ze względu na kolor barwnika wbudowanego w sondę – zebrać przepływ w ilości 2 kropli na probówkę mikrowirówki (1,5 ml). Przestań pobierać próbkę, gdy kolor w probówkach do mikrowirówek stanie się przezroczysty.
  7. Połącz probówki zawierające kolorową próbkę RBMB - zwykle 5-6 probówek - i załaduj do odśrodkowego urządzenia filtrującego (odcięcie 10 000 MW). Odwirować próbkę przy 10 000 RCF przez 20 minut lub do uzyskania żądanej objętości. Uwaga: Te prędkości i czasy zazwyczaj dają końcową objętość ~30 μl.
  8. Zmierzyć dokładne stężenie oczyszczonej próbki RBMB za pomocą spektroskopii UV-Vis.
    1. Pobrać 3 μl zagęszczonej próbki RBMB i wymieszać ze 117 μl DPBS w probówce do mikrowirówki.
    2. Ślepą próbę spektrofotometru za pomocą DPBS i zmierzyć absorbancję w zakresie 200-800 nm. Uwaga: Szczytowe absorbancje przy 260 nm i 650 nm powinny być widoczne.
    3. Obliczyć stężenie podstawowe zhybrydyzowanego RBMB na podstawie absorbancji przy 650 nm, stosując równanie:
      Stężenie podstawowe (M) = A650* współczynnik rozcieńczenia/współczynnik eksptyczności, gdzie A650 to absorbancja przy 650 nm, współczynnik rozcieńczenia wynosi 40.
      Uwaga: Współczynnik ekstynkcji dla CF640R przy 650 nm wynosi 103 000, a współczynnik ekstynkcji dla Iowa Black RQ wynosi ~20 000. Współczynniki ekstynkcji są addytywne i nie są wrażliwe na hybrydyzację. W związku z tym podstawowa próbka RBMB ma łączny współczynnik ekstynkcji wynoszący około 123 000 przy 650 nm.
  9. Oznaczyć probówkę odpowiednią nazwą i stężeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie 8-dołkowego szkła nakrywkowego z poli-d-lizyną

  1. Przygotować roztwór poli-D-lizyny o stężeniu 0,2 mg/ml, rozpuszczając 5 mg poli-D-lizyny (liofilizowany proszek, napromieniowany g) w 25 ml wysterylizowanej wody w sterylnym środowisku.
  2. Dodać 200 μl 0,2 mg/ml roztworu poli-D-lizyny do każdego dołka 8-dołkowego szkła nakrywkowego, w sterylnym środowisku.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 16-18 godzin w kapturze do hodowli komórkowych.
  4. Odessać poli-D-lizynę i umyć studzienkę 3 razy sterylną wodą destylowaną. Uwaga: Powlekane szkiełka komorowe można przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Dostarczenie sondy

Uwaga: Używany system komórkowy powinien zawierać zintegrowany konstrukt genu, który wyraża RNA z co najmniej 4 sekwencyjnymi miejscami wiązania RBMB w regionie 3' bez translacji (UTR). Sekwencje docelowe powinny być komplementarne w stosunku do pętli RBMB. Zaleca się, aby w ramach kontroli negatywnej ta sama linia komórkowa została zmodyfikowana w celu ekspresji tego samego konstruktu genu, ale bez powtórzeń tandemowych. W tym protokole ludzka linia komórkowa włókniakomięsaka, HT1080, została zaprojektowana do ekspresji gfp RNA z 96-tandemowymi powtórzeniami sekwencji docelowej RBMB w 3'-UTR. Kontrolna linia komórkowa została zaprojektowana do ekspresji RNA gfp typu dzikiego.

  1. Płytki w kolbie T25 przy zbiegu 40-50% na dzień przed podaniem sondy. Hodować komórki za pomocą pożywki DMEM uzupełnionej 1% pióra/paciorkowca i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Następnego dnia włącz mikroporator i ustaw parametry mikroporacji na 950 V, 2 impulsy, 25 ms. Uwaga: Parametry te zostały zoptymalizowane dla ogniw HT1080, ale są zależne od typu ogniwa i można je dostosować do innych typów ogniw zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.
  3. Napełnij probówkę do mikroporacji 4 ml buforu elektrolitycznego i umieść ją na stacji mikroporacji.
  4. Wyjąć podstawową próbkę oczyszczonego RBMB i rozmrozić ją. Rozcieńczyć kilka mikrolitrów do końcowego stężenia 12 μM z 1x buforem fosforanowym. Na każdą mikroporację potrzeba 1 μl.
  5. Odpipetować 1 ml pożywki hodowlanej z FBS, ale bez antybiotyków, do probówki do mikrowirówki. Uwaga: Zostanie on wykorzystany do zawieszenia komórek natychmiast po mikroporacji i na razie można go odłożyć na bok w pobliżu urządzenia do mikroporacji. Włączenie antybiotyków do pożywek hodowlanych zmniejszy żywotność komórek po mikroporacji.
  6. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z zmodyfikowanych komórek HT1080 (60-80% zlewania się), przemyj komórki 1 ml DPBS bez Ca2+ i Mg2+ i inkubuj z 1 ml trypsyny przez 1-2 minuty.
  7. Zatrzymaj trypsynizację, dodając 1 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, bez antybiotyków i czerwieni fenolowej, a następnie przenieś komórki do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  8. Obracać komórki w probówce do mikrowirówek o masie 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić i połączyć granulki komórek w końcową objętość 1 ml DPBS.
  9. Weź 10 μl z dobrze wymieszanej zawiesiny komórek i policz komórki.
  10. Kilkakrotnie pipetować komórki w górę i w dół, aby upewnić się, że są dobrze rozproszone, a następnie przenieść 300 000 komórek za pomocą DPBS do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować w dół z prędkością 200 x g przez 5 minut.
  11. Usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Zawiesić osad w 11 μl buforze do resuspensji i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są dobrze rozproszone. Pamiętaj, aby nie generować żadnych pęcherzyków powietrza. Uwaga: Pęcherzyki powietrza spowodują iskrę podczas mikroporacji i spowodują słabe dostarczanie RBMB i śmierć komórki.
  12. Dodać 1 μl rozcieńczonego RBMB (12 μM) i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Ponownie należy uważać, aby nie generować żadnych pęcherzyków powietrza.
  13. Odessać 10 μl mieszaniny komórek RBMB za pomocą pipety do mikroporacji i włożyć pipetę do probówki do mikroporacji. Naciśnij przycisk start, aby rozpocząć mikroporację. Uwaga: W końcówce nie powinno być widocznych pęcherzyków powietrza.
  14. Gdy ekran mikroporatora pokaże zakończenie, wyjmij pipetę ze stacji, wylej mieszaninę 10 μl do przygotowanej wcześniej probówki mikrowirówkowej z 1 ml pożywką hodowlaną z FBS, ale bez antybiotyków. Delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie kołysząc rurką na boki.
  15. Wirować komórki w masie 200 x g przez 5 minut i umyć komórki jeszcze dwa razy w 1 ml pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej z FBS, ale bez antybiotyków, w celu usunięcia wszelkich RBMB, które nie zostały dostarczone do komórek. Zawiesić za pomocą 400 μl pożywki hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej z FBS, ale bez antybiotyków.
  16. Umieść mikroporowane komórki w 8-dołkowym szkle nakrywkowym pokrytym poli-D-lizyną w ilości 200 μl na dołek lub w pożądanym zbiegu.
  17. Opcjonalnie: Jeśli pożądane jest zobrazowanie jądra, dodać Hoescht 33342 do komórek w końcowym stężeniu 0,01 mg/ml.
  18. Umieścić szkło nakrywkowe z komorą w inkubatorze do hodowli komórkowych. Inkubuj komórki przez 1-2 godziny przed obrazowaniem, aby komórki miały wystarczająco dużo czasu na osadzenie się na powierzchni szkła nakrywkowego. Uwaga: Obrazowanie można wykonać już po 30 minutach od mikroporacji.

4. Akwizycja obrazu

  1. Włącz system inkubacji górnej fazy żywej komórki i zrównoważ go, aż osiągnie 37 °C, 5% CO2 i 75% wilgotności.
  2. Włącz mikroskop i fluorescencyjne źródło światła i otwórz oprogramowanie Metamorph. Uwaga: Można również korzystać z innych podobnych pakietów oprogramowania do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu.
  3. Nałóż olejek Immersol na cel.
  4. Przenieś szkło nakrywkowe z komorą z mikroporowanymi komórkami do systemu inkubacji górnej fazy żywych komórek. Inkubować górny system sceny, aż temperatura i poziomy CO2 ustabilizują się.
  5. Otwórz zakładkę Acquire w oprogramowaniu Metamorph. Kliknij przycisk Pokaż na żywo, aby znaleźć pole, dostosuj ostrość w białym świetle i kliknij przycisk Zatrzymaj na żywo.
  6. Na karcie Pobieranie kliknij i otwórz przycisk wyskakujący pobierania strumienia, a następnie skonfiguruj żądane parametry pozyskiwania filmu. Uchwyć 150 klatek za pomocą filtra Cy5/CF640R i zapisz obrazy na dysku twardym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krótko po mikroporacji komórek HT1080 w obecności RBMBs, pojedyncze transkrypty RNA, które zostały zaprojektowane tak, aby zawierały wiele miejsc wiązania RBMB w ich 3'-UTR, wyglądają jak jasne fluorescencyjne plamy, gdy są obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu (Rysunek 2). Podczas gdy pojedyncze transkrypty RNA z zaledwie czterema miejscami wiązania RBMB można obrazować w żywych komórkach, im więcej miejsc wiązania RBMB w 3'-UTR, tym silniejszy sygnał fluorescencyjny. Co więc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość obrazowania pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego wymaga jasnego i fotostabilnego sygnału fluorescencyjnego, który ma być powiązany z każdym transkryptem RNA oraz niskofluorescencyjnego tła emanującego z niezwiązanych sond fluorescencyjnych. W tej metodzie jasny sygnał fluorescencyjny uzyskuje się poprzez hybrydyzację wielu (do 96) sond fluorescencyjnych opartych na oligonukleotydach, tj. RBMB, na każdym transkryptie RNA....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Mark Behlke i dr Ling Huang są zatrudnieni przez IDT, które oferuje na sprzedaż oligonukleotydy podobne do niektórych związków opisanych w manuskrypcie. IDT nie jest jednak spółką notowaną na giełdzie i osobiście nie posiada żadnych udziałów/udziałów w IDT.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation CAREER Award (0953583) oraz National Institute of Health NCI/R21-CA116102, NCI/R21-CA125088, NIBIB/R01-EB012065, NCI/R01-CA157766.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Woda wolna od nukleazLife TechnologiesAM9932bez DPBS z powłoką DEPC
Technologies14190-144Bez Ca2+ i Mg2+Cary
100 Spektrofotometr UV-VisAgilent Technologies
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher ScientificP290-500
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificP284-500
Fosforan sodu jednozasadowyFisher ScientificS381-500
Probówki do mikrowirówekEppendorf223641111,5 ml
Kolumna chromatograficznaKimble Chase Life Science420400-07200,7 x 20 cm
Superdex 75 klasa przygotowawczaGE healthcare17-1044-01
Pompa strzykawkowaBraintree ScientificBS-300
StrzykawkaBD30103560 ml, końcówka Luer-lok
Filtry odśrodkoweMilliporeUFC501096MW 10 000 odcięcie
Wirówka 5418Eppendorf
Poly-D-lizynaSigma-AldrichP7280-5MGliofilizowany proszek, napromieniowany g
8-dołkowe szkło nakrywkoweFisher Scientific 155409Objętość robocza 0,2-0,5 ml
HT1080ATCCCCL-121Linia komórkowa ludzkiego włókniakomięsaka
Kolba do hodowli komórkowychCorning43063925 cm2
DMEMLife Technologies11965084DMEM o wysokiej zawartości glukozy
bez czerwieni fenolowejLife Technologies21063029
Surowica bydlęcaSigma-AldrichF2442-500ML
Penecylina/streptomycynaLife Technologies15140122
TrypsinLife Technologies253000540,05% Trypsin-EDTA
System transfekcji neonówTechnologiesMPK5000
Zestaw systemu transfekcji NeonLife TechnologieMPK1096
hemacytometrFisher Scientific02-671-10
Hoescht 33342Life TechnologiesH1399
IX-81 Odwrócony mikroskop fluorescencyjnySilnik świetlny Olympus
SOLALumencor
MetamorphMolecular DevicesSterowanie programowe
mikroskop Immersol oil 518FFisher Scientific12-624-66B
Life o wysokim poziomie glukozy Life

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  3. Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
  4. Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
  5. Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
  6. Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  7. Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
  8. Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
  9. Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
  10. Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
  11. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
  12. Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
  13. Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
  14. Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
  15. Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148(2010).
  16. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
  17. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
  18. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
  19. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
  20. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  21. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69(2008).
  22. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152(2013).
  23. Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
  24. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
  25. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  26. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
  27. Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
  28. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105(2007).
  29. Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315(2009).
  30. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58(2004).
  31. Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57(2004).
  32. Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
  33. Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
  34. Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
  35. Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100(2009).
  36. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ratiometric Bimolecular BeaconRNA ImagingLive Cell MicroscopySize Exclusion ChromatographyMicro Poration DeliveryFluorescent MicroscopyEngineered RNA TargetSynthetic Probe HybridizationReal time RNA TrackingSingle Molecule Detection

Related Articles