Przezskórne wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii stanowi efektywną, niezawodną i celowaną metodę dostarczania czynników transferu genów lub komórek do mysiego serca. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Iniekcja przezklatkowa domięśniowa pod kontrolą USG u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysie modele chorób sercowo-naczyniowych są ważne dla badania mechanizmów patofizjologicznych i badania potencjalnych terapii regeneracyjnych. Eksperymenty polegające na wstrzyknięciu mięśnia sercowego są obecnie wykonywane przez bezpośredni dostęp chirurgiczny poprzez torakotomię. Chociaż jest to wygodne, gdy jest wykonywane w czasie innej eksperymentalnej manipulacji, takiej jak podwiązanie tętnic wieńcowych, potrzeba inwazyjnej procedury dostarczania do mięśnia sercowego ogranicza potencjalne projekty eksperymentalne. Dzięki coraz lepszej rozdzielczości ultrasonograficznej i zaawansowanym nieinwazyjnym metodom obrazowania, możliwe jest teraz rutynowe wykonywanie przezskórnych wstrzyknięć domięśniowych pod kontrolą USG. Ta metoda skutecznie i niezawodnie dostarcza środki do docelowego regionu mięśnia sercowego. Zalety tej techniki obejmują uniknięcie zachorowalności chirurgicznej, możliwość selektywnego celowania w obszary mięśnia sercowego pod kontrolą ultrasonograficzną oraz możliwość dostarczania zastrzyku do mięśnia sercowego w wielu, z góry określonych odstępach czasu. Dzięki ćwiczonej technice powikłania po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego są rzadkie, a myszy szybko wracają do normalnej aktywności po powrocie do zdrowia po znieczuleniu. Postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole, operator z podstawowym doświadczeniem w echokardiografii może szybko stać się kompetentny w tej wszechstronnej, minimalnie inwazyjnej technice.
Wprowadzenie
Choroby serca są główną przyczyną zgonów zarówno mężczyzn, jak i kobiet w Stanach Zjednoczonych, odpowiadając za 600 000 zgonów rocznie1. Mysie modele chorób sercowo-naczyniowych są niezwykle ważne dla badania mechanizmów patofizjologicznych i badania potencjalnych terapii. Dostarczanie do mięśnia sercowego wektorów terapii genowej, komórek macierzystych, zmodyfikowanych RNA i innych środków terapeutycznych pozwala na zbadanie ich potencjału terapeutycznego w chorobach serca2-7. Obecnie istnieją ograniczone możliwości dostarczania środków terapeutycznych do mięśnia sercowego w modelach mysich6. Wstrzyknięcie do mięśnia sercowego pod bezpośrednią wizualizacją jest powszechnie stosowane, ale wymaga sternotomii lub torakotomii i jest ograniczone do odsłoniętego obszaru serca. Chociaż jest to wygodne, gdy jest wykonywane w czasie innej manipulacji eksperymentalnej, takiej jak podwiązanie LAD, potrzeba inwazyjnej procedury dostarczania do mięśnia sercowego ogranicza potencjalne projekty eksperymentalne i wprowadza dodatkowe efekty procedury (np. zwłóknienie spowodowane torakotomią). Zgłaszano przezskórne dostarczanie wektorów wirusowych do osierdzia, ale miejsce i dystrybucja środka terapeutycznego nie są jednorodne i trudne do kontrolowania8. Przezskórne wstrzyknięcie naczyń wieńcowych powoduje bardziej jednorodną dystrybucję wstrzykniętego materiału, ale wydajny i powtarzalny poród wieńcowy jest wyzwaniem w modelach mysich.
Tutaj opisujemy technikę iniekcji domięśniowej w klatkę piersiową, która pozwala na minimalnie inwazyjne, kontrolowane przez operatora celowanie środków terapeutycznych pod kontrolą ultradźwięków. Technika ta jest łatwa do nauczenia, eliminuje potrzebę torakotomii lub sternotomii i towarzyszących im powikłań eksperymentalnych, a także zapewnia większą elastyczność w zakresie czasu i miejsc wstrzyknięcia do mięśnia sercowego. Tak więc wstrzyknięcie do mięśnia sercowego wspomagane echokardiografią stanowi technicznie prostą i wysoce skuteczną metodę manipulowania mięśniem sercowym w mysich modelach eksperymentalnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane kroki zostały wykonane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie.
1. Przygotowanie
- Przed rozpoczęciem protokołu wstrzyknięcia należy przeprowadzić wyjściową ocenę anatomiczną i funkcjonalną serca za pomocą echokardiografii, ponieważ optymalna stała pozycja głowicy do wstrzyknięcia domięśniowego może nie dawać optymalnych standardowych widoków do nakreślenia anatomii i oceny funkcji.
- Układ wtrysku pokazano na rysunkach 1A-1C. Umieścić pustą strzykawkę z osłoniętą igłą, skośnie skierowaną do góry, w zacisku strzykawki (patrz Rysunek 1C) i zamocować sondę przetwornika ultradźwiękowego w głowicy skanującej clamp (patrz Rysunek 1B). Poluzuj złącze kulowe blokady głowicy skanującej (Rysunek 1B) i manipuluj orientacją przetwornika tak, aby był ustawiony równolegle do osi igły. Zamocuj pozycję głowicy skanującej, dokręcając złącze blokady kulowej głowicy skanującej clamp .
UWAGA: Do wstrzykiwań u dorosłych myszy optymalna jest igła 30 G o długości 1 cala / 2,5 cm. Strzykawka o pojemności 1 ml może być używana do większych objętości, natomiast strzykawka gazoszczelna może być używana do bardziej precyzyjnej kontroli mniejszych objętości (5-10 μl). - Nałóż obficie żel ultradźwiękowy na końcówkę głowicy za pomocą szpatułki, aby pokryć głowę na całej długości. Ostrożnie odsuń igłę od pochwy i użyj elementów sterujących mocowaniem igły, aby przesunąć igłę bezpośrednio pod głowicę i w żelu ultradźwiękowym w celu wizualizacji. Dokonaj drobnych korekt za pomocą elementu sterującego mocowaniem igły, tak aby igła była wyraźnie widoczna na całej długości na obrazie ultrasonograficznym. Jeśli głowica została prawidłowo ustawiona równolegle do igły w kroku 1.4, wówczas igła powinna pozostać w płaszczyźnie obrazowania podczas jej wysuwania i wycofywania za pomocą pokrętła sterującego wstrzykiwaniem (Rysunek 1C).
- W kolejnych krokach nie należy zakłócać poziomego wyrównania igły/przetwornika, przesuwając się w osi poziomej. Zamiast tego należy celować w określone obszary serca do wstrzyknięcia, zmieniając pionowe (oś y) położenie mocowania igły i przesuwając platformę zwierzęcia.
- Przesuń przetwornik w górę od platformy dla zwierząt za pomocą regulatora wysokości skanowania (Rysunek 1B), aby umożliwić późniejsze umieszczenie znieczulonej myszy na platformie dla zwierząt. Nie zakłóci to wyrównania osi x przetwornika do długiej osi igły.
- Wyjąć strzykawkę, która została użyta do wyrównania, z zacisku strzykawki i ostrożnie wyrzucić. Załadować nową igłę i strzykawkę z wstrzykiwaczem do końcowej objętości docelowej, pozostawiając martwą przestrzeń w końcówce strzykawki. Uważaj, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Umieścić strzykawkę w zacisku strzykawki bez regulacji jej ustawienia w osi x. Całkowicie wycofać strzykawkę za pomocą regulatora iniekcji.
UWAGA: Do celów szkolenia wstępnego użycie niebieskiego barwnika Evana (1%), niebieskiego barwnika trypanowego (0,4%) lub zawiesiny mikrosfer fluorescencyjnych jako iniekcji może pomóc operatorowi w potwierdzeniu kompetencji i powodzenia celowanego wstrzyknięcia.
2. Wtrysk
- Włączyć zintegrowany podgrzewacz platformy grzewczej i ustawić go na 37 °C. Ustawić platformę dla zwierząt pod kątem 180° w stosunku do zwykłej orientacji obrazowania, z wężem anestezjologicznym clamp i głowa zwierzęcia najbliżej operatora. Dzięki temu serce (po lewej stronie klatki piersiowej) może być ipsilateralne w stosunku do zacisku strzykawki i igły. Uwaga: Dodatkowe drobne korekty obrotu platformy zwierzęcia zgodnie z ruchem wskazówek zegara mogą być konieczne do prawidłowego zorientowania serca dla przymostkowej płaszczyzny obrazowania o krótkiej osi, która będzie używana do wstrzykiwania (Rysunek 2A).
- Przygotuj myszy do badania echokardiograficznego, jak wcześniej opisano9. Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej z 2% izofluranem. Usuń włosy na klatce piersiowej kremem do depilacji i nałóż żel nawilżający na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu twardówki.
- Podnieś przetwornik za pomocą regulatora wysokości głowicy skanującej (Rysunek 1B). Umieść znieczuloną mysz na wznak na podgrzanej platformie zwierzęcej z pyskiem w stożku nosowym dostarczającym 1-3% izofluranu (ryc. 2A-2B). Delikatnie włóż sondę doodbytniczą i przyklej cztery łapy do elektrod EKG, nakładając żel elektrodowy do kontaktu elektrycznego.
UWAGA: W celu humanitarnego leczenia zwierzęcia należy zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia. Nie powinno być żadnych zmian w częstości akcji serca i brak reakcji na wprowadzenie igły przez ścianę klatki piersiowej. Zintegrowana homeostatyczna kontrola temperatury na platformie zwierzęcej powinna być stosowana w celu utrzymania normotermii (37 ± 0,5 °C), ponieważ hipotermia spowoduje względną bradykardię, rozszerzenie komór i możliwy dyskomfort. - Gdy mysz znajdzie się na platformie dla zwierząt, opuść przetwornik na depilowaną klatkę piersiową za pomocą regulatora wysokości głowicy skanującej (Rysunek 1B). Optymalna konfiguracja ultrasonograficzna do wstrzykiwań polega na uwidocznieniu serca w orientacji krótkiej osi przymostkowej, zgodnie ze standardową techniką echokardiograficzną. Obróć platformę dla zwierząt o 20-30° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby uzyskać optymalne okno akustyczne do wstrzykiwania w płaszczyźnie obrazowania o krótkiej osi (rysunki 2A-2B). Uwaga: Alternatywnie, wstrzyknięcie można wykonać z orientacji przymostkowej w długiej osi, obracając platformę zwierzęcia w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (ryc. 2C).
- Użyj elementów sterujących regulacji platformy dla zwierząt, aby dostosować pole widzenia i wybrać dowolne miejsce wstrzyknięcia w mięśniu sercowym lewej komory. Przesuwaj się w przód iw tył od wierzchołka do podstawy serca, aby celować w pożądane miejsce wstrzyknięcia w mięśniu sercowym lewej komory (ryc. 3A-3C). Uwaga: Widok krótkiej osi środkowej brodawkowatej przymostkowej (ryc. 3A) oferuje powtarzalne punkty orientacyjne, które umożliwiają dalsze obrazowanie miejsca wstrzyknięcia. Uwaga: Alternatywnie, widok osi długiej przymostkowej może być wykorzystany do celowania w predefiniowane miejsce wstrzyknięcia (Rysunek 3D).
- Zaczynając od strzykawki w całkowicie schowanym zacisku strzykawki, powoli przesuwać strzykawkę w kierunku klatki piersiowej zwierzęcia, obracając regulator wstrzyknięcia zgodnie z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 4A). Aby umożliwić wyraźną wizualizację ultrasonograficzną zarówno serca, jak i końcówki igły, gdy zbliża się do klatki piersiowej, użyj dużej ilości żelu ultrasonograficznego po lewej stronie klatki piersiowej i zoptymalizuj okno akustyczne, ustawiając szerokie pole widzenia na kontrolkach echokardiografii. Ustawić ogniskową/strefę w miejscu docelowym wstrzyknięcia. Drobne zmiany w elementach sterujących mocowaniem igły mogą zoptymalizować obraz igły na całej jej długości.
UWAGA: Niektóre aparaty ultrasonograficzne są wyposażone w funkcję oprogramowania do prowadzenia igły, która cyfrowo przedłuża linię wzdłuż długiej osi igły do docelowego mięśnia sercowego (ryc. 4B). Takie narzędzie programowe może być pomocne, ale nie jest niezbędne. - Po odpowiednim uspokojeniu zwierzęcia (1-3% izofluranu zmieszanego z 0,5-0,8 l/min 100% tlenu), przesuń igłę przez ścianę klatki piersiowej myszy i do mięśnia sercowego, uważnie obserwując położenie skośnej końcówki igły przez cały czas. Zatrzymaj posuwanie się, gdy końcówka igły znajdzie się w docelowym mięśniu sercowym (Rysunek 4C). Cała skośna końcówka powinna bezpiecznie znajdować się w mięśniu sercowym, aby uniknąć wycieku wstrzyknięcia do przestrzeni osierdzia.
- Gdy końcówka znajdzie się w żądanym miejscu, należy podać wstrzyknięcie, naciskając tłok strzykawki. Wstrzykiwać powoli, przez 5-30 sekund (w zależności od podawanej objętości). Można podać do 50 μl iniekcji bez uszczerbku dla funkcji komór. Po udanym wstrzyknięciu może być widoczne przejściowe pojawienie się echobrighta w obszarze mięśnia sercowego, w który wstrzyknięto zastrzyk. Czasami obserwuje się krótki (sekundowy) okres względnej bradykardii po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego i szybko ustępuje.
- Po podaniu wstrzyknięcia należy niezwłocznie wyjąć igłę, obracając pokrętło we wstrzyknięciu w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Mysz powinna być trzymana w znieczuleniu przez kilka minut obserwacji echokardiograficznej, aby potwierdzić zachowaną funkcję komór i brak powikłań pozabiegowych. Jeśli jest to wskazane, wiele obszarów mięśnia sercowego może być seryjnie wstrzykiwanych poprzez zmianę kąta zbliżania się igły poprzez regulację platformy zwierzęcej. Po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego mysz jest samodzielnie umieszczana w klatce i pozostawiana do odzyskania po znieczuleniu pod obserwacją.
- Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło wstrzyknięcie do mięśnia sercowego, w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Klatkę należy umieścić na termoregulowanej podkładce z gotowym zapasem wody i mysiej diety. Nie oczekuje się dyskomfortu pozabiegowego, a brak odpowiedniego wznowienia normalnego zachowania wkrótce po interwencji sugeruje potencjalne komplikacje (patrz Dyskusja).
- Ostrożnie wyrzuć igłę natychmiast po zakończeniu wstrzyknięcia do mięśnia sercowego, aby zminimalizować ryzyko zranienia ostrymi narzędziami operatora lub osób postronnych. Ponowne użycie igły może spowodować stępienie końcówki, co utrudnia przekłucie mięśnia sercowego i powoduje większe ryzyko powikłań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wewnątrzmięśniowe wstrzykiwanie do mięśnia sercowego u myszy z użyciem błękitnego barwnika lub fluorescencyjnych mikrosfer
Wstrzyknięcie barwnika błękitu Evansa jest przydatne do celów szkoleniowych. Wkrótce po wstrzyknięciu należy poddać mysz eutanazji i usunąć serce, aby zwizualizować miejsce podania błękitnego barwnika. Rysunek 5 przedstawia przykład udanego wstrzyknięcia, w którym błękitny barwnik przeniknął do mięśnia sercowego na poziomie środkowym mięśni brodawkowych (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Leki biologiczne mogą być dostarczane do mięśnia sercowego przez bezpośrednie wstrzyknięcie do mięśnia sercowego, wstrzyknięcie doosierdziowe lub podanie pośrednie przez krwioobieg. Niedawne badania terapii komórkowej w modelach zawału mięśnia sercowego opisały otwarte podejście torakotomii do dostarczania iniekcji12-14. Ważnym czynnikiem decydującym o powodzeniu interwencji terapeutycznej mięśnia sercowego jest wybór drogi porodu. Najwyższą miejscową dawkę leku biologicznego uzyskuje się przy podaniu domięśni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
TWP zostało ufundowane przez Irish Cardiac Society Brian McGovern Travelling Fellowship. WTP zostało ufundowane przez R01 HL095712 oraz nagrodę AHA Established Investigator Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System obrazowania ultrasonograficznego Vevo 2100 | Visualsonics | ||
| Vevo III | Przetwornik Visualsonics | ||
| Microscan MS400 | Przetwornik Visualsonics | ||
| Microscan MS550D | Igły Visualsonics | ||
| PrecisionGlide | BD | 305128 | 30 G x 1 cal/2,5 cm |
| Strzykawka z końcówką ślizgową | cm3 Exel International | 26048 | lub odpowiednik |
| Gastight 50 μ l szklane strzykawki | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250 | lub równoważny |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | lub równoważny |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | lub |
| równoważny Mikrosfery polistyrenowe (czerwona fluorescencyjna) | Life Technologies | F-8842 | lub równoważny |
Bibliografia
- Kochanek, K. D., et al. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-117 Forthcoming.
- Strauer, B. E., Steinhoff, G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice. J Am Coll Cardiol. 58, 1095-1104 (2011).
- Cheng, K., et al. Intramyocardial autologous cell engraftment in patients with ischaemic heart failure: a meta-analysis of randomised controlled trials. Heart Lung Circ. 22 (11), 887-894 (2013).
- Fischer-Rasokat, U., et al. A pilot trial to assess potential effects of selective intracoronary bone marrow-derived progenitor cell infusion in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy: final 1-year results of the transplantation of progenitor cells and functional regeneration enhancement pilot trial in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy. Circ Heart Fail. 2, 417-423 (2009).
- Seth, S., et al. Percutaneous intracoronary cellular cardiomyoplasty for nonischemic cardiomyopathy: clinical and histopathological results: the first-in-man ABCD (autologous bone marrow cells in dilated cardiomyopathy) trial. J Am Coll Cardiol. 48, 2350-2351 (2006).
- Ladage, D., et al. Percutaneous methods of vector delivery in preclinical models. Gene Ther. 19, 637-641 (2012).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nat Biotechnol. 31, 898-907 (2013).
- Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386 (3), 227-238 (2013).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H. Transthoracic echocardiography in mice. J Vis Exp. (39), e1738(2010).
- Wang, G., et al. Characterization of cis-regulating elements and trans-activating factors of the rat cardiac troponin T gene. J Biol Chem. 269, 30595-30603 (1994).
- Shimshek, D. R., et al. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis. 32, 19-26 (2002).
- Lichtenauer, M., et al. Intravenous and intramyocardial injection of apoptotic white blood cell suspensions prevents ventricular remodelling by increasing elastin expression in cardiac scar tissue after myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 106 (4), 645-655 (2011).
- Herrmann, J. L., et al. Postinfarct intramyocardial injection of mesenchymal stem cells pretreated with TGF-alpha improves acute myocardial function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), 371-378 (2010).
- Zhou, Y., et al. Direct injection of autologous mesenchymal stromal cells improves myocardial function. Biochem Biophys Res Commun. 390 (3), 902-907 (2009).
- Campbell, N. G., Suzuki, K. Cell delivery routes for stem cell therapy to the heart: current and future approaches. J Cardiovasc Transl Res. 5 (5), 713-726 (2012).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, Suppl 9. 150-156 (2005).
- Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research). JACC Cardiovasc Interv. 3 (3), 265-275 (2010).
- Dib, N., et al. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
