Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biodegradowalne rusztowania obsiane komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego (BMC) są często używane do chirurgii rekonstrukcyjnej w leczeniu wrodzonych wad serca. Długoterminowe wyniki kliniczne wykazały doskonałe wskaźniki drożności, jednak ze znaczną częstością występowania zwężeń. Aby zbadać komórkowe i molekularne mechanizmy tworzenia się nowotworów naczyniowych i zapobiec rozwojowi zwężenia w przeszczepach naczyniowych inżynierii tkankowej (TEVG), opracowaliśmy mysi model przeszczepu o średnicy wewnętrznej około 1 mm. Po pierwsze, TEVG zostały zmontowane z biodegradowalnych rusztowań rurowych wykonanych z siatki filcowej z włókniny z kwasu poliglikolowego pokrytej kopolimerem ε-kaprolaktonu i L-laktydu. Rusztowania umieszczono następnie w liofilizarze, odkurzano przez 24 godziny i przechowywano w eksykatorze do momentu wysiewu komórek. Po drugie, szpik kostny pobrano od myszy dawców, a komórki jednojądrzaste wyizolowano przez wirowanie w gradiacji gęstości. Po trzecie, około miliona komórek wysiano na rusztowaniu i inkubowano O/N. Na koniec rusztowania z nasionami wszczepiono jako przeszczepy interpozycji żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Wszczepione przeszczepy wykazywały doskonałą drożność (>90%) bez objawów powikłań zakrzepowo-zatorowych lub tworzenia się tętniaka. Ten mysi model pomoże nam w zrozumieniu i ilościowym określeniu komórkowych i molekularnych mechanizmów powstawania tkanek nowotworowych w TEVG.
Wprowadzenie
Wrodzone wady serca to poważne schorzenia, które dotykają prawie 8% żywych urodzeń w Stanach Zjednoczonych. Około 25% niemowląt z wrodzonymi wadami serca, czyli 2,4 na 1000 żywych urodzeń, wymaga leczenia inwazyjnego w pierwszym roku życia1. Najskuteczniejszym sposobem leczenia wrodzonych wad serca jest chirurgia rekonstrukcyjna. Niestety, powikłania wynikające ze stosowania obecnie dostępnych przewodów naczyniowych są najistotniejszą przyczyną zachorowalności i śmiertelności pooperacyjnej.
Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy pierwsze przeszczepy naczyniowe (TEVG) do użytku klinicznego2. TEVG zbudowano z biodegradowalnych probówek poliestrowych wysianych autologicznymi komórkami jednojądrzastymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BM-MNC) i wszczepiono je jako przewody żylne do chirurgii wrodzonych wad serca. Wyniki wykazały doskonałą drożność po 1-3 latach obserwacji, ale ze znaczną częstością występowania zwężenia3,4. Było jasne, że potrzebne jest lepsze zrozumienie powstawania nowotworów naczyniowych i mechanizmu leżącego u podstaw rozwoju zwężenia TEVG. Aby lepiej zrozumieć rozwój TEVG i mechanizm powstawania zwężenia, stworzono model owczy5,6. W tym modelu TEVG z powodzeniem przekształciły się w żywe naczynia i były podobne zarówno pod względem morfologii, jak i funkcji żył rodzimych. Wykorzystanie dużego modelu zwierzęcego było dobrym pierwszym krokiem w dostarczaniu ważnych informacji przedklinicznych, które pomogły w klinicznym zastosowaniu TEVG. Jednak pełne zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów powstawania nowotworów naczyniowych w TEVG przy użyciu dużych modeli zwierzęcych jest ograniczone ze względu na ograniczenia w charakterystyce molekularnej fenotypów komórek naczyniowych ze względu na brak narzędzi molekularnych specyficznych dla gatunku. Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, opracowano mysi model TEVG ze względu na szybki postęp w genetyce myszy i ich obszerną charakterystykę molekularną z dodatkową zaletą w postaci skróconej skali czasowej.
Mysi model interpozycji IVC wiernie odwzorował proces tworzenia się naczyń neo-naczyniowych, który występuje u dużych zwierząt i ludzi, ale w znacznie krótszym czasie6-9. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół produkcji przeszczepów na małą skalę przy użyciu biodegradowalnych rusztowań, zbioru i izolacji BM-MNC, wysiewu BM-MNC na rusztowaniu oraz implantacji przeszczepu w modelu mysim.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Ogólnokrajowy Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym.
1. Produkcja przeszczepów
- Przygotować roztwór ε-kaprolaktonu i kopolimeru L-laktydu P(LA/CL), dodając 100 mg P(LA/CL) w 2 ml dioksanu pod wyciągiem. Umieść roztwór w wirze i mieszaj w sposób ciągły przez 1-1,5 godziny, aż do całkowitego rozpuszczenia.
- W międzyczasie wyjmij z zamrażarki arkusz filcu z kwasu poliglikolowego (PGA) i wytnij kilka odcinków o wymiarach 5 x 8 mm. Odetnij również końcówkę pipety o pojemności 0,1-10 μl tuż nad filtrem.
- Włóż igłę 19 G (1,5 długości) do dystalnego końca końcówki pipety i owiń filc PGA wokół igły za pomocą mikrokleszczyków.
- Ostrożnie dociśnij filc do dystalnego końca końcówki pipety, gdzie światło jest prostsze niż część proksymalna, używając igły 18 G, podczas gdy igła 19 G jest do niej wkładana.
- Odpipetować 40 μl roztworu P(CL/LA) do końcówki pipety od góry. Nasącz filc PGA roztworem. Następnie wypchnij pęcherzyki powietrza za pomocą dozownika do pipet. W razie potrzeby powtórz ten proces.
- Umieść przeszczepy w probówce o pojemności 50 ml i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 20 minut. Upewnij się, że główka igieł jest skierowana w dół.
- Przenieś probówkę do liofilizatora i odkurzaj przez 24 godziny. Upewnij się, że otworzyłeś pokrywę probówki, aby zapewnić przepływ powietrza.
- Wyjmij przeszczepy i usuń je z igieł. Odetnij oba końce przeszczepu, pozostawiając odcinek ~5 mm i umieść je z powrotem na igłach, aby zachować ich kształt. Przeszczepy należy przechowywać w eksykatorze.
- Umieść rusztowanie pod światłem UV w okapie bezpieczeństwa biologicznego O/N przed wysiewem komórek.
2. Pobieranie i izolacja komórek jednojądrzastych szpiku kostnego
- Poddaj myszy eutanazji z przedawkowaniem ketaminy/ksylazyny (ketamina, 200 mg/kg i ksylazyna, 20 mg/kg).
- Usuń kości (kości udowe i piszczelowe) od 3 myszy w celu 10 implantacji przeszczepów i umieść na szalce Petriego z 10 cc RPMI. Odetnij oba końce kości i przepłucz szpik kostny za pomocą strzykawki z igłą 25 G do nowej szalki Petriego z prędkością 3 ml RPMI. Zebrać szpik kostny i roztwór RPMI w probówce o pojemności 15 ml i umyć szalkę Petriego dodatkowymi 2 cm³ RPMI, aby zebrać pozostałą część BM.
- Pobrać próbkę (5-10 μl) i policzyć komórkę za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Zapisz wynik.
- Umieść 5 ml Ficoll w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj szpik kostny i roztwór RPMI. Dodaj roztwór bardzo delikatnie, aby nie mieszał się z Ficollem.
- Wirować przy 528 x g przez 30 minut bez hamulca w temperaturze 24 °C.
- Usuń górną różową warstwę. Zbierz środkową przezroczystą warstwę Rysunek 1, która jest warstwą MNC, i rozcieńczyć ją PBS 1:1.
- Odwirować rozcieńczony roztwór MNC o stężeniu 528 x g przez 10 minut w temperaturze 24 °C.
- Usunąć supernatant i rozcieńczyć osad 5 ml PBS.
- Odwirować roztwór osadu o sile 528 x g przez 10 minut w temperaturze 24 °C.
- Usunąć supernatant. Rozcieńczyć granulat odpowiednią objętością RPMI (~200 μl).
- Pobrać próbkę o objętości 5-10 μl i policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Zapisz wynik. Powtórz liczenie komórek jeszcze raz i oblicz średnią liczbę komórek.
- Rozcieńczyć stężenie komórek do 1 000 000 komórek/10 μl za pomocą RPMI.
3. Sadzenie komórek
- Wstępnie zwilż rusztowanie, dodając 5 μl RPMI światłem przez 5 minut, a następnie usuń RPMI.
- Dodać 10 μl komórek jednojądrowych pochodzących ze szpiku kostnego w RPMI z kroku 2.12 do światła rusztowania i odczekać 10 minut, aby komórki mogły przyczepić się do rusztowania.
- Przyciąć igłę 19 G do długości 1 cm i umieścić igłę w świetle rusztowania, aby zachować kształt rusztowania. Umieścić próbkę w płytce 24-dołkowej.
- Dodaj 1,000 μl RPMI do każdej studzienki i inkubuj O/N w inkubatorze.
4. Implantacja przeszczepu
- Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne przed zabiegiem: 1x cienkie nożyczki, 3x mikrokleszcze, 2x mikrozaciski naczyniowe, 1x zacisk do kleszczy, 1x uchwyt do mikroigieł, 1x nożyczki sprężynowe, 1x zwijacz .
- 6-8 tygodniowe samice C57BL/6 są używane jako biorcy przeszczepów naczyniowych metodą inżynierii tkankowej. Wyjmij mysz z klatki i zważ ją, a następnie znieczulenie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe w prawy dolny kwadrant brzucha za pomocą koktajlu ketamina/ksylazyna (ketamina, 100 mg/kg i ksylazyna, 10 mg/kg). Ketoprofen (5 mg/kg, IP) jest stosowany jako środek przeciwbólowy przed znieczuleniem.
- Sprawdź poziom uspokojenia, szczypiąc opowieść, a następnie przytnij włosy na brzuchu. Nasmaruj oczy sterylną maścią okulistyczną i umieść mysz w pozycji grzbietowej leżącej na podkładce. Zdezynfekuj brzuch betadyną i wacikami nasączonymi alkoholem. Przykryj mysz sterylną zasłoną i odsłoń tylko obszar nacięcia.
- Wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej od dołu ksyloidalnego do okolicy nadłonowej i włóż samozatrzymujący się retraktor. Zawiń jelita w gazę zwilżoną solą fizjologiczną. Dosadnie zdefiniuj aortę podnerkową i żyłę główną.
- Umieść dwa zaciski mikronaczyniowe po bliższej i dalszej stronie aorty i żyły głównej, a następnie tępo oddziel aortę od żyły głównej Transekt żyły głównej. W razie potrzeby podwiązać gałęzie aorty brzusznej za pomocą szwów monofilamentowych 10-0 na igłach stożkowych.
- Wszczepić przeszczep interpozycyjny żyły głównej dolnej z proksymalnymi i dystalnymi zespoleniami koniec do końca za pomocą sterylnego szwu 10-0. Przyciąć przeszczep, zwykle 1-2 mm, w zależności od anatomii myszy. Zabezpiecz przeszczep jednym szwem zarówno na bliższym, jak i dystalnym końcu i zacznij szyć w sposób ciągły za pomocą 4-5 szwów z drugiej strony przeszczepu. Po zakończeniu przedniej strony odwróć zaciski i przeszczepy na drugą stronę i zszyj tylną stronę przeszczepu. Podczas implantacji należy często przepłukiwać przeszczep roztworem heparyny, aby zapobiec ostrej zakrzepicy.
- Usuń proksymalny zacisk i zatamuj krwotok, nakładając miejscowo wchłanialny sterylny środek hemostatowy. Gdy krwotok całkowicie ustaje, zdejmij dystalny zacisk i zatamuj krwotok w ten sam sposób. Upewnij się, że krew przepływa przez przeszczep.
- Zamknij mięśnie brzucha i skórę w dwóch warstwach za pomocą czarnego nici poliamidowego 6-0 z dołączoną gwintowaną igłą.
- Wstrzyknąć podskórnie 0,5 ml soli fizjologicznej i umieścić mysz w klatce regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej, aż mysz będzie w pełni mobilna. Po powrocie do zdrowia umieść mysz z powrotem w nowej klatce z papierową ściółką. Podawaj leki przeciwbólowe (ibuprofen, 30 mg/kg, woda pitna) przez 48 godzin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schemat implantacji TEVG przedstawiono na Rysunku 1. Szpik kostny pobrano od myszy donora, a komórki mononuklearne wyizolowano za pomocą wirowania gęstościowego, a następnie zasiano na biodegradowalny rusztowanie. Zasiane rusztowania inkubowano przez noc (O/N), a następnie zaimplantowano myszy biorcy jako graft interpozycyjny żyły głównej dolnej.
Rysunek 2 przedstawia obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego rusztowania PGA-P(CL/LA). Średnica wewnętrzna...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mysi model TEVG jest cennym narzędziem do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów powstawania tkanek nowotworowych i rozwoju zwężenia. Wysiane BM-MNC pokazano zarówno na obrazach histologicznych, jak i SEM wysianych komórek na przeszczepie11. Wykazano również skuteczność wysiewu komórek za pomocą testu DNA7. Korzystając z tego systemu modelowego, wykazaliśmy, że wysiewanie komórek zmniejsza częstość występowania zwężenia TEVG, które było głównym sposobem niepowodzenia w naszym badaniu klinic...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez grant z NIH (RO1 HL098228) dla CKB.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Filc z kwasu poliglikolowego (PGA) | Struktury | biomedyczne Custome zamówione | |
| końcówki pipety, 0,1-10 μ l | Fisher Sientific | 02-707-456 | |
| Labconco | 7070020 | ||
| RPMI medium 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| Szalka Petriego | BD | 353003 | |
| 24-dołkowa płytka | Corning | 3526 | |
| 15 cc tuba | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100ml | Zwany również "Histopaque" |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Obcinak do kości Littauer 4,5 "Prosty | Roboz | RS-8480 | do zbioru BM |
| 4,5 " | Roboz | RS-8120 | do zbioru BM |
| 4,5" | Roboz | RS-5912 | Do mikroskopu do zbioru BM |
| Leica | M80 | ||
| C57BL / 6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 tygodni |
| Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Sterylny roztwór ksylazyny | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparyna sodowa | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Roztwór soli fizjologicznej (sterylny 0,9% chlorek sodu) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Maść okulistyczna z wazeliną | Dechra Produkty weterynaryjne | NDC 17033-211-38 | |
| Podkładki do przygotowania jodu | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Wkładki nasączone alkoholem | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Aplikatory z końcówką bawełnianą | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| Nożyczki drobnoziarniste | FST | 14028-10 | |
| Kleszczyk do mikroapsów | FST | 11018-12 | |
| Kleszcz do nakładania kleszczy | FST | 00072-14 | |
| S& T Zacisk naczyniowy | FST | 00396-01 | |
| Nożyczki sprężynowe | FST | 15008-08 | |
| Retraktory Colibri | FST | 17000-04 | |
| Kleszcz Dumont #5 | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - kleszczyki drobne | FST | 11274-20 | |
| Kleszcze Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | |
| Uchwyt na igły Tish/ kleszcze | Micrins | MI1540 | |
| poliamidowy szew monofilamentowy, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | Do szycia przeszczepu |
| poliamidowy szew monofilamentowy, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | Do muskulatury i zamykania skóry |
| Gąbki włókninowe | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Wchłanialny hemostat | Ethicon | 1961 | |
| ml Strzykawka | BD | 309659 | |
| 3 ml Strzykawka | BD | 309657 | |
| 10 ml Strzykawka | BD | 309604 | |
| 18 G 1,5 cala, Igła | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in, Igła | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in, Igła | BD | 305106 | |
| Recyrkulator ciepłej wody | Gaymar | TP-700 | |
| Podkładka grzewcza | Gaymar | TP-22G | |
| Trymer | Wahl | 9854-500 |
Bibliografia
- Heart Association, A. merican Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
- Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
- Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
- Shin'oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
- Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
- Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
- Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
- Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
- Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
- Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
- Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Sztuczna naczyniowa proteza z inżynierii tkankowejmononuklearne komórki szpiku kostnegowirowanie w gradiencie gęstościimplantacja do żyły głównej dolnejwytwarzanie biodegradowalnego rusztowaniaprotokół zasiewu komórektechniki mikrochirurgiczneanaliza histologicznatworzenie nowej tkankizapobieganie stenozie
