Artykuł metodologiczny

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51649

⸱

26 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biology, Leiden University, 2ZF-screens BV, 3Life Science Methods BV

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Streszczenie

Danio pręgowany stają się cennym narzędziem w fazie przedklinicznej badań przesiewowych odkrywania leków jako cały model zwierzęcy z możliwościami badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Mogą być one wykorzystywane do wypełnienia luki między testami komórkowymi na wcześniejszych etapach a walidacją in vivo w modelach ssaków, zmniejszając w ten sposób liczbę związków przechodzących do testów na znacznie droższych modelach gryzoni. W tym świetle w niniejszym manuskrypcie opisano nowy wysokowydajny rurociąg wykorzystujący danio pręgowanego jako system modelowy in vivo do badania zakażenia Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum. Taka konfiguracja pozwala na generowanie i analizę dużej liczby synchronicznych zarodków homogenicznie zakażonych. Co więcej, elastyczność potoku pozwala użytkownikowi na łatwe wdrożenie innych platform w celu poprawy rozdzielczości analizy w razie potrzeby. Połączenie danio pręgowanego wraz z innowacyjnymi technologiami o wysokiej przepustowości otwiera pole testowania i odkrywania leków na nowe możliwości, nie tylko ze względu na siłę wykorzystania całego modelu zwierzęcego, ale także ze względu na dużą liczbę dostępnych linii transgenicznych, które można wykorzystać do rozszyfrowania sposobu działania nowych związków.

Wprowadzenie

Do tej pory danio pręgowany (Danio rerio) został z powodzeniem uznany za skuteczny model do badania różnych chorób zakaźnych1. Zarodek danio pręgowanego oferuje wyjątkowe możliwości obrazowania in vivo ze względu na jego przezroczystość i dużą liczbę istniejących transgenicznych linii reporterowych eksprymujących białka fluorescencyjne. Ta potężna kombinacja umożliwia śledzenie różnych typów komórek odpornościowych w czasie podczas interakcji z patogenami, takimi jak Mycobacterium marinum, najbliższy krewny M. tuberculosis2, lub Staphylococcus epidermidis, główny czynnik wywołujący infekcję związaną z biomateriałem3-5. W zarodkach danio pręgowanego można stosować różne drogi zakażenia w zależności od celów badania6.

Jedną z tych dróg infekcji jest wstrzyknięcie bakterii w żółtko. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi jest to, że infekcja żółtkiem może być przeprowadzana automatycznie za pomocą zrobotyzowanego wstrzykiwania, co znacznie skraca czas iniekcji i pozwala na wysoką powtarzalność infekcji 7,8.

Poprzednia praca, użycie danio pręgowanego jako systemu modelowego o wysokiej przepustowości in vivo do badania infekcji S. epidermidis i M. marinum okazała się skuteczna 7,8. System ten jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem postępu choroby poprzez zrobotyzowane wstrzykiwanie żółtka wczesnym zarodkom i wykorzystanie odczytu fluorescencji jako miary obciążenia bakteryjnego. Zgodnie z tym założeniem, konfiguracja ta została zoptymalizowana i stworzyła wysoce wydajny rurociąg o wysokiej przepustowości, który może generować dużą liczbę jednorodnie zakażonych zarodków i śledzić postęp infekcji w czasie po leczeniu wieloma związkami. Przy ustalonej konfiguracji możliwe jest wygenerowanie do 8 000 synchronicznych zarodków do badań przesiewowych w kierunku postępu choroby, przetwarzając w ten sposób do 2 500 zarodków na godzinę. Zarodki są sortowane na podstawie obciążenia bakteryjnego przy użyciu zautomatyzowanego systemu, co zapewnia jednorodne grupy zakażonych larw. Ponadto, aby potwierdzić konfigurację, na zarodkach zakażonych szczepem M. marinum E11 lub bardziej zjadliwym szczepem M9 przetestowano efekty referencyjne, o których wiadomo, że zapobiegają postępowi gruźlicy u ssaków.

To badanie szczegółowo opisuje wysokoprzepustowy rurociąg, który został stworzony, aby móc generować dużą liczbę zainfekowanych zarodków oraz późniejszą analizę postępu bakterii podczas rozwoju i po leczeniu złożonym.

Protokół

1. Szczepy bakterii i warunki wzrostu

  1. Przygotować S. epidermidis Inoculum
    1. Weź kilka pojedynczych kolonii z S. epidermidis szczep O-47, zawierający wektor ekspresyjny mCherry pochodzący z pWVW189 (De Boer L. niepublikowany) z płytki agarowej Luria Bertani (LB) uzupełnionej 10 μg/ml chloramfenikolu i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C w 25 ml pożywki LB uzupełnionej 10 μg / ml chloramfenikolu do etapu midlog.
    2. Odwirować 1 ml kultury o stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę, a następnie przemyć je 3x 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 0,3% (v/v) Tween-80.
    3. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) i rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do OD600 0,3 w 2% (w/v) poliwinylopirolidon40 (pvp40) w PBS. Uwaga: OD600 wynoszące 0,3 odpowiada 1,0 x 108 jednostek tworzących kolonie/ml (jtk/ml).
  2. Przygotować M. marinum Inoculum
    1. Pobrać kilka pojedynczych kolonii ze szczepu M. marinum M lub E11 zawierających wektor pSMT3-mCherry stabilnie eksprymujący mCherry10 z płytki agarowej Middlebrook 7H10 z 10% (v/v) wzbogaceniem Middlebrook OADC uzupełnionym 50 μg/ml higromycyny i hodować przez noc w temperaturze 28 °C w 10 ml bulionu Middlebrook 7H9 z 10% (v/v) wzbogaceniem Middlebrook ADC uzupełnionym 50 μg/ml higromycyny.
    2. Odwirować 1 ml kultury o sile 12 000 x g przez 1 minutę, a następnie przemyć ją 3x 1 ml sterylnego PBS z 0,3% (v/v) Tween-80.
    3. Zmierz OD600 i rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do OD600 0,3 w 2% (w/v) pvp40 w PBS. Uwaga: OD600 równe 1 odpowiada 1,0 x 108 jtk/ml.

2. Przygotuj jaja danio pręgowanego

  1. Umieścić maksymalnie 70 samców i 50 samic danio pręgowanego typu dzikiego oddzielnie w dużym statku hodowlanym. Uwaga: Umieść samicę ryby w dolnej części dużego statku hodowlanego.
  2. Wyjmij separator następnego dnia rano, aby danio pręgowany mógł rozpocząć rozmnażanie.
  3. Zebrać jaja na dnie dużego naczynia hodowlanego przez pojemnik na jaja do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej wodą z jaj (60 μg/ml rozpuszczalnej soli morskiej
    4. ).

3. Igły iniekcyjne

  1. Zaopatrz się w dostępne na rynku szklane igły kapilarne wykonane na zamówienie o średnicy wewnętrznej 10 μm.

4. Eksperymentalny zarys iniekcji

  1. Zagotować 100 ml 1% (w/v) agarozy w wodzie jajecznej i schłodzić do około 40 °C. Wlać agarozę do płytki automatycznego mikrowstrzykiwacza i umieścić 1,024-dołkowy stempel w agarozie. Uwaga: Płytka jest gotowa do użycia po schłodzeniu.
  2. W oprogramowaniu operacyjnym automatycznego mikrowtryskiwacza kliknij "Kalibruj stage", a następnie kliknij siatkę studzienki "1024" i umieść płytkę agarozową w mikrowtryskiwaczu i skalibruj płytkę, klikając na ekranie w środkowej pozycji studzienki.
  3. Przejdź do "menu igieł" i kliknij "skalibruj uchwyt igły".
  4. Napełnić igłę do wstrzykiwań za pomocą końcówki do mikronaładowania 10 μl pvp40 zawierającej 100 jtk/nl S. epidermidis lub 30 jtk/nl M. marinum lub użyć pvp40 jako imitacji iniekcji.
  5. Umieść igłę w automatycznym mikrowstrzykiwaczu i skalibruj pozycję x, y, opuszczając lub przesuwając igłę w górę i klikając na ekranie w pozycji igły. Następnie skalibruj pozycję z igły, klikając na ekranie w pozycji końcówki igły.
  6. Rozprowadź jajka na siatce agarozowej za pomocą plastikowej pipety transferowej i usuń nadmiar wody z jajek. Umieść siatkę agarozową w automatycznym mikrowtryskiwaczu.
  7. Przejdź do "Menu wtrysku" i ustaw "Ciśnienie wtrysku" na 200 hPa, "Czas wtrysku" 0,2 sekundy i "Ciśnienie kompensacji" 15 hPa, co odpowiada 1 nl, w menu ustawień Femtojet.
  8. Kliknij przycisk "Wstrzyknij wszystko", aby wstrzyknąć całą płytkę.
  9. Zebrać jaja po wstrzyknięciu, myjąc je na szalce Petriego (92 x 16 mm), z maksymalną liczbą 70 zarodków na płytkę Petriego, i inkubować w temperaturze 28 °C.

5. Analiza cytometru przepływowego

  1. Przygotować cytometr przepływu dużych cząstek zgodnie z instrukcjami producenta i napełnić kubek na próbkę i pojemnik na płyn w osłonce wodą jajeczną.
  2. W oprogramowaniu operacyjnym przejdź do menu "PMT" i użyj następujących ustawień: 650 V dla kanału "Czerwony" i 0 V dla kanału "Zielony" i "Żółty". Następnie przejdź do menu "Progi" i użyj następujących ustawień: sygnał progowy "Gęstość optyczna": 975 mV (wartość COPAS: XL: 50) i minimalny "Czas przelotu" (TOF) do 320 μs (wartość COPAS XL: 800) w celu zmniejszenia wpływu zanieczyszczeń.
  3. W celu analizy bez sortowania zarodków przejdź do kroku 5.4, w celu analizy i sortowania zarodków na szalkę Petriego przejdź do kroku 5.5, a w celu analizy i sortowania zarodków na płytkę 96-dołkową przejdź do kroku 5.6.
  4. Umieść zarodki w kubku na próbkę i kliknij przycisk "start", aby rozpocząć analizę. Gdy wszystkie zarodki zostaną przeanalizowane, przerwij analizę, klikając przycisk "zatrzymaj". Zapisz dane, klikając "Przechowuj wszystko". Uwaga: Wszystkie dane są przechowywane jako pliki TXT, LMD, DAT, CSV i BSRT. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 5.7.
  5. Umieścić zarodki w pojemniku na próbkę i określić maksymalną liczbę 70 zarodków na płytkę do sortowania, wpisując liczbę 70 w menu "Sortowanie". Umieść pustą szalkę Petriego pod sorterem i kliknij "Sortowanie ręczne". Gdy szalka Petriego zostanie napełniona, zapisz dane, klikając "Przechowuj wszystko". Uwaga: Wszystkie dane są przechowywane jako pliki TXT, LMD, DAT, CSV i BSRT. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 5.7.
  6. Umieścić zarodki w kubku na próbkę i określić maksymalną liczbę 1 zarodka na studzienkę do sortowania, wpisując liczbę 1 w menu "Sortowanie". Umieść pustą 96-dołkową płytkę w lewym uchwycie płytki i kliknij przycisk "Napełnij płytkę". Po napełnieniu płytki 96-dołkowej zapisz dane, klikając przycisk "Przechowywać wszystko". Uwaga: Wszystkie dane są przechowywane jako pliki TXT, LMD, DAT, CSV i BSRT. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 5.7.
  7. Pobierz plik TXT, aby przetworzyć surowe dane, użyj następujących ustawień filtru danych: 'Wybór statusu': 40, a jeśli używasz modułu sortowania 'Sortowanie statusu': 6. Następnie użyj liczb z całkowitego sygnału fluorescencji z kanału "Czerwony", aby obliczyć średnią i błąd standardowy średniej. Wykreśl te zestawy danych na wykresach słupkowych lub punktowych.

6. Leczenie uzależnień od narkotyków

  1. Analizuj i sortuj zarodki zakażone M. marinum w dwóch równych grupach po 3 dniach od wstrzyknięcia (dpi) za pomocą cytometru przepływu dużych cząstek (krok 5.5). Traktować jedną grupę związkiem będącym przedmiotem zainteresowania w rozpuszczalniku nośnikowym, a drugą samym rozpuszczalnikiem nośnikowym (kontrola). Zastosuj podobne zabiegi do symulowanej kontroli wstrzykniętej, aby przetestować skutki uboczne antybiotyków.
  2. Powtórzyć analizę w 4 i 5 dpi (krok 5.5) i odświeżyć wodę z jaj lub wodę z jaj zawierającą ten związek.

7. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości

  1. Znieczulić zarodki 0,02% (w/v) buforowanym estrem etylowym kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina) w wodzie jajecznej 10 minut przed analizą.
  2. Przygotować system Technologii Automatycznego Badania Kręgowców oraz Próbnik Dużych Cząstek zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Wybierz obrazy referencyjne odpowiadające wiekowi zarodków z menu "Obrazowanie – Obiekt – Ustawienia wykrywania".
  4. Wybierz liczbę zdjęć i orientację, które mają zostać wykonane przez system Vertebrate Automated Screening Technology z menu "Obrazowanie – Automatyczne zapisywanie obrazów".
  5. Umieścić 96-dołkową płytkę wypełnioną zarodkami (z kroku 5.6) w lewym uchwycie płytki próbnika dużych cząstek i kliknąć przycisk "Uruchom płytkę".
  6. Gdy zarodek zostanie wykryty i prawidłowo ustawiony, należy wykonać zdjęcie głowy i ogona oddzielnie za pomocą CLSM za pomocą 10-krotnego suchego obiektywu, a następnie zszyć obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.

Wyniki

Przedstawione wyniki pokazują, że wysokoprzepustowy schemat badania infekcji S. epidermidis oraz M. marinum został z powodzeniem ustanowiony i może zostać rozszerzony na inne modele infekcji. Po pierwsze, zastosowanie dużego naczynia do rozrodu (Ryc. 1A), opartego na systemie opisanym przez Adatto et al. (2011)11, umożliwia generowanie dużej liczby synchronicznych jaj w pojedynczych zdarzeniach, co zapewnia wysoką kontrolę nad procesem tarła. Następnie, aby móc wstrzyknąć dużą liczbę embrionów w krótkim odstępie czasu, zastosowano ulepszoną wersję wcześniej opracowanego zautomatyzowanego systemu mikroiniekcji7 (Ryc. 1A). Aby ocenić, który etap rozwoju jest najlepszy do zakażenia żółtka, iniekcje z S. epidermidis oraz M. marinum przeprowadzano na wszystkich różnych etapach między stadiem 1 a 512 komórek, zgodnie z opisem przedstawionym przez Kimmel et al. (1995)12.

Iniekcje 100 jtk S. epidermidis pomiędzy stadium 16 a 128 komórek zapewniły najlepszy obraz infekcji (Rycina 2). Bakterie namnażały się wewnątrz żółtka przez 3 dni, a od 3 dpi zaczęły rozprzestrzeniać się do organizmu. Wykonywanie iniekcji przed stadium 16 komórek prowadziło do wysokiej śmiertelności od 4 dpi, natomiast iniekcja po stadium 256 komórek wykazała głównie wzrost bakterii wewnątrz żółtka, przy czym niemal żadne bakterie nie rozprzestrzeniały się wewnątrz ciała zarodka. Ilościowe oznaczenie obciążenia bakteryjnego przeprowadzono poprzez analizę intensywności fluorescencji z użyciem cytometru przepływowego do dużych cząstek zgodnie z opisem Venemana et al. (2013)8 (Rycina 3).

Obserwacje wykazały, że optymalne stadium rozwojowe dla iniekcji 30 cfu M. marinum przypada na etap od 16 do 128 komórek dla szczepu E11 (Rysunek 4A) oraz od 16 do 64 komórek w przypadku bardziej wirulentnego szczepu M (Rysunek 4B). Zarodki poddane iniekcji na tych stadiach wykazywały wzrost bakterii wewnątrz żółtka oraz rozprzestrzenianie się bakterii w całym zarodku (Rysunek 7). Zakażenie oboma szczepami na wcześniejszych stadiach skutkowało nieswoistym, uogólnionym wzrostem bakterii, co prowadziło do śmierci zarodków po 4 dpi. Z kolei w zarodkach poddanych iniekcji na późniejszych stadiach obciążenie bakteryjne ograniczało się do żółtka.

Następnie wstępna sortowanie za pomocą cytometru przepływowego do dużych cząstek (Rycina 1B) pozwoliło na wygenerowanie dużych, homogenicznych grup zainfekowanych ryb, z wyłączeniem embrionów niezinfekowanych lub silnie zainfekowanych (Rycina 5A i Rycina 6A). Po wstępnym sortowaniu embriony zainfekowane M. marinum poddano leczeniu ryfampicyną, lekiem pierwszego rzutu stosowanym w terapii gruźlicy. Poprzednie badania wykazały, że leczenie ryfampicyną w dawce 200 μM skutecznie redukuje infekcję M. marinum u danio pręgowanego7,13. Wykorzystując dużą liczbę homogenicznie zainfekowanych embrionów uzyskanych dzięki układowi o wysokiej przepustowości, przeprowadzono leczenie różnymi dawkami. Wykazano, że u embrionów zainfekowanych szczepem M M. marinum i leczonych przez 48 hr ryfampicyną w dawkach 12, 24 i 200 μM nastąpiła skuteczna redukcja infekcji prątkowej w sposób zależny od dawki (Rycina 5B). Ze względu na skuteczną redukcję infekcji przy zastosowaniu ryfampicyny w dawce 200 μM, stężenie to wykorzystano w kolejnych eksperymentach. Zgodnie z poprzednim wynikiem, badając progresję obciążenia bakteryjnego przy użyciu szczepu E11 M. marinum, zaobserwowano znaczną redukcję od 24 hr po leczeniu 200 μM ryfampicyną (Rycina 6B). 

Ponadto, jeśli wymagane jest obrazowanie tych embrionów przy dużym powiększeniu, mogą one zostać automatycznie rozmieszczone w płytkach 96-dołkowych (Rysunek 1C), skąd próbki mogą być analizowane przy użyciu systemu Vertebrate Automated Screening Technology z modułem Large Particle Sampler zamontowanym do CLSM.

System Vertebrate Automated Screening Technology z modułem Large Particle Sampler to system, który może zostać zamontowany na konfokalnym mikroskopie skaningowym (CLSM) lub mikroskopie stereoskopowym. Urządzenie to umożliwia automatyczne ładowanie żywych lub utrwalonych embrionów z płytki 96-dołkowej lub pojemnika zbiorczego za pomocą szklanej kapilary oraz ich orientację przed kamerą pod pożądanym kątem (np. grzbietowym lub bocznym). Obrazy embrionu we wszystkich orientacjach mogą być rejestrowane za pomocą wbudowanej kamery lub zewnętrznego CLSM (Rysunek 7). Następnie embriony są przenoszone do pojemnika na próbki lub pojemnika na odpady.

Schemat przetwarzania jaj; obejmuje wstrzykiwanie do żółtka, cytometrię przepływową i zautomatyzowaną analizę przesiewową.
Rycina 1. Ogólny schemat eksperymentalny. A) Dorosłe ryby są łączone w celu rozrodu, jaja są zbierane, układane w płytce z agarozy i poddawane iniekcji. B) Wstrzyknięte jaja są inkubowane w temperaturze 28 °C i zostaną wstępnie posortowane w celu ewentualnego podania leku. C) Następcza analiza za pomocą cytometru przepływowego do dużych cząstek i/lub systemu Large Particle Sampler/Vertebrate Automated Screening Technology z wykorzystaniem CLSM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat rozwoju zarodka; efekt S. epidermidis; stadia komórkowe; obrazowanie fluorescencyjne; dane o śmiertelności.
Rycina 2. Ustalenie optymalnego stadium komórkowego dla iniekcji S. epidermidis do żółtka. Zarodki danio pręgowanego otrzymywały iniekcje do żółtka na różnych stadiach rozwoju, od stadium 1 do 512 komórek, z dawką 100 cfu S. epidermidis. Zarodki poddane iniekcji między stadium 1 a 8 komórek wykazały wzrost bakterii w żółtku oraz wysoką śmiertelność od 4 dpi. Zarodki poddane iniekcji między stadium 16 a 128 komórek wykazały wzrost bakterii w żółtku i wewnątrz ciała, zaczynając od 3 dpi. Zarodki poddane iniekcji między stadium 256 a 512 komórek wykazały liczne ogniska wzrostu bakterii wewnątrz żółtka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza wykresu wzrostu bakterii i sygnału czerwonej fluorescencji w embrionach w czasie oraz korelacja CFU.
Rycina 3. Ilościowe oznaczenie obciążenia bakteryjnego przy użyciu cytometru przepływowego do dużych cząstek. Do żółtka embrionów zebrafish wstrzyknięto 100 cfu S. epidermidis. A) Do 5 dpi, każdego dnia grupy po 10 embrionów homogenizowano i wysiewano bezpośrednio, co wykazało średni wzrost wykładniczy na podstawie dwóch replik biologicznych (słupki błędów = SEM). B) Analiza cytometrem przepływowym do dużych cząstek pokazuje średni sygnał fluorescencji z embrionów niewstrzykniętych oraz wstrzykniętych S. epidermidis. Analizie poddano od 30 do 160 embrionów na warunki (słupki błędów = SEM), różne litery oznaczają statystycznie istotne różnice w teście jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA z następującym testem post-hoc Tukeya (P < 0.001), ns: brak istotnych różnic. C) Korelacja między cfu a średnim sygnałem fluorescencji w grupach po 10 embrionów zainfekowanych S. epidermidis (słupki błędów = SEM). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Veneman et al. (2013)8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki testu infekcji u rybek danio pręgowanych; stadia M. marinum, mikroskopia fluorescencyjna badająca śmiertelność.
Rysunek 4. Ustalenie optymalnego stadium komórkowego dla wstrzykiwania M. marinum do żółtka. Zarodki rybek danio pręgowanych wstrzykiwano na wszystkich różnych stadiach rozwojowych od stadium 1 do 512 komórek dawką 30 cfu szczepów E11 i M M. marinum. A, B) Zarodki wstrzyknięte w stadiach od 1 do 8 komórek wykazały podobne rozprzestrzenianie się patogenu i śmiertelność dla obu szczepów. A) Zarodki wstrzyknięte w stadiach od 16 do 128 komórek szczepem E11 wykazały tworzenie ziarniniaków i infekcję systemową, podczas gdy w przypadku zarodków wstrzykniętych w stadiach od 256 do 512 komórek obciążenie bakteryjne pozostało w żółtku. B) Zarodki wstrzyknięte w stadiach od 16 do 64 komórek szczepem M wykazały tworzenie struktur przypominających ziarniniaki i infekcję systemową, podczas gdy w przypadku zarodków wstrzykniętych w stadiach od 128 do 512 komórek obciążenie bakteryjne pozostało w żółtku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza sygnału czerwonej fluorescencji M. marinum; wykresy, efekty leczenia RIF, porównanie danych widmowych.
Rysunek 5. Leczenie ostrej infekcji M. marinum lekiem przeciwgruźliczym pierwszego rzutu. Zarodki wstrzyknięte w stadium od 16 do 64 komórek z 30 cfu szczepu M M. marinum zostały przepuszczone przez cytometr przepływowy do dużych cząstek w 3 dpi w celu posortowania na dwie grupy po odrzuceniu zarodków niezinfekowanych i/lub silnie zainfekowanych. A) Fluorescencja poszczególnych zarodków w obu grupach. B) Zarodki leczone ryfampicyną (RIF) przez 48 hr w dawkach 12, 24 i 200 μM zostały przeanalizowane w 4 dpi; ich obciążenie bakteryjne jest znacznie zredukowane. C) Reprezentatywne profile COPAS zarodków leczonych DMSO oraz ryfampicyną w dawkach 12, 24 i 200 μM przez 24 hr. Obciążenie bakteryjne i jego rozkład są wskazane przez czerwone piki. Niebieska linia reprezentuje profil elementu posortowanego (zarodek zebrafish w 4 dpf) przez COPAS. Analizie poddano 60-90 zarodków na warunek. Każdy punkt danych reprezentuje pojedynczy zarodek. Wartości podano jako średnia ± SEM. ns: brak istotnych różnic. Analizę istotności statystycznej różnic przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dane fluorescencyjne szczepu E11 M. marinum; wykres sygnału czerwonego w funkcji dpi; analiza DMSO vs. RIF 200 µM.
Rysunek 6. Leczenie przewlekłej infekcji M. marinum lekiem przeciwgruźliczym pierwszego rzutu. Zarodki wstrzyknięte w stadium od 16 do 64 komórek z 30 cfu szczepu E11 M. marinum zostały poddane analizie w cytometrze przepływowym do dużych cząstek w 3 dpi, a następnie podzielone na dwie grupy po odrzuceniu zarodków niezinfekowanych i/lub silnie zainfekowanych. A) Fluorescencja poszczególnych zarodków w obu grupach. B) Analiza zarodków leczonych ryfampicyną (RIF) w stężeniu 200 μM przez 4 dni wykazała istotną redukcję obciążenia bakteryjnego po 1 dniu leczenia. Analizie poddano 90 zarodków na każdą grupę. Wartości przedstawiono jako średnia ± SEM. Różne litery oznaczają istotne różnice między punktami czasowymi w obrębie tej samej grupy terapeutycznej. * oznacza istotne różnice w stosunku do grupy kontrolnej. ns: brak istotnych różnic. Analizę istotności statystycznej różnic przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu posthoc Tukeya (P < 0.05). Rysunek B) został zmodyfikowany na podstawie pracy Spaink et al. (2013)13. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej znakowanych danio pręgowanych ukazujący wzorce ekspresji białek w żywych kolorach.
Rysunek 7. Wynik wstrzyknięcia M. marinum E11 do żółtka obrazowany przy użyciu Vertebrate Automated Screening Technology oraz CLSM. Konfokalny stos Z (zszyte 3 obrazy) zarodka fli1-egfp14 w 5 dpi. A) Żywy zarodek wykazujący proliferację bakterii M. marinum E11 (czerwony) w całym organizmie. B) Utrwalony zarodek fli-egfp w 5 dpi wykazujący bakterie M. marinum E11 (czerwony) w całym organizmie, współlokalizujące z leukocytami (jasnoniebieski) wykrytymi za pomocą immunostainingu L-plastyny15.

Dyskusja

Metodologia wysokiej przepustowości opisana w tym artykule zapewnia szybki i ekonomiczny proces badań przesiewowych dużej liczby zarodków i larw ryb z różnymi typami infekcji. Zastosowanie dużego zbiornika hodowlanego zamiast tradycyjnych jedno- lub rodzinnych zbiorników hodowlanych ułatwiło kontrolę procesu tarła i wytwarzanie większej liczby synchronicznych jaj. Dzięki ulepszonej wersji zautomatyzowanego systemu mikroiniekcji7 możliwe jest wstrzyknięcie do 2500 komórek jajowych w tym samym etapie komórkowym w ciągu 1 godziny. Dzięki tym aktualizacjom i ulepszonemu oprogramowaniu możliwe jest wstrzyknięcie większej liczby komórek jajowych niż było to możliwe wcześniej, co można wykorzystać do wykonywania dużych badań przesiewowych leków z proliferacją bakterii jako odczytem. Jednak metoda ta jest nadal ograniczona do wstrzykiwania żółtka, innych dróg iniekcji, na przykład opisanych przez Benarda i wsp. (2012)Miejmy nadzieję, że 6 zostanie włączony do zautomatyzowanego systemu mikroiniekcji w najbliższej przyszłości.

Chociaż metody te są porównywane do badań przesiewowych danio pręgowanego, byłyby one przydatne również w przypadku innych gatunków ryb. Na przykład wykazano, że karp pospolity ma zalety w badaniach przesiewowych leków. Podobnie jak danio pręgowany, ikra i zarodki we wczesnym stadium rozwoju karpia pospolitego są przezroczyste, ale ich główną zaletą jest duży rozmiar ikry wynoszący setki tysięcy jaj i dostępność linii wsobnych, które oferują bardziej stałe tło genetyczne16.

Analiza dużych ilości zakażonych zarodków odbywa się za pomocą wysokoprzepustowego cytometru przepływowego z dużymi cząstkami. To urządzenie może sortować analizowane zarodki na płytki wielodołkowe lub szalkę Petriego, dzięki czemu jest szczególnie przydatne do testowania dużej liczby związków. Jeśli wymagana jest wyższa rozdzielczość obrazowania, konfiguracja jest dostosowywana w taki sposób, że technologia cytometru przepływu dużych cząstek może być wykorzystana do wstępnego badania przesiewowego, a następnie analizy próbek przy średniej przepustowości i wyższej rozdzielczości. Można to zrobić za pomocą technologii zautomatyzowanych badań przesiewowych kręgowców17,18. To urządzenie może automatycznie pobierać żywe lub utrwalone zarodki między 2 a 7 dniem po zapłodnieniu z wielodołkowej płytki lub pojemnika zbiorczego, obrazować 360° przez naczynia włosowate za pomocą CLSM lub mikroskopii stereoskopowej i ponownie wyrzucać do 2 pojemników zbiorczych, umożliwiając ręczne sortowanie zarodków na podstawie obrazów mikroskopowych. Przyszłe ulepszenia umożliwią sortowanie zarodków po obrazowaniu na płytkę wielodołkową, co umożliwi automatyczne badanie przesiewowe dużej liczby pojedynczych zarodków w czasie za pomocą CLSM. Zakładając, że w przyszłych zastosowaniach system Vertebrate Automated Screening Technology może być również połączony z technologią cytometru przepływu dużych cząstek bez konieczności wcześniejszego dozowania larw do płytek wielodołkowych, doprowadzi to do bardziej zaawansowanego sortowania.

W artykule opisano ustanowienie i optymalizację wysokoprzepustowej konfiguracji do badania infekcji S. epidermidis i M. marinum jako modelu odkrywania leków. Wykazano w nim, że wynik tych bakterii wstrzykniętych do żółtka zależy od etapu rozwoju jaj w momencie wstrzyknięcia. Wstrzyknięcie M. marinum E11 w stadium 16-128 komórek lub szczepu M w stadium 16-64 komórek prowadzi do tego samego wzorca infekcji, co wstrzyknięcie do żyły ogonowej 2,6. Jednak ta konfiguracja nie ogranicza się tylko do namnażania patogenów bakteryjnych. Wykazano wcześniej, że możliwe jest zrobotyzowane wstrzykiwanie roztworów zawierających DNA, RNA lub morfoliny w celu przeprowadzenia badań nad transgenezą, nadekspresją i nokautem genów,odpowiednio13. Ponadto wykazano, że ta konfiguracja jest również przydatna do badania proliferacji i migracji komórek rakowych. W związku z tym proces ten stanowi wszechstronną metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych różnych mechanizmów sygnałowych w kontekście odporności wrodzonej, stosowanej w chorobach zakaźnych i rozwoju raka. Badania te można łączyć z innymi w celu odkrywania leków, ale także z analizą możliwych skutków toksycznych zidentyfikowanych leków.

Oświadczenia

J.S jest właścicielem firmy Life Science Methods BV, która produkuje instrumenty użyte w tym artykule.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Leonie de Boer i Bas Zaat (Akademickie Centrum Medyczne) za dostarczenie nam szczepu S. epidermidis O-47. Dziękujemy Rico Bongaartsowi, Francisowi Smetowi i Angeli Comas (Union Biometrica) za pomoc i porady dotyczące analizy COPAS XL i VAST BioImager. Dziękujemy Davy'emu de Wittowi, Ulrike Nehrdich i Laurze van Hulst za opiekę nad rybami, a także innym kolegom z Uniwersytetu w Lejdzie za pomocne dyskusje. Badania te stanowią część projektu P5.03 IBIZA programu badawczego Instytutu Materiałów Biomedycznych, współfinansowanego przez holenderskie Ministerstwo Gospodarki oraz programu Smart Mix (NWOA_6QY9BM) Ministerstwa Gospodarki Holandii oraz Ministerstwa Edukacji, Kultury i Nauki Holandii. Dodatkowe wsparcie uzyskano w ramach unijnego projektu ZF-Health (FP7-Health-2009-242048), a RMJ otrzymał wsparcie w ramach stypendium Marie Curie jako doświadczony badacz w unijnej sieci szkoleń wstępnych FishForPharma (PITN-GA-2011-289209). SJR otrzymało dofinansowanie ze środków Wspólnego Przedsięwzięcia na rzecz Inicjatywy w zakresie Leków Innowacyjnych na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 115337, którego środki pochodzą z wkładu finansowego z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) oraz wkładu rzeczowego przedsiębiorstw EFPIA. Autorzy dziękują również za wsparcie finansowe ze strony Funduszu Uniwersytetu w Lejdzie (LUF) na rzecz robotyki oraz z firmy Cyttron w ramach programu Besluit Subsidies Investeringen Kennisinfrastructuur, który z kolei jest wspierany finansowo przez Holenderską Organizację Badań Naukowych dla urządzeń do obrazowania. Zakup systemu COPAS był częściowo wspierany przez Wydział Nauk o Ziemi i Naukach Przyrodniczych (ALW) przy wsparciu finansowym Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO, 834.10.004).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Middlebrook 7H10 agarBD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA262710
Middlebrook 7H9 bulionBD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA271310
BBL Middlebrook Wzbogacanie katalazy dekstrozy albuminy kwasu oleinowego (OADC)BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA211886
BBL Wzbogacanie katalazy dekstrozy albuminowej (ADC) w Bml MiddlebrookBD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, Stany Zjednoczone211887
Agar LBSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, StanyZjednoczone L5542Wielu dostawców
Bulion LBSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USAL3022Wielu dostawców
ChloramfenikolBio-connect, Huissen, Holandia16785.03Wielu dostawców
HigromycynaBio-connect, Huissen, Holandia25966.01Wielu dostawców
Tween-80Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USAP1754Wielu dostawców
Poliwinylopirolidon40Calbiochem, San Diego, Kalifornia, USA529504Wielu dostawców
Sól metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USAA5040
AgaroseSphaero-Q, Gorinchem, HolandiaS103Wielu dostawców
Natychmiastowa sól morskaoceaniczna Sera Marin, Heinsberg, Niemcy5460
iSPAWNTechniplast, Buguggiate, WłochyiSPAWN
Zautomatyzowany system mikroiniekcjiLife Science Methods BV, Leiden, Holandia Zautomatyzowanysystem
mikroiniekcjiAnalizator i sortownik cząstek złożonych obiektów XL (COPAS XL)Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, Stany Zjednoczonekręgowców COPAS XL
BioImager (VAST BioImager)Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, Stany ZjednoczoneVAST BioImager
LP SamplerUnion BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USAPróbnik
Konfokalny skan laserowy mikroskopLeica Microsystems, Wetzlar, NiemcyTCS SL
Igła iniekcyjna 10 i mikro; m średnica wewnętrznaQvotek, Mississauga, Kanada
Technologia automatycznego badania przesiewowego LP

Bibliografia

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).
  3. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages. J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).
  4. Broekhuizen, C. A., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).
  5. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface. Sci Transl Med. 4, (2012).
  6. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. , (2012).
  7. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  8. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255 (2013).
  9. Sar, A. M., et al. Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence. Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).
  10. Stoop, E. J. M., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).
  11. Adatto, I., et al. A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos. PLoS One. 6, (2011).
  12. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  13. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248, 307-318 (2002).
  15. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).
  16. Henkel, C. V., et al. Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9, 59-67 (2012).
  17. Chang, T. -Y., et al. Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing. Lab on a Chip. 12, 711 (2012).
  18. Pardo-Martin, C., et al. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nature Methods. 7, 634-636 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Infekcja zarodk w rybek danio ostrobramkowychwysokoprzepustowe przesiewanieautomatyczna mikroiniekcjacytometria przep ywowa du ych cz stekmikroskopia konfokalnaproces odkrywania lek wanaliza obci enia bakteryjnegosortowanie zarodk w

Powiązane artykuły