Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

Ilia Fishbein; Scott P. Forbes; Richard F. Adamo; Michael Chorny; Robert J. Levy; Ivan S. Alferiev

doi:10.3791/51653

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51653

⸱

12 sierpnia 2014

Ilia Fishbein¹ , Scott P. Forbes¹ , Richard F. Adamo¹ , Michael Chorny¹ , Robert J. Levy¹ , Ivan S. Alferiev¹

¹Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Te badania donoszą o odwracalnym przyczepianiu wektorów genów adenowirusa do bezpowłokowych metalowych powierzchni stentów i modelowych dysków siatkowych. Przedłużone uwalnianie cząstek wirusa kompetentnych do transdukcji, uzależnione od hydrolizy środków sieciujących stosowanych do immobilizacji wektorów, skutkuje trwałą, specyficzną dla miejsca ekspresją transgenu w komórkach naczyniowych i stentowanych tętnicach.

Streszczenie

Restenoza w stencie stanowi poważne komplikacje procedur rewaskularyzacji opartych na stentach, szeroko stosowanych do przywrócenia przepływu krwi przez krytycznie zwężone segmenty tętnic wieńcowych i obwodowych. Stenty wewnątrznaczyniowe zdolne do przestrajalnego uwalniania genów o działaniu przeciwrestenotycznym mogą stanowić strategię alternatywną dla obecnie stosowanych stentów uwalniających leki. Aby osiągnąć translację kliniczną, stenty uwalniające geny muszą wykazywać przewidywalną kinetykę uwalniania wektora genowego unieruchomionego przez stent i specyficznej dla miejsca transdukcji naczyń krwionośnych, unikając jednocześnie nadmiernej reakcji zapalnej zwykle związanej z powłokami polimerowymi stosowanymi do fizycznego uwięzienia wektora. W artykule opisano szczegółową metodologię bezpłaszczowego wiązania wektorów genów adenowirusa ze stentami w oparciu o odwracalne wiązanie cząstek adenowirusa z powierzchnią stali nierdzewnej modyfikowaną polialliloaminą bisfosfonianem (PABT) za pomocą hydrolizowalnych środków sieciujących (HC). Do połączenia wektora ze stentem wykorzystano rodzinę dwufunkcyjnych (reaktywnych amino i tiolowo) HC o średnim t_1/2hydrolizy estrów w łańcuchu w zakresie od 5 do 50 dni. Procedura immobilizacji wektora jest zwykle przeprowadzana w ciągu 9 godzin i składa się z kilku etapów: 1) inkubacja próbek metalu w wodnym roztworze PABT (4 godziny); 2) deprotekcja grup tiolowych zainstalowanych w PABT tris(2-karboksyetylo)fosfiną (20 min); 3) zwiększenie zdolności reaktywnej tiolu powierzchni metalu poprzez reakcję próbek z polietylenoiminą derywatyzowaną grupami pirydylodititowymi (PDT) (2 godz.); 4) konwersja grup PDT do tioli z ditiotreitolem (10 min); 5) modyfikacja adenowirusów za pomocą HC (1 godz.); 6) oczyszczanie zmodyfikowanych cząstek adenowirusowych metodą chromatografii kolumnowej z wyłączeniem wielkości (15 min) oraz 7) immobilizacja tiolowo-reaktywnych cząstek adenowirusa na powierzchni tiolowanej stali (1 godz.). Technika ta ma szeroki potencjał zastosowania poza stentami, ułatwiając inżynierię powierzchni urządzeń bioprotetycznych w celu zwiększenia ich biokompatybilności poprzez dostarczanie genów za pośrednictwem substratu do komórek łączących się z wszczepionym materiałem obcym.

Wprowadzenie

Skuteczność terapii genowej jako metody terapeutycznej jest utrudniona przez słabą zdolność wektorów terapii genowej^{do kierowania 1,2}. Brak odpowiedniego ukierunkowania skutkuje subterapeutycznymi poziomami ekspresji transgenu w miejscu docelowym i prowadzi do szerokiego rozprzestrzeniania się wektorów do narządów niedocelowych³, w tym tych odpowiedzialnych za narastanie odpowiedzi immunologicznej zarówno przeciwko wektorowi, jak i kodowanemu produktowi terapeutycznemu^4,5. Jednym z potencjalnych sposobów zrównoważenia rozwiązłości transdukcji i promowania celowania jest wprowadzenie wektorów genowych w pożądane miejsce w formie, która ....