Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51653

⸱

12 sierpnia 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Te badania donoszą o odwracalnym przyczepianiu wektorów genów adenowirusa do bezpowłokowych metalowych powierzchni stentów i modelowych dysków siatkowych. Przedłużone uwalnianie cząstek wirusa kompetentnych do transdukcji, uzależnione od hydrolizy środków sieciujących stosowanych do immobilizacji wektorów, skutkuje trwałą, specyficzną dla miejsca ekspresją transgenu w komórkach naczyniowych i stentowanych tętnicach.

Streszczenie

Restenoza w stencie stanowi poważne komplikacje procedur rewaskularyzacji opartych na stentach, szeroko stosowanych do przywrócenia przepływu krwi przez krytycznie zwężone segmenty tętnic wieńcowych i obwodowych. Stenty wewnątrznaczyniowe zdolne do przestrajalnego uwalniania genów o działaniu przeciwrestenotycznym mogą stanowić strategię alternatywną dla obecnie stosowanych stentów uwalniających leki. Aby osiągnąć translację kliniczną, stenty uwalniające geny muszą wykazywać przewidywalną kinetykę uwalniania wektora genowego unieruchomionego przez stent i specyficznej dla miejsca transdukcji naczyń krwionośnych, unikając jednocześnie nadmiernej reakcji zapalnej zwykle związanej z powłokami polimerowymi stosowanymi do fizycznego uwięzienia wektora. W artykule opisano szczegółową metodologię bezpłaszczowego wiązania wektorów genów adenowirusa ze stentami w oparciu o odwracalne wiązanie cząstek adenowirusa z powierzchnią stali nierdzewnej modyfikowaną polialliloaminą bisfosfonianem (PABT) za pomocą hydrolizowalnych środków sieciujących (HC). Do połączenia wektora ze stentem wykorzystano rodzinę dwufunkcyjnych (reaktywnych amino i tiolowo) HC o średnim t1/2 hydrolizy estrów w łańcuchu w zakresie od 5 do 50 dni. Procedura immobilizacji wektora jest zwykle przeprowadzana w ciągu 9 godzin i składa się z kilku etapów: 1) inkubacja próbek metalu w wodnym roztworze PABT (4 godziny); 2) deprotekcja grup tiolowych zainstalowanych w PABT tris(2-karboksyetylo)fosfiną (20 min); 3) zwiększenie zdolności reaktywnej tiolu powierzchni metalu poprzez reakcję próbek z polietylenoiminą derywatyzowaną grupami pirydylodititowymi (PDT) (2 godz.); 4) konwersja grup PDT do tioli z ditiotreitolem (10 min); 5) modyfikacja adenowirusów za pomocą HC (1 godz.); 6) oczyszczanie zmodyfikowanych cząstek adenowirusowych metodą chromatografii kolumnowej z wyłączeniem wielkości (15 min) oraz 7) immobilizacja tiolowo-reaktywnych cząstek adenowirusa na powierzchni tiolowanej stali (1 godz.). Technika ta ma szeroki potencjał zastosowania poza stentami, ułatwiając inżynierię powierzchni urządzeń bioprotetycznych w celu zwiększenia ich biokompatybilności poprzez dostarczanie genów za pośrednictwem substratu do komórek łączących się z wszczepionym materiałem obcym.

Wprowadzenie

Skuteczność terapii genowej jako metody terapeutycznej jest utrudniona przez słabą zdolność wektorów terapii genowejdo kierowania 1,2. Brak odpowiedniego ukierunkowania skutkuje subterapeutycznymi poziomami ekspresji transgenu w miejscu docelowym i prowadzi do szerokiego rozprzestrzeniania się wektorów do narządów niedocelowych3, w tym tych odpowiedzialnych za narastanie odpowiedzi immunologicznej zarówno przeciwko wektorowi, jak i kodowanemu produktowi terapeutycznemu4,5. Jednym z potencjalnych sposobów zrównoważenia rozwiązłości transdukcji i promowania celowania jest wprowadzenie wektorów genowych w pożądane miejsce w formie, która uniemożliwia ich swobodne rozprzestrzenianie się przez krew i limfę. Zazwyczaj takie wysiłki opierają się na miejscowo wstrzykiwanych systemach dostarczania składających się z wektorów wirusowych lub niewirusowych zmieszanych z fibryną, kolagenem lub hydrożelowymi matrycami hydrożelowymi kwasu hialuronowego6-10, które są zdolne do przejściowego podtrzymywania wektorów genowych w miejscu wstrzyknięcia poprzez fizyczne uwięzienie ich w sieci polimerowej.

Innym ogólnie przyjętym paradygmatem dla miejscowej terapii genowej jest immobilizacja wektorów genowych na powierzchni wszczepionych protez11,12. Stałe implanty medyczne (stenty wewnątrznaczyniowe, oskrzelowe, urologiczne i żołądkowo-jelitowe, rozruszniki serca, sztuczne stawy, siatki chirurgiczne i ginekologiczne itp.) są stosowane rocznie u dziesiątek milionówpacjentów13. Chociaż ogólnie skuteczne, urządzenia te są podatne na powikłania, które nie są odpowiednio kontrolowane przez obecne praktyki medyczne14-17. Wszczepialne urządzenia protetyczne stanowią wyjątkową okazję, aby służyć jako platformy zastępcze dla leczenia zlokalizowaną terapią genową. Z farmakokinetycznego punktu widzenia derywatyzacja powierzchniowa implantów medycznych przy stosunkowo niskich dawkach wejściowych wektorów genowych skutkuje zarówno osiągnięciem wysokich lokalnych stężeń wektorów genowych na granicy implant/tkanka, jak i spowolnieniem kinetyki ich eliminacji z tego miejsca. W wyniku przedłużającego się pobytu i zwiększonego wychwytu przez docelową populację komórek, unieruchomienie wektora minimalizuje rozprzestrzenianie się wektora genowego. W ten sposób zmniejsza się niezamierzone inokulowanie tkanek niebędących przedmiotem zwalczania.

Powierzchniowe wiązanie wektorów genów na wszczepialnych biomateriałach (określane również jako dostarczanie genów za pośrednictwem substratu lub dostarczanie genów w fazie stałej) zostało wdrożone w hodowlach komórkowych i eksperymentach na zwierzętach przy użyciu zarówno specyficznych (antygen-przeciwciało18-20, awidyna-biotyna21,22), jak i niespecyficznychinterakcji 23-26 (ładunek, van der Waals). Kowalencyjne przyczepianie wektorów do powierzchni wszczepionego urządzenia było wcześniej uważane za niefunkcjonalne, ponieważ zbyt silne wiązania z powierzchnią uniemożliwiają internalizację wektora przez komórki docelowe. Niedawno wykazano, że ograniczenie to można przezwyciężyć poprzez zastosowanie spontanicznie hydrolizowalnego środka sieciującego stosowanego jako ogniwa łączące zmodyfikowaną metaliczną powierzchnię stentu i białek kapsydu wektora adenowirusowego27,28. Co więcej, szybkość uwalniania wektora i przebieg w czasie ekspresji transgenu in vitro i in vivo można modulować za pomocą hydrolizowalnych środków sieciujących wykazujących różną kinetykę hydrolizy28.

Niniejszy artykuł dostarcza szczegółowego protokołu odwracalnego kowalencyjnego przyłączania wektorów adenowirusowych do aktywowanej powierzchni metalu i wprowadza użyteczny zestaw eksperymentalny do badania następujących po sobie zdarzeń transdukcji in vitro w hodowanych komórkach mięśni gładkich i śródbłonka oraz in vivo w modelu angioplastyki stentowej szczura na tętnicy szyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie adenowirusa znakowanego Cy3 do eksperymentów z wydaniem

  1. Zawiesić 2 x 1012 cząstek Adpustych (około 2 x 1011 jednostek infekcyjnych) w 650 μl buforu węglanowego/wodorowęglanowego (CBB; pH 9,3).
  2. Rozpuścić zawartość 1 fiolki (0,2 mg) aminowo-reaktywnego barwnika fluorescencyjnego (Cy3(NHS)2) w 1 ml CBB do końcowego stężenia 0,2 mg/ml.
  3. Dodać 100 μl roztworu barwnika do zawiesiny wirusa, wirować przez 5 sekund i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (100-200 obr./min).
  4. Zrównoważyć 20 ml kolumny Sepharose 6B z PBS. Dodaj kroplami 750 μl zawiesiny Ad znakowanej Cy3 do środka łoża żelowego.
  5. Po przeniknięciu zawiesiny wirusa do żywicy dodać 5 ml PBS. Wyrzucić eluat.
  6. Dodać 0,5 ml PBS i zebrać eluat do oznakowanego szklanego pojemnika. Powtórz ten krok 10 razy, zbierając w sumie dziesięć frakcji o pojemności 0,5 ml.
  7. Oznaczyć pobrane frakcje za pomocą spektrofotometrii (260 i 280 nm) pod kątem zawartości DNA wirusa.
  8. Zebrać frakcje zawierające więcej niż 10% całkowitej (sumy od F1 do F10) gęstości optycznej (OD) przy długości fali 260 nm. Uwaga: Zazwyczaj frakcje F3, F4, F5 i F6 są łączone i mieszane.
  9. Ponownie oznaczyć mieszane frakcje zbiorcze za pomocą spektrofotometrii (260 i 280 nm) i testu fluorometrycznego (550ex/570em nm) odpowiednio na zawartość wirusowego DNA i białko kapsydu znakowane Cy3. Uwaga: Krzywa kalibracyjna Cy3(NHS)2 obejmująca zakres 10-9-10-13 mol/L jest przygotowywana i oznaczana fluorymetrycznie na tej samej płytce, co frakcje zbiorcze.
  10. Oblicz wydajność znakowanego wirusa i gęstość znakowania. Załóżmy, że 1,19 x 1012 cząstek wirusa/ml odpowiada 1 jednostce OD dla długości drogi 1 cm29. Użyj wzoru: Wydajność = [(OD260nm/1.19)*1012*V/ilość wejściowa AD]*100, gdzie, OD260nm to gęstość optyczna preparatu zbiorczego przy 260 nm, a V to objętość preparatu zbiorczego (ml), aby obliczyć wydajność odzysku AD (%). Użyj wzoru: Gęstość etykietowania = C * 6,02 * 1023 / (OD260 nm / 1,19) * 1012, gdzie C to stężenie Cy3 w zbiorczym preparacie (mole / ml), a OD260 nm to gęstość optyczna zbiorczego preparatu przy 260 nm, aby obliczyć średnią gęstość znakowania Cy3 . UWAGA: Typowy czas odtworzenia znakowanego wirusa wynosi >70% dawki wejściowej. Gęstość znakowania wynosi 600-800 cząsteczek fluoroforu na pojedynczą cząsteczkę wirusa.
  11. Reklama oznaczona podwielokrotnym Cy3jest pusta na mniejsze porcje (zwykle 5 x 1011 cząstek) odpowiednie do indywidualnych eksperymentów uwalniających. UWAGA: Obecny protokół określa użycie reklamy oznaczonej etykietą Cy3 wyłącznie w eksperymencie dotyczącym wersji. Wszystkie badania transdukcji są przeprowadzane z użyciem nieznakowanych wektorów.

2. Aktywacja próbek metalu

  1. Umyć kolejno krążki siatkowe ze stali nierdzewnej lub stenty ze stali nierdzewnej w izopropanolu (5 min x 2) i chloroformie (5 min x 2) w temperaturze 55 °C z wytrząsaniem (100 obr./min). Usunąć rozpuszczalnik.
  2. Ogrzewać próbki przez 30 minut w temperaturze 200 °C.
  3. Rozpuścić bisfosfonian polialliloaminy z zainstalowanymi utajonymi grupami tiolowymi (PABT27,28,30) w wodzie (1-2% w/v) w temperaturze 72 °C z wytrząsaniem (100 obr./min). Dostosuj pH do 4,5-5 za pomocą KHCO3.
  4. Próbki metalu należy inkubować w roztworze PABT przez 2-4 godziny w temperaturze 72 °C z wytrząsaniem (100-200 obr./min). UWAGA: W tym momencie procedura może zostać wstrzymana. Próbki są stabilne przez 3 dni w temperaturze 4 °C.
  5. Przepłukać próbki trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną (DDW).
  6. Próbki należy wystawić na działanie tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP; 15 mg/ml w 0,1 M buforze octowym) przez 15 minut w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (100–200 obr./min).
  7. Płukać 5x w odgazowanym DDW.
  8. Próbki należy wystawić na działanie 2% polietylenoiminy z zainstalowanymi grupami pirydylditiowe (PEIPDT27,28,30) w odgazowanym DDW w atmosferze argonu przez 2 godziny w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (100-200 obr./min). UWAGA: W tym momencie procedura może zostać wstrzymana. Próbki są stabilne przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C.
  9. Przepłukać próbki trzykrotnie DDW.
  10. Wystawić próbki na działanie 10 mg/ml ditiotreitolu/DDW w celu przekształcenia grup pirydyloditiowe w tiole.
  11. Ponownie spłukać 5x w odgazowanym DDW.

3. Aktywacja adenowirusa i unieruchomienie powierzchni metalu

  1. Zawiesić 5 x 1011 cząstek AdeGFP lub AdLuc (około 5 x10 10 jednostek infekcyjnych) w 487,5-495 μl buforu węglanowego/wodorowęglanowego (CBB; pH 9,3). Uwaga: Do badań uwalniania należy użyć 5 x 1011 pustych cząstek Ad znakowanych Cy3 (dostosuj objętość do 487,5-495 μl za pomocą CBB).
  2. Rozpuścić HC o różnym tempie hydrolizy28 [(szybko (t1/2 = 5 d), pośrednio (t1/2 = 12 d) i powoli (t1/2 = 50 d) HC, tj. RHC, IHC lub SHC; Rysunek 1] lub niehydrolizowalny środek sieciujący (NHC), sulfo-LC-SPDP w CBB przy 20 mM.
  3. Natychmiast dodać 5-12,5 μl roztworu środka sieciującego do zawiesiny wirusa o całkowitej objętości 500 μl (200-500 μM końcowe stężenie środka sieciującego), wirować i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (100-200 obr./min).
  4. Zrównoważyć 20 ml kolumny Sepharose 6B z odgazowanym 5 mM EDTA/PBS (EPBS). Dodaj kroplami 500 μl zawiesiny Ad modyfikowanej środkiem sieciującym do środka złoża żywicy.
  5. Dodać 5 ml odgazowanego EPBS. Wyrzucić eluat.
  6. Dodać 0,5 ml odgazowanego EPBS i zebrać eluat do oznakowanego szklanego pojemnika. Powtórz ten krok 10 razy, zbierając w sumie dziesięć frakcji o pojemności 0,5 ml.
  7. Oznaczyć OD zebranych frakcji za pomocą spektrofotometrii przy 260 i 280 nm i przeliczyć OD na miana wirusów (1,19 x 1012/ml odpowiada 1 OD)29.
  8. Zebrać frakcje zawierające >10% eluowanego wirusa (Uwaga: Zazwyczaj są to frakcje F3-F6). Powtórzyć spektrofotometryczny test miana dla zbiorczej zawiesiny.
  9. Przenieść zawiesinę wirusa do fiolki z próbkami aktywowanego metalu (jak w ppkt 2.11). Inkubować w atmosferze argonu przez 1 godzinę w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (100-200 obr./min). Uwaga: Próbki metalu na uwięzi uzyskane na tym etapie są dalej wykorzystywane w późniejszych eksperymentach uwalniania i transdukcji opisanych w sekcjach 5-7 protokołu.

4. Kwantyfikacja wektora reklamowego związanego z powierzchnią za pomocą PCR

  1. Przygotować siatki utworzone z unieruchomionego powierzchniowo AdeGFP na uwięzi przez NHC, SHC, IHC i RHC (n=3 dla każdego typu), jak opisano w sekcjach 2 i 3.
  2. Użyj zestawu QIAamp DNA Micro do wyizolowania wirusowego DNA. Umieść siatki pojedynczo w plastikowych probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 200 μl mieszaniny złożonej ze 180 μl buforu ATL i 20 μl proteinazy K (obie z zestawu). Dodać znaną ilość cząstek AdeGFP (jako wzorce krzywej kalibracyjnej) do oddzielnych probówek zawierających tę samą mieszaninę. Inkubować w temperaturze 56 °C przez noc bez wstrząsania.
  3. Dodać 200 μl buforu AL (z zestawu), wymieszać przez wirowanie, dodać 200 μl 100% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  4. Przenieść mieszaninę z każdej probówki do pojedynczej kolumny MinElite (z zestawu) i wirować z prędkością 8 000 obr./min przez 1 min. Przepłukać probówki zawierające siatkę 180 μl świeżego buforu ALT, dodać do odpowiednich kolumn i wirować z prędkością 8 000 obr./min przez 1 min. Wyrzucić eluaty.
  5. Dodać 500 μl buforu AW1 (z zestawu) do kolumn i wirować z prędkością 8 000 obr./min przez 1 min. Wyrzuć eluaty.
  6. Dodaj 500 μl bufora AW2 (z zestawu) do kolumn i wiruj z prędkością 8 000 obr./min przez 1 min.
  7. Wyrzuć eluaty.
  8. Wiruj z prędkością 14 000 obr./min przez dodatkowe 3 minuty, aż kolumny całkowicie wyschną. Wyrzuć eluaty.
  9. Do kolumn dodać 50 μl wody klasy MilliQ. Wiruj z prędkością 14 000 obr./min przez 5 minut. Zebrać 50 μl eluatu z każdej kolumny do indywidualnej probówki zbiorczej (z zestawu).
  10. Przygotuj roztwór PCR Master Mix, łącząc wielokrotności następujących składników (12,5 μl Power Sybr Green PCR Master Mix, 0,63 μl 10 μM eGFP sense primer [5'- ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3'], 0,63 μl 10 μM eGFP anti-sense primer [5'- AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3'], 6,3 μl wody klasy MilliQ). Pomnóż te objętości przez liczbę planowanych reakcji, w tym kontroli "bez DNA".
  11. Załaduj 5 μl DNA AdeGFP (z kroku 4.8) i 20 μl PCR Master Mix do potrójnych dołków 96-dołkowej płytki reakcyjnej MicroAmp Optical. Uszczelnij płytkę za pomocą optycznej folii samoprzylepnej MicroAmp. Obracaj płytkę z prędkością 1,000 obr./min przez 1 minutę, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
  12. Umieść płytkę w pojemniku silnika 7500 Real-Time PCR. W menu głównym oprogramowania SDS systemu 7500 (wersja 1.4 lub nowsza) wybierz opcję "Utwórz nowy eksperyment". Kliknij "Dalej". Na ekranie "Kreator nowego eksperymentu" wybierz Sybr Green z przewijanego menu i kliknij "dodaj". Kliknij "dalej", aby uzyskać układ płyty. Zaznacz wszystkie studzienki do analizy, wybierz Sybr Green. Zaznacz kolejno dołki bez kontroli DNA, standardy DNA AdeGFP i nieznane, a następnie zaznacz je odpowiednimi oznaczeniami z menu rozwijanego.
  13. Przejdź do zakładki instrumentu. Wybierz "dodaj fazę dysocjacji", zmień objętość studzienki z domyślnych 50 μl na 25 μl. Kliknij start.
  14. Analizuj wyniki PCR za pomocą po sprawdzeniu podsumowania kontroli jakości pod kątem wartości odstających i innych nieprawidłowości.

5. Kinetyka uwalniania hydrolizowalnych cząstek wektorowych usieciowanych metodą sieciowania z siatki stalowej modelu

  1. Przemyć próbki siatki derywatyzowane AD znakowanym Cy3 przez RHC, IHC, SHC i NHC (jak w 3.9) w 1% BSA/PBS (1 godz. x 3) z wytrząsaniem (100-200 obr./min).
  2. Za pomocą sterylnych drobnych kleszczyków umieść siatki w indywidualnych dołkach 96-dołkowej płytki wstępnie wypełnionej 200 μl buforu elucyjnego (0,1% BSA/0,1% Tween-20/PBS).
  3. Wykonaj fluorescencyjne zdjęcia centralnej części każdej siatki. Zapisz ustawienia mikroskopu i kamery CCD używanej do pozyskiwania obrazu.
  4. Oznaczyć płytkę fluorymetrycznie (550ex/570em) w trybie skanowania studni z maksymalną redukcją. Użyj studzienek z niederywatyzowanymi siatkami jako kontrolki tła.
  5. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, wytrząsając (50 obr./min).
  6. W określonych porach (zakres 1-30 dni) zasysać bufor elucyjny bez naruszania oczek i dodać 200 μl świeżego buforu elucyjnego. Powtórz kroki 4.3-4.5 po wymianie bufora.

6. Transdukcja hodowanych komórek za pomocą wektorów reklamowych immobilizowanych siatką

  1. Umyć siatki derywatyzowane AdeGFP lub AdLuc trzykrotnie sterylnym PBS przez 5 minut z wytrząsaniem (100 obr./min).
  2. Za pomocą cienkich sterylnych kleszczy usuń krążki siatkowe jeden po drugim i pojedynczo umieść je w dołkach 96-dołkowej płytki z interesującym typem komórki w logarytmicznej fazie wzrostu.
  3. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 .
  4. Użyć odpowiedniego testu nieterminalnego punktu końcowego (mikroskopia fluorescencyjna, fluorometria dla eGFP lub obrazowanie bioluminescencyjne dla lucyferazy) w celu określenia zakresu i przestrzennego rozkładu ekspresji genów w studzienkach.
  5. Opcjonalnie należy zastąpić pożywkę PBS w celu zwiększenia czułości testu fluorometrycznego (485/535 nm), jeśli spodziewana jest niska ekspresja eGFP. Uwaga: Jeśli fluorometr jest wyposażony w funkcję skanowania studni, odczytaj płytkę w trybie skanowania studni, aby ocenić rozkład przestrzenny komórek wykazujących ekspresję eGFP w studzienkach. Wymień PBS na pożywkę po zakończeniu fluorometrii.
  6. Zobrazuj transdukowane komórki w studzienkach za pomocą siatek eluujących AdeGFP (zarówno pod siatką, jak i na zewnątrz siatki) za pomocą zestawu filtrów FITC. Rób reprezentatywne zdjęcia w powiększeniu 40-200X. Zapisz dokładne ustawienia mikroskopu fluorescencyjnego i kamery CCD używanej do pozyskiwania obrazów.
  7. Dodać 5 μl lucyferyny w PBS (10 mg/ml) bezpośrednio do studzienek z siatkami uwalniającymi AdLuc do końcowego stężenia 500 μg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 minut przed obrazowaniem bioluminescencyjnym. Odessać pożywkę i zastąpić pożywką wolną od lucyferyny po obrazowaniu.
  8. Powtórz testy końcowe w określonym czasie (do 2 tygodni) w celu zbadania kinetyki ekspresji genu reporterowego po transferze genów za pośrednictwem substratu.

7. Walidacja zachowanej zdolności transdukcji w opóźnionych punktach czasowych

  1. Przygotować siatki derywatyzowane AdeGFP przy użyciu RHC, IHC, SHC i NHC do wiązania wektorów (zgodnie z 2.1-2.11 i 3.1-3.9) i indywidualnie umieścić siatki w dołkach 96-dołkowej płytki z 60-80% zlewających się komórek śródbłonka aorty bydlęcej (BAEC).
  2. Przeanalizować transdukcję hodowanego BAEC za pomocą AdeGFP unieruchomionego siatką po 1 i 2 dniach od umieszczenia siatki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i fluorometrii (jak w 6,4-6,5).
  3. Po 48 godzinach od rozpoczęcia transdukcji należy dwukrotnie przemyć studzienki zawierające siatkę PBS.
  4. Dodać 200 μl 0,25% trypsyny/EDTA do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (100 obr./min). Umyj 3x PBS.
  5. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej i fluorometrii, aby upewnić się, że wszystkie komórki eGFP są dodatnie i są związane z siatkami.
  6. Wysiew świeżo pasażowany BAEC do dołków z częściowo uwolnionymi oczkami przy początkowej gęstości wysiewu 60-80% (2-2,7 x 104 komórki/dołek).
  7. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez z góry określony czas (1-10 dni) przed oceną "nowych" zdarzeń transdukcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i fluorometrii.

8. Rozmieszczenie stentów adeluujących w modelu angioplastyki stentów u szczurów

  1. Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym protokole są zgodne z przepisami federalnymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez IACUC Szpitala Dziecięcego w Filadelfii. Aby zachować aseptyczne warunki chirurgiczne, wszystkie narzędzia są sterylizowane w autoklawie. Aby zapewnić ciągłą sterylność, sterylizator perełkowy jest stosowany pomiędzy użyciem narzędzi u maksymalnie pięciu kolejnych zwierząt.
  2. Przygotować stenty uwalniające AdLuc zgodnie z ppkt 2.1-2.11 i 3.1-3.9. Stenty derywatyzowane wirusem należy przechowywać w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny przed użyciem.
  3. Samce szczurów Sprague-Dawley (400-450 g) należy znieczulić wstrzyknięciem ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg). Określ głębokość znieczulenia na podstawie reakcji uszczypnięcia łapy i tonusa mięśniowego. Zastosuj maść okulistyczną weterynarza, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i twardówki. Uwaga: Znieczulenie wziewne odpowiednio 4% i 2% izofluranem (1 l/min) do wywołania i utrzymania znieczulenia jest możliwe, ale utrudnia swobodny dostęp do okolicy szyi zwierzęcia i dlatego nie jest zalecane dla niedoświadczonego użytkownika.
  4. Ponownie oceń głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi. Gol się i asepcie przygotuj szyję i górną część klatki piersiowej. Podawać antybiotyk (cefazolina; 20 mg/kg; IM), przeciwbólowe (meloksykam; 0,5 mg/kg; SC) i sól fizjologiczną (10 ml/kg; SC). Cewnikować żyłę ogonową za pomocą cewnika 24 G i podać heparynę (200 j.m./kg; IV). Uwaga: Zamiast cefazoliny można stosować dawkę 10 mg/kg (IM) enrofloksacyny (Baytril). Unikaj stosowania antybiotyków, które nie wykazują znaczącej aktywności przeciwko bakteriom Gram-dodatnim. 10-15 mg/kg karprofenu (Rimadyl) może być stosowany zamiast meloksykamu jako prewencyjny środek przeciwbólowy. Należy unikać narkotycznych leków przeciwbólowych (np. morfiny, buprenorfiny) ze względu na ich właściwości hamujące oddychanie.
  5. Wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę i powięź szyi. Użyj technik preparowania, aby wyizolować lewą tętnicę szyjną zewnętrzną. Przywiąż tętnicę szyjną zewnętrzną w najbardziej dystalnym dostępnym miejscu. Zastosuj przesuwaną tymczasową ligaturę do początku tętnicy szyjnej wewnętrznej.
  6. Wykonać 2-milimetrowe nacięcie arteriotomii w lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej.
  7. Wprowadzić 2-francuski cewnik Fogarty'ego do wspólnej tętnicy szyjnej przez nacięcie w tętnicy szyjnej zewnętrznej. Napompuj końcówkę cewnika solą fizjologiczną i przeprowadź 3x od łuku aorty do rozwidlenia tętnicy szyjnej w celu usunięcia śródbłonka.
  8. Nasuń kawałek rurki (1,04 mm średnicy zewnętrznej, 0,99 mm średnica wewnętrzna) przez cewnik Fogarty'ego i do wspólnej tętnicy szyjnej. Wycofać cewnik Fogarty'ego.
  9. Zamontuj i zaciśnij stent derywatyzowany AdLuc na balonie cewnika do angioplastyki o średnicy 1,5 mm. Przełóż stent przez rurkę teflonową i wsuń go do środkowego odcinka wspólnej tętnicy szyjnej. Należy unikać pocierania stentu o ścianę rurki lub naczynia.
  10. Umieść stent na 12 atm na 30 sekund i wyjmij cewnik do angioplastyki.
  11. Przywiąż tętnicę szyjną zewnętrzną proksymalnie do miejsca arteriotomii i zwolnij tymczasowe więzadło na tętnicy szyjnej wewnętrznej.
  12. Napraw ranę operacyjną warstwami za pomocą szwy Vicryl 4.0 i zszyj skórę.
  13. Zwierzę należy odzyskać na podkładce rozgrzewającej do czasu rozpoczęcia ruchu i powrotu do odizolowanej klatki. Chociaż zwierzęta pooperacyjne zwykle nie wykazują żadnych oznak bólu lub dyskomfortu po upływie pierwszych 12 godzin po zabiegu, należy rozważyć przedłużenie terapii meloksykamem (0,5 mg/kg mc. dziennie) na 72 godziny.

9. Obrazowanie bioluminescencyjne ekspresji genów tętniczych

  1. W określonych z góry punktach czasowych (zakres od 1 dnia do 3 tygodni) po umieszczeniu stentu uwalniającego geny w tętnicy szyjnej wspólnej, znieczulij szczura za pomocą znieczulenia wziewnego izofluranem (2-4% izofluranu w tlenie).
  2. Usuń zszywki chirurgiczne, aseptycznie przygotuj miejsce i ponownie otwórz ranę operacyjną. Za pomocą sekcji odzyskaj dostęp do lewej tętnicy szyjnej wspólnej i oddziel ją od nerwu błędnego i sąsiedniej tkanki łącznej.
  3. Przygotuj mieszaninę 50 mg/ml lucyferyny w PBS i 25% Pluronic F-127 w PBS (1:4 v/v) i przechowuj ją na lodzie. Uwaga: Ten preparat występuje jako lepki roztwór w temperaturze 4 °C i natychmiast zamienia się w żel w kontakcie z tkanką w temperaturze 37 °C.
  4. Nanieść 200 μl schłodzonej mieszaniny lucyferyny/pluronu bezpośrednio na odsłonięty odcinek tętnicy szyjnej wspólnej i sprawdzić twardość żelu.
  5. Umieścić zwierzę w pozycji leżącej w komorze obrazowania aparatu IVIS-Spectrum i utrzymać znieczulenie izofluranem za pomocą maski na twarz.
  6. W oknie panelu sterowania akwizycją (Living Image, wersja 4.2 lub nowsza) wybierz pozycję "B" (odległość kamery do obiektu 6,6 cm) i współczynnik kategoryzacji "średni" z menu rozwijanych zatytułowanych odpowiednio "pole widzenia" i "binning". Wpisz "2,5 cm" w polu wysokości tematu. Wybierz "min" jako jednostkę czasu w polu "czas ekspozycji" i wybierz wartość liczbową "2".
  7. Trzy minuty po zastosowaniu żelu Luciferin/Pluronic rozpocznij akwizycję obrazu, klikając przycisk "Pobierz" na ekranie. UWAGA: Czas akwizycji obrazu może wynosić od 1 do 6 minut w zależności od przewidywanej siły sygnału.
  8. Po uzyskaniu obrazu zmyj żel solą fizjologiczną i przetrzyj przestrzeń okołotętniczą sterylną gazą i bawełnianymi aplikatorami.
  9. Zamknij ranę szwem Vicryl i zszyj skórę.
  10. Odzyskaj zwierzę i wróć do jego klatki. Powtórz obrazowanie w późniejszych punktach czasowych, aby zbadać przebieg w czasie ekspresji tętniczej wywołanej przez unieruchomione stentem wektory AD.
  11. Alternatywnie, należy wykonać obrazowanie po ogólnoustrojowym podaniu lucyferyny. Znieczulić i przygotować zwierzę zgodnie z ppkt 9.1-9.2. Cewnikować żyłę ogonową za pomocą cewnika 24 G i zabezpieczyć cewnik taśmą chirurgiczną.
  12. Przygotować roztwór lucyferyny w PBS (50 mg/ml) i wstrzyknąć 1 ml roztworu przez cewnik w odstępie 10 sekund. Minutę po wstrzyknięciu rozpocznij akwizycję obrazu zgodnie z 9.7-9.8. Uwaga: Większa szybkość wstrzykiwania (<10 s) może wywołać napady padaczkowe i zatrzymanie oddechu. Zwierzę musi zostać poddane eutanazji, jeśli podczas obrazowania wystąpią drgawki lub zatrzymanie oddechu.
  13. Wykonaj krok 9.10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperymenty dotyczące uwalniania wektora

Przytwierdzanie wektorów adenowirusowych do powierzchni implantów, w tym urządzeń interwencyjnych, takich jak stenty naczyniowe, pozwala na zbliżenie wektora do miejsca występowania choroby, co częściowo niweluje brak fizycznego ukierunkowania wektorów. Aby jednak uzyskać efekty terapeutyczne poprzez transdukcję tkanki docelowej, wektor musi zostać uwolniony z powierzchni (Rysunek 2). Postawiono hipotezę, że zastosowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół opisuje operacyjną metodę dostarczania genów za pośrednictwem substratu, osiąganą poprzez odwracalne przyłączanie wektorów adenowirusowych do bezpowłokowych powierzchni ze stali nierdzewnej. Chociaż technika ta została opracowana w konkretnym celu terapii genowej restenozy naczyniowej opartej na stentach, ma znacznie szersze zastosowanie w dziedzinie biomateriałów, implantów biomedycznych i terapii genowej.

Chociaż w prezentowanych badaniach wykorzystano wyłącznie stal n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Opracowanie protokołu i badania przedstawione w tym artykule były częściowo wspierane przez granty American Heart Association Scientist Development (IF. 0735110N i MC 10SDG4020003), grant amerykańskiego National Heart, Lung, and Blood Institute HL 72108 (R.J.L.) oraz U.S. National Heart, Lung, and Blood Institute T32 007915 (S.P.F.). Cewniki do angioplastyki zostały podarowane przez NuMED (Hopkinton, NY). Autorzy pragną podziękować za pomoc sekretarską Pani Susan Kerns.

Podziękowania

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dyski siatkowe ze stali nierdzewnej 316Electon Microscopy SciencesE200-SS
Ogólne stenty ze stali nierdzewnej klasy 304Laseragena zamówienie
AdeGFPUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV0504
AdLucUniversity of Pennsylvania Vector CoreAD-5-PV1028
AdEMPTYUniversity of Pennsylvania Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV 96-dołkowe płytkiCostar3635
Fluorometria 96-dołkowe płytkiCostar3915
Hodowla komórkowa 96-dołkowe płytkiFalcon353072
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Ditiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
Urządzenia molekularne SpectraMax 190
SpektrofluorometrUrządzenia molekularneSpectraMax Gemini EM
Inkubator z wytrząsarką orbitalnąVWR1575R
Piec z poziomym przepływem powietrzaWirówka Shel Lab1350 FM
Centra-CL2 Międzynarodowa firma sprzętowa426
Cyfrowy mieszalnik wirowyFisher Thermo Scientific02-215-370
Mikroskop fluorescencyjny Eclipse TE300Nikon Kamera CCD TE300
DC 500 System PCRLeicaDC-500
7500Applied Biosystemsniedostępne
IVIS Stacja bioluminescencyjnaSpectrum Perkins-Elmerniedostępna
Sól dipotasowa EDTASigma-AldrichED2P
Surowica bydlęca frakcja albuminy V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Kleszcze DumontFine Science Tools11255-20
Linia komórkowa A10 ATCCCRL-1476
Komórki śródbłonka aorty bydlęcejLonzaBW-6002
Lucyferyna, sól potasowaZłotoBiotechnologia LUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS bez wapnia i magnezuGibco14190-136
Płodowa surowica bydlęcaGemini Bio-Products100-106
Roztwór penicyliny/streptomycynyGibco11540-122
DMEM, wysoka glukozaCorning cellgro10-013-CV
0,25% Trypsyna/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA micro kitQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
MicroAmp Opyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepnaApplied Biosystems4360954
Cephazolin Apotexniedostępny
Loxicom (Meloksykam)Norbrookniedostępny
Heparyna sodowaAPP Farmaceutykiniedostępne
Ketavet (Ketamina)VEDCOniedostępne
Anased (Ksylazyna) Lloidniedostępny
Foran (Isoflurane) Baxterniedostępny
Zakrzywione kleszczyki do tęczówki MoriaNarzędzia do nauki precyzyjnej11370-31
Zakrzywione, bardzo cienkie kleszcze GraefeNarzędzia do nauki precyzyjnej11152-10
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki o nauce11252-20
Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia do nauki o naprawie15018-10
Precyzyjne nożyczki - ToughCutFine Science Tools14058-09
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14101-14
Szew Vicryl (5-0)EthiconJ385
Nić do szwów (jedwab 4/0) Fine Science Tools18020-40
Klipsy do szwów MichelFine Science Tools12040-02
Rozszerzacz ran (wziernik oka Lancaster)KLS Martin34-149-07
Sterylizator gorących kulekFine Science Tools18000-45
Aplikator do spinek do szwów MichelFine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV cewnikBeckton-Dickinson381412
2F Cewnik FogartyEdwards Lifesciences120602F
Rurka teflonowaVention041100BST
Cewnik PTANuMedna zamówienie
GazikiKendall Healthcare9024
Aplikatory bawełnianeSolon ManufacturingWOD1003
Saline Baxter281321
10 ml (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
ml (Luer-Lok)309628Beckton-Dickinson
z ostrzem #40Oster 78005-314
Taśma chirurgiczna Transpore3MMM 15271
Maść weterynaryjna PuralubePharmadermniedostępna
niestandardowe Spektrofotometr w czasie rzeczywistym plastycznej Strzykawka Strzykawka 1 Maszynki do strzyżenia

Bibliografia

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stenty metalowestenty uwalniaj ce genyobrazowanie bioluminescencyjneszczury Sprague Dawleywsp lna t tnica szyjnachromatografia elowacz stki reaktywne wobec grup tiolowych
Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.