Zaburzenia metaboliczne należą do najczęstszych chorób u ludzi. Genetycznie podatny organizm modelowy D. melanogaster może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów regulujących metabolizm. W artykule opisano stosunkowo prostą metodę, która pozwala na badanie tempa przemiany materii u much poprzez pomiar ich produkcji CO2 .
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar tempa przemiany materii u Drosophila za pomocą respirometrii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zaburzenia metaboliczne są częstym problemem wpływającym na ludzkie zdrowie. Dlatego zrozumienie mechanizmów regulujących metabolizm jest kluczowym zadaniem naukowym. Wiele genów wywołujących choroby u ludzi ma homolog muchy, co czyni Drosophila dobrym modelem do badania szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozwój różnych zaburzeń. Ponadto podatność Drosophila upraszcza genetyczne badania przesiewowe, aby pomóc w identyfikacji nowych celów terapeutycznych, które mogą regulować metabolizm. Aby wykonać takie badanie, konieczna jest prosta i szybka metoda identyfikacji zmian w stanie metabolicznym much. Ogólnie rzecz biorąc, produkcja dwutlenku węgla jest dobrym wskaźnikiem utleniania substratu i wydatku energetycznego, dostarczającym informacji o stanie metabolicznym. W tym protokole wprowadzamy prostą metodę pomiaru wydzielania CO2 przez muchy. Technika ta może potencjalnie pomóc w identyfikacji zaburzeń genetycznych wpływających na tempo metabolizmu.
Wprowadzenie
Biochemiczny cykl Kreba generuje ATP poprzez utlenianie octanu pochodzącego z węglowodanów, tłuszczów i białek wytwarzających CO2. U Drosophila wejścieO2 jest bezpośrednio skorelowane z wyjściem CO2 i odzwierciedla poziom metabolizmu1. Tak więc pomiar emisji CO2 został z powodzeniem wykorzystany w badaniach związanych ze starzeniem się i metabolizmem2-5. W tym przypadku nasze laboratorium zmodyfikowało wcześniej zaprojektowane układy eksperymentalne, umożliwiając pomiar produkcji CO2 w maksymalnie osiemnastu próbkach bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Inni i my wcześniej używaliśmy tej metody, aby pokazać różnice w tempie metabolizmu u muszek, które mają niedobór białka związanego z dystrofią mięśniową, Dystroglikanu (Dg)6-8.
O2 używane do metabolizmu oksydacyjnego jest przekształcane w CO2, który jest wydalany jako odpad oddechowy. Opisano konstrukcję ręcznie wykonanych respirometrów, która pozwala na określenie dawki zużytegoO2. Muchy umieszcza się w szczelnie zamkniętym pojemniku z substancją, która pochłania wydalany CO2 , skutecznie eliminując go z fazy gazowej. Zmiana objętości gazu (obniżone ciśnienie) jest mierzona przez przemieszczenie płynu w szklanej kapilarze przymocowanej do zamkniętego respirometru.
Główną przewagą tej techniki nad innymi jest koszt. Wcześniejsze badania mierzyły wytwarzanie CO2 przez Drosophila przy użyciu analizatorów gazów i zaawansowanych technicznie systemów respirometrycznych1,9. Pomimo bardziej złożonego sprzętu, czułość opisanej tutaj metody jest zbliżona do podanych wartości (tabela 1). Ponadto kilka innych grup wykorzystało warianty tej techniki do określenia względnego tempa metabolizmu u Drosophila4-6. Dlatego test ten może być wykorzystany do wygenerowania wiarygodnych, powtarzalnych danych istotnych dla metabolizmu Drosophila bez zakupu specjalistycznego sprzętu, który można ustawić w dowolnym laboratorium i można go wykorzystać do celów edukacyjnych.
Ogólnie rzecz biorąc, akceptowane techniki określania metabolizmu organizmu to pomiar wyprodukowanego CO2, zużytego O2 lub obutych 3,4,9. Chociaż można założyć, że jeden równoważnik O2 generuje jeden ekwiwalent CO2 , dokładny stosunek wytworzonego CO2 zależy od zastosowanego substratu metabolicznego10. Tak więc, aby dokładnie określić tempo przemiany materii w jednostkach energii, konieczne jest zmierzenie zarówno zużytegoO2, jak i wyprodukowanegoCO2. Z tego powodu opisana tutaj metoda jest szczególnie istotna dla porównywania różnic w produkcji CO2 między zwierzętami, a nie wartości bezwzględnej. Nasza technika integruje produkcję CO2 u wielu zwierząt w okresie czasu (1-2 godziny), a zatem zwraca średnią z aktywności zwierząt. Jeżeli istnieją powody, aby sądzić, że zwierzęta doświadczalne są mniej aktywne niż zwierzęta kontrolne, pomiar może odzwierciedlać różne poziomy aktywności, a niekoniecznie metabolizm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie respirometrów
- Odciąć końcówkę pipety 1 000 μl żyletką, aby umożliwić włożenie kapilarnej mikropipety 50 μl, starając się uzyskać jak najbardziej proste cięcie końcówki pipety.
- Włożyć kawałek pianki do pipety i docisnąć go wewnątrz końcówki pipety.
- Dodać niewielką ilość absorbenta CO2 i zabezpieczyć go drugim kawałkiem pianki.
- Nałożyć klej w miejscu, w którym mikropipeta jest wkładana do końcówki pipety.
- Pozostawić respirometr na noc, aby klej mógł wyschnąć.
Schemat respirometru przedstawiono na Rysunku 1A.
2. Przygotowanie komory pomiarowej
- Przygotować roztwór do komory, mieszając wodę z eozyną w proporcji, która zapewni widoczne zabarwienie.
- Wlać roztwór eozyny z wodą do komory.
- Oznaczyć jedną z boków komory za pomocą skali centymetrowej.
3. Umieszczanie much w respirometrach
- Oznakuj poszczególne respirometry za pomocą markera.
- Zanurz muchy w anestetyku metodą alternatywną do CO2 i umieść 3-5 much wybranego genotypu w każdym respirometrze.
- Szczelnie zamknij górną część respirometrów za pomocą plasteliny.
- Pozostaw muchy na około 15 min, aby doszły do siebie po anestezji.
- Przygotuj jeden respirometr bez much, który będzie służył jako kontrola atmosferyczna.
4. Przeprowadzenie eksperymentu
- Zawieś respirometry w komorze, mocując na górze komory uchwyt do probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml, otwarty od góry i od dołu.
- Wsuń respirometry końcówkami mikropipet skierowanymi w dół do wnętrza komory, tak aby końcówki zanurzyły się w kolorowym roztworze.
- Nałóż wazelinę między pokrywę a komorę, aby zapewnić lepszą izolację od wahań temperatury i ciśnienia.
- Zamknij pokrywę i odczekaj 15 min, aż system osiągnie stan równowagi.
- Wykonaj zdjęcie komory, upewniając się, że poziom cieczy w każdej mikropipecie oraz skala są widoczne (patrz przykład przedstawiony na Ryc. 1B).
- Po 1-2 h wykonaj kolejne zdjęcie.
- Po zakończeniu eksperymentu wyjmij muchy z respirometrów i zważ je, jeśli jest to wymagane, lub przenieś je z powrotem do fiolki w razie potrzeby dalszych analiz.
5. Analiza wyników
- Otwórz pozyskane obrazy w programie ImageJ11.
- Ustaw skalowanie pikseli w programie, korzystając ze skali znajdującej się na każdym zdjęciu.
- Zmierz odległość (Δd), jaką przebyła ciecz od wyznaczonego punktu odniesienia na obrazach wykonanych na początku (d1) i na końcu eksperymentu (d2). Schematyczny przykład przedstawiono na Rysunku 1C.
- Oblicz ilość wytworzonego CO2 (µl/hr/fly) za pomocą wzoru:
R= promień probówki mikropipety w centymetrach
Δd= odległość, o jaką ciecz przesunęła się w górę mikropipety w próbkach testowych, mierzona w centymetrach
Δc= odległość, o jaką ciecz przesunęła się w górę mikropipety w próbce kontrolnej ujemnej (bez much)
n = liczba użytych much
h= godziny
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby wykazać czułość metody, zmierzono produkcję CO2 u samców much typu dzikiego (Oregon R) w temperaturach 18, 25 i 29 °C oraz u much z mutacją Dg. Muchy hodowano w temperaturze 25 °C, a następnie przeniesiono do temperatury eksperymentalnej na 5 dni przed pomiarem. Zgodnie z oczekiwaniami dla tego gatunku ektotermicznego, ilość produkowanego CO2 wzrastała wraz z temperaturą (Rycina 2). Wykazaliśmy wcześniej, że dieta bezcukrowa obniża tempo metabolizmu zarówno u...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole opisujemy niedrogą i niezawodną metodę pomiaru produkcji CO2 u much. Odkryliśmy, że ten eksperyment jest łatwy, szybki do przeprowadzenia i generuje powtarzalne dane, które są zgodne z innymi badaniami 1,6,9. Przedstawiony tutaj protokół można łatwo zmodyfikować, aby dopasować go do budżetu każdego laboratorium i dostępnych materiałów. Konstrukcja każdego respirometru z osobna może być dostosowana, o ile komora pozostaje szczelna. Jednak dł...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Towarzystwu Maxa-Plancka za finansowanie naszych badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BlauBrand IntraMark 50 & l mikropipety | VWR | 612-1413 | |
| Soda Wapno | Wako | CDN6847 | |
| Eozyna | Sigma | 031M4359 | Można użyć dowolnego barwnika, który może spowodować widoczne zabarwienie cieczy |
| Komora rozwijająca do chromatorgafii cienkowarstwowej (TLC) | VWR | 21432-761 | Dowolna przezroczysta szklana komora, którą można zamknąć pokrywką |
| Znieczulacz, zestaw Lull-A-Fly | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml końcówki do pipet | Dowolna | ||
| Pianka | : Dowolna | ||
| szpachlówka | Dowolny | ||
| skalpel | Dowolna | ||
| pęseta | , Dowolna |
Bibliografia
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Wskaźnik metaboliczny Drosophilapomiar CO2 metodą respirometrycznąprodukcja dwutlenku węglakonfiguracja respirometru dla muchmetoda komory chromatograficznejanaliza w programie Image Jabsorpcja sodowym wapnemprzygotowanie roztworu eozynygenetyczny screening metabolicznyporównanie stanu metabolicznego
