Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę generowania i oczyszczania dzikich i zmutowanych wersji ludzkiego kompleksu przebudowującego chromatynę INO80. Oznakowane epitopami wersje podjednostek INO80 ulegają stabilnej ekspresji w komórkach HEK293, a kompletne kompleksy i kompleksy pozbawione określonych zestawów podjednostek są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa immunologicznego.

Streszczenie

Kompleksy przebudowujące chromatynę INO80 regulują dynamikę nukleosomów i dostępność DNA poprzez katalizowanie zależnej od ATP przebudowy nukleosomów. Ludzkie kompleksy INO80 składają się z 14 podjednostek białkowych, w tym Ino80, ATPazy podobnej do SNF2, która służy zarówno jako podjednostka katalityczna, jak i rusztowanie do składania kompleksów. Funkcje innych podjednostek i mechanizmy, za pomocą których przyczyniają się one do aktywności remodelującej chromatynę kompleksu INO80, pozostają słabo poznane, częściowo ze względu na wyzwanie generowania podzespołów INO80 w komórkach ludzkich lub heterologicznych systemach ekspresji. Ten protokół JOVE opisuje procedurę, która umożliwia oczyszczanie ludzkich podkompleksów przebudowujących chromatynę INO80, które nie mają podjednostki lub podzbioru podjednostek. N-końcowe cDNA Ino80 znakowane epitopem FLAG są stabilnie wprowadzane do linii komórkowych ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) 293 za pomocą rekombinacji za pośrednictwem Flp. W przypadku, gdy podzbiór podjednostek kompleksu INO80 ma zostać usunięty, zamiast tego ulega ekspresji zmutowanych białek Ino80, które nie mają platformy potrzebnej do złożenia tych podjednostek. W przypadku, gdy pojedyncza podjednostka ma zostać uszczuplona, transfekuje siRNA ukierunkowane na tę podjednostkę do linii komórkowej HEK 293 stabilnie eksprymującej ATPazę Ino80 znakowaną FLAG. Przygotowuje się ekstrakty jądrowe i przeprowadza się immunoprecypitację flagi w celu wzbogacenia frakcji białkowych zawierających pochodne Ino80. Skład oczyszczonych podkompleksów INO80 można następnie analizować przy użyciu metod takich jak immunoblotting, barwienie srebrem i spektrometria mas. Podkompleksy INO80 i INO80 wygenerowane zgodnie z tym protokołem mogą być dalej analizowane za pomocą różnych testów biochemicznych, które są opisane w dołączonym protokole JOVE. Opisane tutaj metody można zaadaptować do badań właściwości strukturalnych i funkcjonalnych dowolnych kompleksów przebudowujących i modyfikujących chromatynę wielopodjednostkową u ssaków.

Wprowadzenie

Ewolucyjnie zachowane kompleksy przebudowujące chromatynę rodziny SNF2 są kluczowymi regulatorami organizacji chromatyny i dostępności DNA¹. Te kompleksy remodelujące zawsze zawierają centralną podjednostkę ATPazy podobną do SNF2, która w niektórych przypadkach łączy się z różnymi białkami pomocniczymi i tworzy wielopodjednostkowe zespoły makromolekularne. Aby zbadać szczegóły molekularne procesu przebudowy chromatyny zależnego od ATP, ważne jest zrozumienie wkładu danych podzbiorów podjednostek i / lub struktur domenowych w aktywność kompleksów. Takie analizy wymagają zdolności do generowania wysoce oczyszczonych zmutowanych kompleksów, które nie mają określonych podjednostek białkowych lub struktur domenowych.

Poprzednie badania strukturalno-funkcyjne kompleksów remodelujących chromatynę zależne od ATP koncentrowały się głównie na systemie modelowym drożdży ze względu na wyższą podatność genomu drożdży na manipulację (zobacz na przykład odnośniki^1-4). Biorąc pod uwagę zachowanie składu i funkcjonalności podjednostek wśród ortologicznych kompleksów przebudowujących, badania struktury i funkcji kompleksów przebudowujących drożdże dostarczyły ważnych informacji na temat ich odpowiedników u wyższych eukariontów. Niemniej jednak istnieją znaczne różnice specyficzne dla gatunku między kompleksami przebudowy, wynikające z przyrostu lub utraty podjednostek specyficznych dla gatunku, zysku lub utraty domen specyficznych dla gatunku podjednostek konserwatywnych oraz zmienności sekwencji w obrębie domen konserwatywnych podjednostek. Takie różnice mogą być w zasadzie spowodowane potrzebą przystosowania się wyższych komórek eukariotycznych do nowych środowisk molekularnych i komórkowych. Tak więc zrozumienie, w jaki sposób podjednostki wyższych eukariotycznych kompleksów remodelujących przyczyniają się do procesu przebudowy nukleosomów, jest cenne, ponieważ nie tylko rzuca światło na podstawowe mechanizmy procesu przebudowy chromatyny zależnej od ATP, ale także może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów, za pomocą których regulowana jest struktura chromatyny i ekspresja genów u wyższych eukariontów.

Do tej pory przeprowadzono tylko ograniczone badania strukturalne i funkcjonalne wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę u ssaków, częściowo ze względu na trudności w uzyskaniu biochemicznie zdefiniowanych kompleksów i podkompleksów przebudowujących chromatynę. Częściowo ominęliśmy te trudności za pomocą procedur opisanych poniżej, w których oczyszczanie powinowactwa immunologicznego stosuje się do przygotowania nienaruszonych podkompleksów INO80 lub INO80 z komórek ludzkich stabilnie eksprymujących N-końcowy epitop FLAG oznaczony typem dzikim lub zmutowanymi wersjami Ino80^5-7 (Figura 1). Aby uzyskać nienaruszone kompleksy INO80 z komórek ludzkich, rekombinację za pośrednictwem Flp stosuje się do generowania transgenicznych linii komórkowych HEK293 stabilnie eksprymujących cDNA znakowane epitopem FLAG kodujące podjednostki kompleksu INO80^8-10. Ponieważ nadmierna ekspresja podjednostek INO80 może być nieco toksyczna, konieczne jest wyizolowanie i utrzymanie klonalnych linii komórkowych w selektywnych warunkach, aby zapewnić stabilną ekspresję transgenu podczas wielu pasaży potrzebnych do ekspansji hodowli komórkowych na dużą skalę. Aby uzyskać mniejsze podkompleksy INO80, które zawierają tylko podzbiór podjednostek, z powodzeniem zastosowaliśmy dwa podejścia (Rysunek 2A,B). W pierwszym generujemy linie komórkowe HEK293 Flp-In stabilnie eksprymujące zmutowane wersje Ino80, które nie mają domen wymaganych do interakcji z określonymi podjednostkami⁵. Alternatywnie, knockdown za pośrednictwem siRNA jest stosowany do zubożenia pożądanej podjednostki z komórek wyrażających odpowiednią podjednostkę INO80 oznaczoną FLAG (dane niepublikowane). Wreszcie, w celu oczyszczenia ludzkich kompleksów INO80, chromatografię na bazie agarozy¹¹ FLAG stosuje się do wzbogacenia frakcji zawierającej INO80 z ekstraktów jądrowych, skutecznie zmniejszając w ten sposób obecność zanieczyszczających białek cytozolowych w końcowej frakcji zawierającej oczyszczone podkompleksy INO80 lub INO80.

Protokół

1. Generowanie i hodowla stabilnych linii komórkowych HEK293 wykazujących ekspresję pełnowymiarowych lub zmutowanych wersji Ino80 z tagiem epitopowym FLAG lub innych podjednostek kompleksu INO80

1. Sklonuj cDNA kodujące pełną długość lub mutant ludzkiej ATPazy Ino80 lub inną podjednostkę INO80 do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA5/FRT z ramką odczytu zachowaną dla N-terminalnego znacznika epitopu FLAG.
2. Przed kontynuacją potwierdź sekwencję wstawionych cDNA za pomocą sekwencjonowania DNA.
3. Aby przeprowadzić transfekcję, hoduj komórki Flp-In HEK293 w 10 cm szalkach hodowlanych w pożywce zawierającej DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 5% glutaminy i 10% FBS (płodowa surowica bydlęca).
4. Gdy komórki osiągną ~70% konfluencji, dodaj do każdej szalki hodowlanej mieszaninę 40 µl odczynnika do transfekcji FuGENE6, 0,5 µg odpowiedniego plazmidu ekspresyjnego pcDNA5/FRT oraz 9,5 µg pOG44, który koduje rekombinazę Flp, w całkowitej objętości 800 μl.
5. Po 48 h poddaj komórki trypsynizacji i przesiej je w stosunku 1:30 do szalek 10 cm, a następnie hoduj w DMEM z 5% glutaminą, 10% FBS i 100 µg/ml hygromycyny B przez 3-4 tygodnie. Wymieniaj pożywkę hodowlaną za każdym razem, gdy zacznie żółknąć (zazwyczaj co 3-5 dni).
6. Aby zidentyfikować pozytywne klony wykazujące najwyższy poziom ekspresji białka z tagiem FLAG, wyselekcjonuj pojedyncze kolonie oporne na hygromycynę B i przenieś je do pojedynczych dołków płytki 24-dołkowej.
   1. Po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji, zbierz komórki z każdego dołka w ~1 ml PBS i osadź poprzez wirowanie przy 1,000 x g przez 5 min.
   2. Po usunięciu nadsączu resuspenduj osad komórkowy w 60 µl buforu do próbek SDS-PAGE.
   3. Połowę resuspendowanego osadu komórkowego poddaj elektroforezie SDS-PAGE i western blottingowi w celu monitorowania ekspresji białka przynęty z tagiem FLAG; drugą połowę zachowaj do późniejszych analiz.
7. Jeśli w lizatach komórkowych nie wykryto ludzkiego białka Ino80 z tagiem FLAG, dalej powiększ początkową populację komórek klonalnych, wysiewając komórki z pojedynczych dołków płytki 24-dołkowej na 15 cm szalki hodowlane.
   1. Aby zebrać komórki z szalek 15 cm, resuspenduj niemal konfluentne komórki w lodowatym PBS i przenieś do probówki stożkowej 50 ml.
   2. Dopełnij do końcowej objętości 50 ml, dodając dodatkowy PBS.
   3. Osadź komórki przy 1,000 x g przez 5 min i usuń jak najwięcej nadsączu.
   4. Resuspenduj osad komórkowy w 1 ml buforu Lys450 (20 mM HEPES-NaOH pH 7.9, 450 mM NaCl, 0.5% TritonX-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 0.2 mM EDTA, 10% glicerolu, 1 mM DTT, 200 µM PMSF oraz 1:1,000 koktajlu inhibitorów proteaz).
      UWAGA: tutaj i w pozostałych częściach protokołu zawsze dodawaj DTT, PMSF i koktajl inhibitorów proteaz do buforów bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
   5. Przeprowadź immunoprecypitację białek z tagiem FLAG z otrzymanego lizatu całych komórek, używając 20 µl żelu agarozowego anty-FLAG, a eluaty FLAG przeanalizuj metodą western blotting. [Szczegóły procedury immunoprecypitacji znajdują się w kroku 5.]
8. Przygotuj mrożone zapasy pożądanych klonalnych linii komórkowych¹² i przechowuj je w ciekłym azocie do czasu użycia.

2. Hodowla linii komórkowych HEK293 w butelkach obrotowych

W celu wielkoskalowego przygotowania kompleksów INO80, hoduj komórki w 10 – 20 butelkach walcowych; typowa wydajność z każdej butelki walcowej wynosi ~1 ml upakowanych komórek.

1. Do każdej butelki walcowej dodać 200 ml DMEM, 5% glutaminy i 10% surowicy cielęcej, bez higromycyny B.
2. Przenieść wszystkie komórki z jednej niemal w pełni zrośniętej szalki 15 cm do każdej butelki walcowej.
3. Umieścić butelki walcowe w inkubatorze do butelek walcowych w temperaturze 37 °C i obracać z prędkością 0,2 rpm.
4. Gdy komórki osiągną ok. 70% konfluencji, odlać i usunąć pożywkę.
5. Do każdej butelki dodać ok. 50 ml lodowatego PBS. Trzymając butelki poziomo, delikatnie zamieszać ruchem okrężnym, aby poluzować monowarstwę komórek.
6. Przenieść resuspensowane komórki do plastikowych butelek stożkowych o pojemności 250 ml i umieścić na lodzie.
7. Przepłukać butelki walcowe dodatkowym PBS, przenosząc go kolejno z butelki do butelki. Gdy roztwór płuczący przestanie być przejrzysty (zazwyczaj po wypłukaniu około 5 butelek), dodać go do zawiesiny komórkowej.
8. Utrwić osad komórkowy poprzez wirowanie przy 400 x g przez 10 min.
9. Delikatnie resuspensować komórki w PBS, połączyć je w jednej stożkowej butelce 250 ml i przechowywać na lodzie do czasu dalszej obróbki.

3. siRNA-zależne wyciszenie podjednostek INO80 w komórkach wykazujących ekspresję innej podjednostki INO80 z tagiem FLAG

Aby uzyskać subkompleksy INO80 pozbawione pojedynczej podjednostki, należy zastosować immunopuryfikację z użyciem przeciwciał anty-FLAG w celu oczyszczenia kompleksów INO80 z komórek traktowanych siRNA lub komórek stabilnie eksponujących shRNA. Opisany tutaj protokół „odwróconej” transfekcji siRNA (małych interferujących RNA) jest zoptymalizowany dla komórek HEK293 hodowanych w szalkach o średnicy 15 cm. Protokół dotyczy jednej szalki 15 cm z komórkami i powinien zostać odpowiednio przeskalowany w zależności od potrzebnej liczby komórek. Aby przygotować ilości kompleksu INO80 z komórek traktowanych siRNA przydatne do badań biochemicznych, należy zwiększyć skalę do kultur hodowanych w 40 szalkach o średnicy 15 cm; pozwoli to uzyskać około 2 - 4 ml zbitego osadu komórkowego.

1. Hodować komórki HEK293 stabilnie eksponujące pożądaną podjednostkę kompleksu INO80 do osiągnięcia stanu bliskiego konfluencji w szalkach 15 cm.
2. Do probówki zawierającej liofilizowane siRNA dodać objętość buforu do resuspensji siRNA (20 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7.5 oraz 0,2 mM MgCl₂) wystarczającą do przygotowania roztworu stokowego siRNA o stężeniu 50 µM. Kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, a następnie inkubować na nutatorze przez 30 min w RT, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie siRNA.
3. Przygotować koktajl do transfekcji zawierający siRNA oraz odczyn do transfekcji. Wymieszać 10 μl roztworu stokowego siRNA 50 µM z 32 µl Lipofectamine RNAiMAX i dodać do 4 ml pożywki Opti-MEM Reduced Serum Medium, mieszając bardzo delikatnie; przed użyciem pozwolić wszystkim odczynnikom wyrównać temperaturę do RT.
4. Inkubować mieszaninę w RT przez 30 min.
5. Przygotować komórki Flp-In HEK293 stabilnie eksponujące pożądaną podjednostkę INO80 do transfekcji.
   1. Podczas inkubacji opisanej w kroku 3.4, raz wypłukać komórki w szalkach 15 cm za pomocą PBS w RT.
   2. Po usunięciu PBS potraktować komórki 1 ml trypsyny, aż zaczną odrywać się od płytki.
   3. Natychmiast dodać 10 ml pożywki kompletnej (DMEM + 5% glutaminy + 10% FBS) do trypsynizowanych komórek i delikatnie wymieszać. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 1 000 x g przez 5 min w RT.
   4. Resuspender osad komórkowy w ~4 ml pożywki kompletnej i policzyć komórki za pomocą hematocytometru.
   5. Rozcieńczyć komórki pożywką kompletną do stężenia ~5,4 x 10⁶/ml.
6. Do każdej szalki 15 cm dodać 15 ml kompletnej pożywki hodowlanej, a następnie 4 ml koktajlu do transfekcji. Delikatnie zamieszać, aby pożywka i koktajl do transfekcji zostały dokładnie wymieszane. Na koniec dodać 1 ml zawiesiny komórkowej i ponownie delikatnie zamieszać, aby równomiernie rozproszyć komórki.
7. Po 60 h hodowli w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO₂, delikatnie usunąć pożywkę, resuspender komórki w lodowatym PBS i niezwłocznie przystąpić do przygotowania ekstraktów jądrowych.

4. Przygotowanie ekstraktów jądrowych

Niniejsza procedura została zmodyfikowana na podstawie protokołu Dignama¹³ i może być skalowana w górę lub w dół w zależności od wielkości początkowych pelletów komórkowych. Zazwyczaj 1 ml upakowanego pelletu komórkowego pozwala uzyskać 1 ml końcowego ekstraktu jądrowego. Wszystkie bufory powinny być schłodzone do temperatury lodu, a wszystkie etapy należy przeprowadzać w pomieszczeniu chłodniczym lub w lodzie, jeśli odpowiednie pomieszczenie chłodnicze nie jest dostępne.

1. Izolacja jąder:
   1. Ostrożnie przenieść komórki do odpowiednio dobranej wielkością (15 lub 50 ml) stożkowej probówki z podziałką i wirować przy 1,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
   2. Usunąć nadosad, a następnie zmierzyć objętość osadu komórkowego. 1 ml osadu odpowiada ok. 3 x 10⁸ komórkom HEK293.
   3. Dodać 5 objętości osadu komórkowego Buforu A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl oraz świeżo dodane 1 mM DTT, 200 µM PMSF i koktajl inhibitorów proteaz w stosunku 1:1,000). Resuspendować osad komórkowy poprzez delikatne pipetowanie.
   4. Inkubować na lodzie przez dokładnie 10 min.
   5. Zwirować komórki przy 1,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadosad.
   6. Objętość osadu komórkowego powinna wzrosnąć do 2 razy podczas inkubacji w Buforze A.
   7. Resuspendować komórki w dwóch objętościach osadu Buforu A i przenieść zawiesinę komórkową do homogenizatora tkankowego Dounce o odpowiedniej wielkości. W przypadku objętości osadu komórkowego mniejszej niż 2 ml należy użyć homogenizatora 7 ml; dla osadu 2 - 4 ml należy użyć homogenizatora 15 ml, a dla osadu 10 ml lub więcej homogenizatora 40 ml.
   8. Homogenizować zawiesinę komórkową za pomocą LUŹNEGO szklanego tłoka homogenizatora Dounce do momentu, aż 90% komórek wykaże dodatnią reakcję z 1% błękitem trypanu.
   9. Przenieść zawiesinę do 45 ml probówki do wirowania wysokich prędkości i wirować przy 25,000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C w rotorze JA-17 lub podobnym (patrz Tabela materiałów/sprzętu).
   10. Z osadu jąder usunąć nadosad, który zawiera białka cytozolowe lub białka uciekające z jądra podczas frakcjonowania.
2. Ekstrakcja jąder solą:
   1. Dodać Bufor C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glicerolu, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA oraz świeżo dodane 1 mM DTT, 200 µM PMSF i koktajl inhibitorów proteaz w stosunku 1:1,000) do osadu jąder; użyć 2,5 ml Buforu C na każde 3 ml początkowej objętości osadu komórkowego (~1 x 10⁹ komórek).
   2. Za pomocą szklanej bagietki lub pipety oddzielić osad jąder od ścianki probówki i przenieść całą mieszaninę do homogenizatora Dounce o odpowiedniej wielkości.
   3. Resuspendować jądra, homogenizując mieszaninę dwoma ruchami LUŹNEGO tłoka.
   4. Przenieść resuspendowaną frakcję jądrową do schłodzonego zlewka. Wybrać zlewka tak, aby zawiesina wypełniła go na głębokość co najmniej 0,5 cm.
   5. Aby wyekstrahować białka jądrowe z chromatyny lub innych nierozpuszczalnych struktur, stopniowo zwiększać stężenie soli w zawiesinie do 0,42 M NaCl poprzez kroplowe dodawanie 5 M NaCl przy jednoczesnym delikatnym mieszaniu zawiesiny pipetą lub szklaną bagietką na lodzie; po dodaniu całego 5 M NaCl roztwór powinien stać się bardzo lepki lub żelowy. Obliczyć objętość 5 M NaCl potrzebną do uzyskania końcowego stężenia 0,42 M NaCl zgodnie z następującym wzorem:
      
   6. Ostrożnie przenieść lepką zawiesinę do 10 ml probówek poliwęglanowych do rotora typu 70.1 Ti (lub odpowiednika) lub do 70 ml butelek poliwęglanowych do rotora typu 45 Ti lub podobnego (patrz Tabela materiałów/sprzętu). Szczelnie zamknąć parafilmem w przypadku probówek 10 ml lub za pomocą zestawu zakrętek w przypadku butelek 70 ml.
   7. Powoli kołysać zamkniętymi probówkami w temperaturze 4 °C przez 30 min przy użyciu nutatora.
   8. Wirować próbki w rotorze typu 45 Ti lub 70.1 Ti przez 30 min przy 120,000 x g w temperaturze 4 °C.
   9. Przenieść nadosad do jednej plastikowej probówki lub butelki. Nadosad ten stanowi ekstrakt jądrowy, a osad zawiera chromatynę i inne szczątki jądrowe.
   10. Podzielić ekstrakt jądrowy na wygodne alikwoty, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Oczyszczanie immunopowinowactwem ludzkiego kompleksu INO80 lub podkompleksów INO80

1. Aby rozmrozić zamrożony ekstrakt jądrowy, należy umieścić probówki z ekstraktem na blacie laboratoryjnym lub toczyć je w dłoniach, aż zamrożony materiał zmieni się w zawiesinę. Następnie należy umieścić probówki na lodzie lub w chłodni, aż ekstrakt zostanie całkowicie rozmrożony.
2. Rozmrożony ekstrakt jądrowy należy przenieść do poliwęglanowych probówek do ultrawirówki o pojemności 10 ml i wirować przy 100 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C w rotorze typu 70.1 Ti lub równoważnym, aby usunąć wszelkie osady, które mogły powstać podczas cyklu zamrażania i rozmrażania.
3. Nadpływ należy przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Należy dodać świeży DTT, PMSF oraz koktajl inhibitorów proteaz do końcowych stężeń 1 mM DTT, 200 µM PMSF oraz 1:1 000 koktajlu inhibitorów proteaz.
4. Aby przygotować agarozę anty-FLAG do immunopuryfikacji, należy przenieść 200 µl 50% zawiesiny kulek agarozy anty-FLAG do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, używając pipety P200 lub podobnej z końcówką, której koniec został odcięty czystym skalpelem lub żyletką.
5. Kuleczki należy osadzić przez wirowanie w mikrocentryfudze stołowej przy 8 000 x g przez 30 s. Po usunięciu nadpływu kulki należy przemyć, resuspendując je w 1 ml buforu Lys450, a następnie osadzić przy 8 000 x g przez 30 s. Kuleczki należy przemyć jeszcze dwa razy.
6. Przemyte kuleczki agarozy anty-FLAG należy resuspender w około 100 µl ekstraktu jądrowego, używając pipety P200 lub podobnej pipety o regulowanej objętości z końcówką, której koniec został odcięty czystym skalpelem lub żyletką, a następnie, używając tej samej końcówki, przenieść resuspenderowane kulki do stożkowej probówki 15 ml zawierającej ekstrakt. Czynność należy powtórzyć kilka razy, aż wszystkie kuleczki zostaną przeniesione do probówki 15 ml.
7. Mieszaninę ekstraktu i kuleczek należy inkubować przez 4 h w temperaturze 4 °C przy powolnej rotacji na rotatorze laboratoryjnym. OPCJONALNIE: Należy dodać benzonukleazę w stężeniu 25 jednostek/ml w celu usunięcia zanieczyszczającego DNA.
8. Agarozę FLAG należy zebrać przez wirowanie przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
9. Kuleczki należy resuspender w 10 ml buforu Lys450 w celu przemycia, a następnie inkubować przez 5 min w temperaturze 4 °C przy łagodnym kołysaniu na nutatorze. Kuleczki należy osadzić przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
10. Kuleczki należy resuspender w 100–150 µl buforu Lys450 i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Należy kontynuować płukanie stożkowej probówki 15 ml za pomocą 100–150 µl buforu Lys450, aż wszystkie kuleczki zostaną przeniesione do probówki do mikrocentryfugi.
11. Kuleczki należy osadzić przy 8 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C w mikrocentryfudze. Należy przemyć je trzy razy więcej 1 ml buforu Lys450 oraz raz 1 ml buforu EB100 (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glicerolu, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,05% TritonX-100 oraz świeżo dodane 1 mM DTT, 200 µM PMSF i 1:1 000 koktajlu inhibitorów proteaz).
12. Aby eluować związane białka, należy dodać 200 µl buforu EB100 zawierającego 0,25 mg/ml peptydu 1x FLAG. Inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C na nutatorze.
13. Kuleczki należy osadzić przy 8 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C w mikrocentryfudze. Nadpływ zawierający eluowany kompleks INO80 należy przenieść do nowej probówki do mikrocentryfugi.
14. Elucję należy powtórzyć jeszcze cztery razy, a wszystkie nadpływy połączyć w jednej probówce.
15. Aby usunąć pozostałe kuleczki agarozy FLAG z eluowanej frakcji białkowej, należy przepuścić eluat przez pustą kolumnę wirową.
16. Eluowaną frakcję białkową należy skoncentrować około 10-krotnie, używając urządzenia do ultrafiltrowania (odcięcie masy cząsteczkowej 50 000).
17. Aby usunąć peptyd FLAG, skoncentrowaną frakcję białkową należy przepuścić kolejno przez dwie kolumny odsalające.
18. Oczyszczoną i odsoloną frakcję białkową należy podzielić na aliquoty po 20 µl, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
19. Skład podjednostek INO80 lub podkompleksów INO80 należy przeanalizować na żelach barwionych srebrem lub za pomocą western blottingu, a ich stężenia oszacować za pomocą półilościowego western blottingu, używając jako standardów preparatów rekombinowanych podjednostek INO80 o znanym stężeniu.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy podsumowujący procedury wykorzystane do generowania, oczyszczania i charakteryzacji ludzkich kompleksów przebudowy chromatyny INO80 zależnych od ATP.

Jak pokazano na Ryciniach 2 i 3, procedury te umożliwiają generowanie zarówno kompleksu INO80 typu dzikiego, jak i subkompleksów INO80 pozbawionych różnych podjednostek, co pozwala na późniejsze analizy biochemiczne wkładu brakujących podjednostek w aktywność...

Dyskusja

Badania strukturalne i funkcjonalne wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę ssaków z wyższych eukariontów były utrudnione przez trudności w przygotowaniu biochemicznie użytecznych ilości takich kompleksów zawierających zmutowane podjednostki lub całkowicie pozbawionych pewnych podjednostek. Istnieje szereg przeszkód technicznych: po pierwsze, manipulacja genetyczna w komórkach ssaków jest technicznie trudna i czasochłonna. W przeciwieństwie do komórek drożdży, których genom można łatwo edytować i cel...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (stabilizowana glutamina)	Life Technologies	35050-079
Płodowa surowica bydlęca	SAFC	12176C
Odczynnik do transfekcji FuGENE6	Promega	E2312
Hygromycyna B, sterylna w PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
Wektor pcDNA5/FRT	Life Technologies	V6010-20
Flp-In HEK293 komórki	Life Technologies	R780-07
pOG44 Wektor ekspresji rekombinazy Flp	Life Technologies	V600520
EZview Czerwona surowica cielęca ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
	SAFC	12138C
TARGETplus Basen SMARTsiRNA	Dharmacon / Thermo Scientific	różne
5x bufor do zawieszania siRNA	Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamina RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM Zredukowana surowica Technologie o średniej	żywotności	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (trypsyna)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptide	Sigma	F3290
Kolumna do chromatografii mikro biospinowej	Bio-Rad	737-5021
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Kolumny odsalające Zeba	Thermo Scientific	89882
Przeciwciało Anti-FLAG M2, mysie	przeciwciało Sigma	F3165
Anti-FLAG M2, królik	Sigma	F7425
Inhibitor proteazy Koktajl	Sigma	P8340
benzonaza	Novagen	70664
Wyposażenie
Wirnik JS-4.2 w wirówce J6	Wirnik Beckman-Coulter	339080
JA-17	Rurki poliwęglanowe Beckman-Coulter	369691
10 ml Butelki z poliwęglanu	Beckman-Coulter	355630
70 ml Rotor	Beckman-Coulter	355655
Typ 45 Ti	Beckman-Coulter	339160
Typ 70.1 Ti Rotor	Beckman-Coulter	342184
BD Clay Adams Mieszalnik nutatorów	BD Diagnostyka	15172-203
Rotator probówek/fiolek VWR Glas-Col	Glas-Col	099A RD4512
Termocykler do PCR Inkubator do butelek rolkowych PTC 200			MJ Bellco
	biotechnology	353348
Membrana transferowa Immobilon-FL 7 x 8,4	miliporów	IPFL07810
smarowane probówki	do mikrowirówek 1,5 mlGwiazda	3207