Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę generowania i oczyszczania dzikich i zmutowanych wersji ludzkiego kompleksu przebudowującego chromatynę INO80. Oznakowane epitopami wersje podjednostek INO80 ulegają stabilnej ekspresji w komórkach HEK293, a kompletne kompleksy i kompleksy pozbawione określonych zestawów podjednostek są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa immunologicznego.

Streszczenie

Kompleksy przebudowujące chromatynę INO80 regulują dynamikę nukleosomów i dostępność DNA poprzez katalizowanie zależnej od ATP przebudowy nukleosomów. Ludzkie kompleksy INO80 składają się z 14 podjednostek białkowych, w tym Ino80, ATPazy podobnej do SNF2, która służy zarówno jako podjednostka katalityczna, jak i rusztowanie do składania kompleksów. Funkcje innych podjednostek i mechanizmy, za pomocą których przyczyniają się one do aktywności remodelującej chromatynę kompleksu INO80, pozostają słabo poznane, częściowo ze względu na wyzwanie generowania podzespołów INO80 w komórkach ludzkich lub heterologicznych systemach ekspresji. Ten protokół JOVE opisuje procedurę, która umożliwia oczyszczanie ludzkich podkompleksów przebudowujących chromatynę INO80, które nie mają podjednostki lub podzbioru podjednostek. N-końcowe cDNA Ino80 znakowane epitopem FLAG są stabilnie wprowadzane do linii komórkowych ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) 293 za pomocą rekombinacji za pośrednictwem Flp. W przypadku, gdy podzbiór podjednostek kompleksu INO80 ma zostać usunięty, zamiast tego ulega ekspresji zmutowanych białek Ino80, które nie mają platformy potrzebnej do złożenia tych podjednostek. W przypadku, gdy pojedyncza podjednostka ma zostać uszczuplona, transfekuje siRNA ukierunkowane na tę podjednostkę do linii komórkowej HEK 293 stabilnie eksprymującej ATPazę Ino80 znakowaną FLAG. Przygotowuje się ekstrakty jądrowe i przeprowadza się immunoprecypitację flagi w celu wzbogacenia frakcji białkowych zawierających pochodne Ino80. Skład oczyszczonych podkompleksów INO80 można następnie analizować przy użyciu metod takich jak immunoblotting, barwienie srebrem i spektrometria mas. Podkompleksy INO80 i INO80 wygenerowane zgodnie z tym protokołem mogą być dalej analizowane za pomocą różnych testów biochemicznych, które są opisane w dołączonym protokole JOVE. Opisane tutaj metody można zaadaptować do badań właściwości strukturalnych i funkcjonalnych dowolnych kompleksów przebudowujących i modyfikujących chromatynę wielopodjednostkową u ssaków.

Wprowadzenie

Ewolucyjnie zachowane kompleksy przebudowujące chromatynę rodziny SNF2 są kluczowymi regulatorami organizacji chromatyny i dostępności DNA¹. Te kompleksy remodelujące zawsze zawierają centralną podjednostkę ATPazy podobną do SNF2, która w niektórych przypadkach łączy się z różnymi białkami pomocniczymi i tworzy wielopodjednostkowe zespoły makromolekularne. Aby zbadać szczegóły molekularne procesu przebudowy chromatyny zależnego od ATP, ważne jest zrozumienie wkładu danych podzbiorów podjednostek i / lub struktur domenowych w aktywność kompleksów. Takie analizy wymagają zdolności do generowania wysoce oczyszczonych zmutowanych kompleksów, które nie mają określonych podjednostek białkowych lub struktur domenowych.

Poprzednie badania strukturalno-funkcyjne kompleksów remodelujących chromatynę zależne od ATP koncentrowały się głównie na systemie modelowym drożdży ze względu na wyższą podatność genomu drożdży na manipulację (zobacz na przykład odnośniki^1-4). Biorąc pod uwagę zachowanie składu i funkcjonalności podjednostek wśród ortologicznych kompleksów przebudowujących, badania struktury i funkcji kompleksów przebudowujących drożdże dostarczyły ważnych informacji na temat ich odpowiedników u wyższych eukariontów. Niemniej jednak istnieją znaczne różnice specyficzne dla gatunku między kompleksami przebudowy, wynikające z przyrostu lub utraty podjednostek specyficznych dla gatunku, zysku lub utraty domen specyficznych dla gatunku podjednostek konserwatywnych oraz zmienności sekwencji w obrębie domen konserwatywnych podjednostek. Takie różnice mogą być w zasadzie spowodowane potrzebą przystosowania się wyższych komórek eukariotycznych do nowych środowisk molekularnych i komórkowych. Tak więc zrozumienie, w jaki sposób podjednostki wyższych eukariotycznych kompleksów remodelujących przyczyniają się do procesu przebudowy nukleosomów, jest cenne, ponieważ nie tylko rzuca światło na podstawowe mechanizmy procesu przebudowy chromatyny zależnej od ATP, ale także może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów, za pomocą których regulowana jest struktura chromatyny i ekspresja genów u wyższych eukariontów.

Do tej pory przeprowadzono tylko ograniczone badania strukturalne i funkcjonalne wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę u ssaków, częściowo ze względu na trudności w uzyskaniu biochemicznie zdefiniowanych kompleksów i podkompleksów przebudowujących chromatynę. Częściowo ominęliśmy te trudności za pomocą procedur opisanych poniżej, w których oczyszczanie powinowactwa immunologicznego stosuje się do przygotowania nienaruszonych podkompleksów INO80 lub INO80 z komórek ludzkich stabilnie eksprymujących N-końcowy epitop FLAG oznaczony typem dzikim lub zmutowanymi wersjami Ino80^5-7 (Figura 1). Aby uzyskać nienaruszone kompleksy INO80 z komórek ludzkich, rekombinację za pośrednictwem Flp stosuje się do generowania transgenicznych linii komórkowych HEK293 stabilnie eksprymujących cDNA znakowane epitopem FLAG kodujące podjednostki kompleksu INO80^8-10. Ponieważ nadmierna ekspresja podjednostek INO80 może być nieco toksyczna, konieczne jest wyizolowanie i utrzymanie klonalnych linii komórkowych w selektywnych warunkach, aby zapewnić stabilną ekspresję transgenu podczas wielu pasaży potrzebnych do ekspansji hodowli komórkowych na dużą skalę. Aby uzyskać mniejsze podkompleksy INO80, które zawierają tylko podzbiór podjednostek, z powodzeniem zastosowaliśmy dwa podejścia (Rysunek 2A,B). W pierwszym generujemy linie komórkowe HEK293 Flp-In stabilnie eksprymujące zmutowane wersje Ino80, które nie mają domen wymaganych do interakcji z określonymi podjednostkami⁵. Alternatywnie, knockdown za pośrednictwem siRNA jest stosowany do zubożenia pożądanej podjednostki z komórek wyrażających odpowiednią podjednostkę INO80 oznaczoną FLAG (dane niepublikowane). Wreszcie, w celu oczyszczenia ludzkich kompleksów INO80, chromatografię na bazie agarozy¹¹ FLAG stosuje się do wzbogacenia frakcji zawierającej INO80 z ekstraktów jądrowych, skutecznie zmniejszając w ten sposób obecność zanieczyszczających białek cytozolowych w końcowej frakcji zawierającej oczyszczone podkompleksy INO80 lub INO80.

Protokół

1. Wytwarzanie i hodowla stabilnych linii komórkowych HEK293 wyrażających pełną długość lub zmutowane wersje FLAG Ino80 lub innych podjednostek kompleksu INO80

1. Klon cDNA kodujący pełną długość lub zmutowaną ludzką ATPazę Ino80 lub inną podjednostkę INO80 do wektora ekspresji ssaków pcDNA5 / FRT z wbudowanym w ramkę, N-końcowym znacznikiem epitopu FLAG.
2. Przed kontynuowaniem potwierdź sekwencję wstawionych cDNA przez sekwencjonowanie DNA.
3. Aby przeprowadzić transfekcję, hoduj komórki Flp-In HEK293 w 10 cm szalkach do hodowli tkankowych w pożywce zawierającej DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 5% glutaminy i 10% FBS (płodowa surowica bydlęca).
4. Gdy komórki osiągną ~70% zbieżności, dodaj do każdej płytki do hodowli tkankowej mieszaninę 40 μl odczynnika do transfekcji FuGENE6, 0,5 μg odpowiedniego plazmidu ekspresji pcDNA5 / FRT i 9,5 μg pOG44, który koduje rekombinazę Flp, w całkowitej objętości 800 μl.
5. 48 godzin później trypsynizuj i dziel komórki w stosunku 1:30 na 10 cm szalki i hoduj je w DMEM z 5% glutaminy, 10% FBS i 100 μg/ml higromycyny B przez 3-4 tygodnie. Zmień pożywkę, gdy zacznie żółknąć (zwykle co 3-5 dni).
6. Aby zidentyfikować dodatnie klony, które wyrażają najwyższy poziom białka znakowanego FLAG, wybierz poszczególne kolonie oporne na higromycynę B i przenieś je do pojedynczego dołka na 24-dołkowej płytce.
   1. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, zbierz komórki z każdej studzienki w ~ 1 ml PBS i osadzaj przez odwirowanie przy 1,000 x g przez 5 minut.
   2. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad komórek w 60 μl buforu do próbek SDS-PAGE.
   3. Poddaj połowę zawieszonej osadki komórkowej stronie SDS i western blot w celu monitorowania ekspresji białka przynęty oznaczonego przez flagę; zachowaj drugą połowę do przyszłych analiz.
7. Jeśli w lizatach komórkowych nie zostanie wykryte żadne ludzkie białko Ino80 znakowane FLAG, należy dalej rozszerzyć początkową populację komórek klonalnych, posiewając komórki z pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki na 15-centymetrowe szalki do hodowli tkankowej.
   1. Aby pobrać komórki z 15-centymetrowych szalek, należy ponownie zawiesić w pobliżu zlewających się komórek w lodowatym PBS i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
   2. Doprowadzić do końcowej objętości 50 ml przez dodanie dodatkowego PBS.
   3. Osadzać komórki w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut i usunąć jak najwięcej supernatantu.
   4. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu Lys450 (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% TritonX-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 10% glicerolu, 1 mM DTT, 200 μM PMSF i koktajl inhibitorów proteazy 1:1,000).
      UWAGA: tutaj i gdzie indziej zawsze dodawaj DTT, PMSF i koktajl inhibitorów proteazy do bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
   5. Immuno-wytrącić białka znakowane FLAG z powstałego lizatu całych komórek za pomocą 20 μl żelu agarozowego anty-FLAG i przeanalizować eluaty FLAG za pomocą western blot. [Szczegółowe informacje na temat procedury immunoprecypitacji znajdują się w kroku 5.]
8. Przygotuj zamrożone zapasy pożądanych linii komórek klonalnych¹² i przechowuj je w ciekłym azocie do czasu użycia.

2. Uprawa linii komórkowych HEK293 w butelkach rolkowych

Do przygotowania kompleksów INO80 na dużą skalę, hoduj komórki w 10 - 20 butelkach rolkowych; typowy uzysk z każdej butelki rolkowej to ~1 ml upakowanych komórek.

1. Do każdej butelki rolkowej dodaj 200 ml DMEM, 5% glutaminy i 10% surowicy cielęcej, bez higromycyny B.
2. Przenieś wszystkie komórki z pojedynczego, prawie zlewającego się naczynia o średnicy 15 cm do każdej butelki rolkowej
3. Umieść butelki rolkowe w inkubatorze rolkowym o temperaturze 37 °C i obracaj z prędkością 0.2 obr./min.
4. Gdy komórki osiągną ~70% konfluencji, odlej i wyrzuć podłoże.
5. Dodaj ~ 50 ml lodowatego PBS do każdej butelki. Trzymając butelki poziomo, delikatnie obracaj, aby poluzować monowarstwę komórek.
6. Przenieś zawieszone komórki do plastikowych stożkowych butelek o pojemności 250 ml i umieść na lodzie.
7. Przepłucz butelki rolkowe dodatkowym PBS, przenosząc go sekwencyjnie z butelki na butelkę. Gdy roztwór do płukania nie jest już klarowny (zwykle po użyciu do przepłukania około 5 butelek), dodaj go do zawiesiny komórek.
8. Komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min.
9. Delikatnie zawieś komórki w PBS, połącz je w jednej stożkowej butelce o pojemności 250 ml i trzymaj na lodzie do czasu dalszej obróbki.

3. Knockdown za pośrednictwem siRNA podjednostek INO80 w komórkach wyrażających inną podjednostkę INO80 oznaczoną FLAGA

Aby uzyskać podkompleksy INO80 pozbawione pojedynczej podjednostki, użyj FLAG-immunopurification do oczyszczenia kompleksów INO80 z komórek traktowanych siRNA lub komórek stabilnie wyrażających shRNA. Opisany tutaj "odwrotny" protokół transfekcji siRNA (małe interferujące RNA) jest zoptymalizowany dla komórek HEK293 rosnących w 15-centymetrowych szalkach. Protokół dotyczy pojedynczej 15-centymetrowej szalki komórek i powinien być odpowiednio skalowany w zależności od liczby potrzebnych komórek. Aby przygotować biochemicznie użyteczne ilości kompleksu INO80 z komórek poddanych działaniu siRNA, należy przeskalować do kultur hodowanych na 40-15 cm szalkach; Z tych danych wydobędzie się około 2 - 4 ml upakowanych osadów komórkowych.

1. Hoduj komórki HEK293 stabilnie wyrażające pożądaną podjednostkę kompleksu INO80 do prawie zbiegu, w 15-centymetrowych szalkach.
2. Dodać objętość buforu do resuspensji siRNA (20 mM KCl, 6 mM HEPES-pH 7,5 i 0,2 mM MgCl₂) wystarczającą do przygotowania 50 μM roztworu podstawowego siRNA do probówki zawierającej liofilizowane siRNA. Odpipetować roztwór kilka razy w górę i w dół i inkubować na nutatorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że siRNA jest całkowicie rozpuszczone.
3. Przygotuj koktajl transfekcyjny zawierający siRNA i odczynnik do transfekcji. Zmieszać 10 μl 50 μM roztworu podstawowego siRNA z 32 μl lipofeektaminy RNAiMAX i dodać do 4 ml pożywki Opti-MEM o obniżonej surowicy, bardzo delikatnie mieszając; przed użyciem pozwolić, aby wszystkie odczynniki zrównoważyły się z RT
.
4. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
5. Przygotować komórki Flp-In HEK293 stabilnie eksprymujące pożądaną podjednostkę INO80 do transfekcji.
   1. Podczas inkubacji, o której mowa w kroku 3.4, umyć komórki w 15-centymetrowych naczyniach za pomocą RT PBS.
   2. Po usunięciu PBS potraktuj komórki 1 ml trypsyny, aż zaczną odrywać się od płytki.
   3. Natychmiast dodaj 10 ml kompletnej pożywki (DMEM + 5% glutaminy + 10% FBS) do trypsynizowanych komórek i delikatnie wymieszaj. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Zawiesić osad komórkowy w ~4 ml kompletnej pożywki i policzyć ponowne zawieszenie komórek za pomocą hemocytometru.
   5. Rozcieńczyć komórki kompletną pożywką do stężenia ~5,4 x 10⁶/ml.
6. Do każdego naczynia o średnicy 15 cm dodać 15 ml kompletnej pożywki hodowlanej, a następnie 4 ml koktajlu do transfekcji. Delikatnie obracaj, aby upewnić się, że podłoże i koktajl transfekcyjny są dokładnie wymieszane. Na koniec dodaj jeden ml zawiesiny komórkowej i ponownie delikatnie zamieszaj, aby równomiernie rozproszyć komórki.
7. Po 60 godzinach hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 należy} delikatnie usunąć pożywkę, ponownie zawiesić komórki w lodowatym PBS i natychmiast przystąpić do przygotowania ekstraktów jądrowych.

4. Przygotowanie ekstraktów jądrowych

Ta procedura została zmodyfikowana w stosunku do protokołu Dignam¹³ i może być skalowana w górę lub w dół w zależności od wielkości początkowych granulek komórek. Zazwyczaj z 1 ml upakowanych osadów komórkowych uzyskuje się 1 ml końcowego ekstraktu jądrowego. Wszystkie powinny być lodowate, a wszystkie czynności powinny być wykonywane w chłodni lub na lodzie, jeśli odpowiednia chłodnia nie jest dostępna.

1. Izolacja jąder:
   1. Delikatnie przenieść komórki do stożkowej probówki z podziałką o odpowiedniej wielkości (15 lub 50 ml) i wirować z prędkością 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Usunąć supernatant i zmierzyć objętość upakowanego osadu komórkowego. 1 ml upakowanych komórek odpowiada ~3 x 10⁸ komórek HEK293.
   3. Dodaj 5 upakowanych objętości komórek buforu A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl i świeżo dodany 1 mM DTT, 200 μM PMSF i 1:1,000 koktajl inhibitorów proteazy). Zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie.
   4. Inkubować na lodzie dokładnie przez 10 minut.
   5. Osadzać komórki w temperaturze 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
   6. Wielkość osadu komórkowego powinna wzrosnąć do 2-krotności podczas inkubacji w buforze A.
   7. Ponownie zawiesić komórki w dwóch upakowanych objętościach komórek buforu A i przenieść zawiesinę komórkową do homogenizatora tkankowego o odpowiedniej wielkości. Jeśli zaczynasz od mniej niż 2 ml wypełnionych komórek, użyj homogenizatora o pojemności 7 ml; w przypadku komórek wypełnionych 2 - 4 ml użyj homogenizatora o pojemności 15 ml; a w przypadku 10 lub więcej ml wypełnionych komórek należy użyć homogenizatora o pojemności 40 ml.
   8. Homogenizować zawiesinę komórkową za pomocą LUŹNEGO szklanego tłuczka homogenizatora Dounce, aż 90% komórek zabarwi się dodatnio 1% błękitem trypanowym.
   9. Przenieść zawiesinę do probówki wirówki o dużej prędkości 45 ml i wirować z prędkością 25 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirniku JA-17 lub podobnym (patrz Tabela materiałów/wyposażenia).
   10. Z osadu jądrowego usuń supernatant, który zawiera białka cytozolowe lub białka, które wyciekają z jądra podczas frakcjonowania.
2. Ekstrakcja jąder solą:
   1. Dodaj bufor C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% glicerolu, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA i świeżo dodany 1 mM DTT, 200 μM PMSF i 1:1,000 koktajl inhibitorów proteazy) do pastylki jądrowej; użyj 2,5 ml buforu C na każde 3 ml początkowej objętości upakowanych komórek (~1 x 10⁹ komórek).
   2. Za pomocą szklanej pałeczki lub pipety usunąć osad jądrowy ze ścianki probówki i przenieść całą mieszaninę do homogenizatora Dounce o odpowiedniej wielkości.
   3. Zawiesić jądra poprzez homogenizację mieszaniny dwoma pociągnięciami LUŹNEGO tłuczka.
   4. Przenieść zawieszoną frakcję jądrową do schłodzonej zlewki. Wybierz zlewkę tak, aby zawiesina wypełniła zlewkę na głębokość co najmniej 0,5 cm.
   5. Aby wyekstrahować białka jądrowe z chromatyny lub innych nierozpuszczalnych struktur, należy stopniowo zwiększać stężenie soli w zawiesinie do 0,42 M NaCl poprzez dodawanie kroplami 5 M NaCl, delikatnie mieszając zawiesinę pipetą lub szklaną pałeczką na lodzie; po dodaniu wszystkich 5 M NaCl roztwór powinien stać się bardzo lepki lub żelowaty. Obliczyć objętość 5 M NaCl potrzebną do doprowadzenia roztworu do końcowego stężenia 0,42 M NaCl według następującego wzoru:
      
   6. Ostrożnie przenieść lepką zawiesinę do 10 ml probówek z poliwęglanu w przypadku rotora typu 70.1 Ti (lub równoważnika) lub butelek z poliwęglanu o pojemności 70 ml w przypadku wirnika typu 45 Ti lub podobnego wirnika (patrz Tabela materiałów/wyposażenia). Szczelnie uszczelnić parafilmem, jeśli używasz tubek o pojemności 10 ml lub z zespołem nakrętki, jeśli używasz butelek o pojemności 70 ml.
   7. Powoli kołysać szczelnie zamknięte probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut za pomocą nutatora.
   8. Wirować próbki w rotorze typu 45 Ti lub 70,1 Ti przez 30 minut w temperaturze 120 000 x g w temperaturze 4 °C.
   9. Przenieść supernatant do pojedynczej plastikowej probówki lub butelki. Ten supernatant jest ekstraktem jądrowym, a osad zawiera chromatynę i inne szczątki jądrowe.
   10. Podzielić ekstrakt jądrowy na porcje o odpowiedniej wielkości, zamrozić go w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Oczyszczanie immunopowinowactwa ludzkich podkompleksów INO80 lub INO80

1. Aby rozmrozić zamrożony ekstrakt jądrowy, umieść probówki zawierające ekstrakt na blacie stołu lub zwiń rurki między rękami, aż zamrożony materiał stanie się zawiesiną. Następnie umieść probówki na lodzie lub w chłodni, aż ekstrakt całkowicie się rozmrozi.
2. Przenieść rozmrożony ekstrakt jądrowy do 10 ml probówek ultrawirówek z poliwęglanu i wirować z prędkością 100 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirniku typu 70.1 Ti lub równoważnym w celu usunięcia wszelkich osadów, które mogły powstać podczas cyklu zamrażania i rozmrażania.
3. Przenieść sklarowany osad do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj świeży koktajl inhibitorów proteazy DTT, PMSF i proteazy do końcowych stężeń 1 mM DTT, 200 μM PMSF i koktajlu inhibitorów proteazy 1:1,000.
4. Aby przygotować agarozę anty-FLAG do immunooczyszczania, należy przenieść 200 μl 50% zawiesiny kulek agarozy anty-FLAG do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety P200 lub podobnej z końcówką, od której koniec został odcięty czystym skalpelem lub żyletką.
Granulki osadzać przez
5. odwirowanie w mikrowirówce stołowej o sile 8 000 x g przez 30 sekund. Usunąć supernatant i umyć kulki przez ponowne zawieszenie kulek w 1 ml buforu Lys450 i granulować kulki w ilości 8 000 x g przez 30 sekund. Umyj kulki jeszcze dwa razy.
6. Ponownie zawiesić przemyte kulki agarozy anty-FLAG w około 100 μl ekstraktu jądrowego za pomocą pipety P200 lub podobnej pipety o regulowanej objętości z końcówką, od której koniec został odcięty czystym skalpelem lub żyletką i za pomocą tej samej końcówki przenieść zawieszone kulki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej ekstrakt. Powtórz kilka razy, aż wszystkie kulki zostaną przeniesione do probówki o pojemności 15 ml.
7. Mieszaninę ekstraktu i kulek inkubować przez 4 godziny w temperaturze 4 °C, powoli obracając się na rotatorze laboratoryjnym. OPCJONALNIE: Dodać benzonazę w stężeniu 25 jednostek/ml w celu usunięcia zanieczyszczającego DNA.
8. Zebrać agarozę LGR przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
9. Zawiesić ponownie w 10 ml Lys450 do przemycia, inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc na nutatorze. Granulki osadzać w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
10. Zawiesić ponownie w 100 - 150 μl Lys450 i przenieść kulki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Kontynuuj płukanie stożkowej probówki o pojemności 15 ml 100 - 150 μl Lys450, aż wszystkie kulki zostaną przeniesione do probówki do mikrowirówki.
11. Wirować kulki w temperaturze 8 000 x g przez 30 sekund w temperaturze 4 °C w mikrowirówce. Przemyj jeszcze trzy razy 1 ml Lys450 i raz 1 ml buforu EB100 (10 mM HEPES pH 7,9, 10% glicerolu, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,05% TritonX-100 i świeżo dodany 1 mM DTT, 200 μM PMSF i 1:1,000 koktajl inhibitorów proteazy).
12. Aby wymyć związane białka, dodaj 200 μl buforu EB100 zawierającego 0,25 mg/ml 1x peptyd FLAG. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C każdy na nutatorze.
13. Granulki osadzać w temperaturze 8 000 x g przez 30 sekund w temperaturze 4 °C w mikrowirówce. Przenieść supernatant, który zawiera eluowany kompleks INO80, do świeżej probówki do mikrowirówki.
14. Powtórzyć elucję jeszcze cztery razy i zebrać wszystkie supernatanty w jednej probówce.
15. Aby usunąć wszelkie pozostałości kulek agarozy FLAG z eluowanej frakcji białkowej, należy przepuścić eluat przez pustą kolumnę wirową.
16. Zagęścić wymywaną frakcję białkową ~10-krotnie za pomocą ultra odśrodkowego urządzenia filtrującego (odcięcie 50 000 masy cząsteczkowej).
17. Aby usunąć peptyd FLAG, należy kolejno przepuścić skoncentrowaną frakcję białkową przez dwie kolumny odsalające.
18. Oczyszczoną, odsoloną frakcję białkową podzielić na 20 μl podwielokrotności, zamrożoną w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
19. Przeanalizować skład podjednostek podkompleksów INO80 lub INO80 na żelach barwionych srebrem lub przez western blot i oszacować ich stężenia przez półilościowe western blot przy użyciu preparatów rekombinowanych podjednostek INO80 o znanym stężeniu jako wzorce.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje schemat blokowy podsumowujący procedury używane do generowania, oczyszczania i charakteryzowania ludzkich kompleksów remodelujących chromatynę zależnych od INO80 ATP.

Jak pokazano na rysunkach 2 i 3, procedury te umożliwiają generowanie zarówno podkompleksów INO80 typu dzikiego, jak i INO80, które nie mają różnych podjednostek, umożliwiając tym samym późniejsze analizy biochemiczne udziału tych brakujących podjednostek w akt...

Dyskusja

Badania strukturalne i funkcjonalne wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę ssaków z wyższych eukariontów były utrudnione przez trudności w przygotowaniu biochemicznie użytecznych ilości takich kompleksów zawierających zmutowane podjednostki lub całkowicie pozbawionych pewnych podjednostek. Istnieje szereg przeszkód technicznych: po pierwsze, manipulacja genetyczna w komórkach ssaków jest technicznie trudna i czasochłonna. W przeciwieństwie do komórek drożdży, których genom można łatwo edytować i cel...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cellgro	10-013-CV
Glutamax-I (stabilizowana glutamina)	Life Technologies	35050-079
Płodowa surowica bydlęca	SAFC	12176C
Odczynnik do transfekcji FuGENE6	Promega	E2312
Hygromycyna B, sterylna w PBS	AG Scientific	H-1012-PBS
Wektor pcDNA5/FRT	Life Technologies	V6010-20
Flp-In HEK293 komórki	Life Technologies	R780-07
pOG44 Wektor ekspresji rekombinazy Flp	Life Technologies	V600520
EZview Czerwona surowica cielęca ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	F2426
	SAFC	12138C
TARGETplus Basen SMARTsiRNA	Dharmacon / Thermo Scientific	różne
5x bufor do zawieszania siRNA	Dharmacon / Thermo Scientific	#B-002000-UB-100
Lipofectamina RNAiMAX	Life Technologies	13778
Opti-MEM Zredukowana surowica Technologie o średniej	żywotności	51985-091
PBS	Cellgro	45000	VWR
TrypLE (trypsyna)	Life Technologies	12604
1x FLAG Peptide	Sigma	F3290
Kolumna do chromatografii mikro biospinowej	Bio-Rad	737-5021
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra (50k MWCO)	Amicon	UFC805024	Fisher Scientific
Kolumny odsalające Zeba	Thermo Scientific	89882
Przeciwciało Anti-FLAG M2, mysie	przeciwciało Sigma	F3165
Anti-FLAG M2, królik	Sigma	F7425
Inhibitor proteazy Koktajl	Sigma	P8340
benzonaza	Novagen	70664
Wyposażenie
Wirnik JS-4.2 w wirówce J6	Wirnik Beckman-Coulter	339080
JA-17	Rurki poliwęglanowe Beckman-Coulter	369691
10 ml Butelki z poliwęglanu	Beckman-Coulter	355630
70 ml Rotor	Beckman-Coulter	355655
Typ 45 Ti	Beckman-Coulter	339160
Typ 70.1 Ti Rotor	Beckman-Coulter	342184
BD Clay Adams Mieszalnik nutatorów	BD Diagnostyka	15172-203
Rotator probówek/fiolek VWR Glas-Col	Glas-Col	099A RD4512
Termocykler do PCR Inkubator do butelek rolkowych PTC 200			MJ Bellco
	biotechnology	353348
Membrana transferowa Immobilon-FL 7 x 8,4	miliporów	IPFL07810
smarowane probówki	do mikrowirówek 1,5 mlGwiazda	3207