Artykuł metodologiczny

Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

DOI:

10.3791/51721

⸱

25 października 2014

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy testy biochemiczne, które mogą być użyte do scharakteryzowania zależnych od ATP enzymów przebudowujących chromatynę pod kątem ich zdolności do 1) katalizowania przesuwania się nukleosomów zależnych od ATP, 2) angażowania się w substraty nukleosomów i 3) hydrolizy ATP w sposób zależny od nukleosomu lub DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Członkowie rodziny ATPaz SNF2 często funkcjonują jako składniki wielopodjednostkowych kompleksów przebudowujących chromatynę, które regulują dynamikę nukleosomów i dostępność DNA poprzez katalizowanie zależnej od ATP przebudowy nukleosomów. Biochemiczne rozeznanie wkładu poszczególnych podjednostek takich kompleksów w wieloetapową reakcję przebudowy chromatyny zależną od ATP wymaga zastosowania testów, które monitorują wytwarzanie produktów reakcji i mierzą powstawanie produktów pośrednich. Ten protokół JOVE opisuje testy, które pozwalają zmierzyć aktywność biochemiczną kompleksów lub podkompleksów przebudowujących chromatynę zawierających różne kombinacje podjednostek. Przebudowa chromatyny jest mierzona za pomocą testu ślizgowego nukleosomów zależnego od ATP, który monitoruje ruch nukleosomu na cząsteczce DNA za pomocą metody opartej na teście przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA). Aktywność wiązania nukleosomów mierzy się poprzez monitorowanie powstawania przebudowujących mononukleosomów związanych z kompleksem przy użyciu podobnej metody opartej na EMSA, a aktywność ATPazy zależnej od DNA lub nukleosomów oznacza się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w celu zmierzenia szybkości konwersji ATP do ADP i fosforanu w obecności DNA lub nukleosomów. Korzystając z tych testów, można zbadać funkcje podjednostek kompleksu przebudowującego chromatynę, porównując działania całego kompleksu z tymi, w których brakuje jednej lub więcej podjednostek. Jako przykład użyto ludzkiego kompleksu przebudowy chromatyny INO80; Jednak opisane tutaj metody można dostosować do badania innych kompleksów przebudowujących chromatynę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleksy przebudowujące chromatynę z rodziny SNF2 zawierają centralną podjednostkę ATPazy SNF2 1,2. Niektóre ATPazy podobne do SNF2 działają jako enzymy z pojedynczymi podjednostkami, podczas gdy inne działają jako podjednostka katalityczna większych kompleksów wielopodjednostkowych. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, dzięki którym każda z podjednostek kompleksów przebudowujących chromatynę przyczynia się do ich działania, wymaga umiejętności wykonywania testów biochemicznych, które analizują proces przebudowy.

Zależny od ATP remodeling nukleosomów przez ludzki kompleks INO80 i inne enzymy remodelujące chromatynę można sobie wyobrazić jako wieloetapowy proces, który rozpoczyna się od wiązania enzymu przebudowującego z nukleosomami, po którym następuje aktywacja jego zależnej od DNA i/lub nukleosomów ATPazy, translokacja enzymu przebudowującego na DNA nukleosomalne i ostateczna repozycja nukleosomów 1,2. Zrozumienie szczegółów molekularnych procesu przebudowy chromatyny zależnego od ATP wymaga rozbioru reakcji przebudowy na poszczególne etapy i zdefiniowania wkładu poszczególnych podjednostek kompleksu przebudowy chromatyny w każdym etapie reakcji. Takie analizy wymagają umiejętności analizy przebudowy nukleosomów i innych czynności przy użyciu zdefiniowanych substratów molekularnych in vitro.

W poprzednim protokole JOVE opisaliśmy procedury używane do generowania kompleksów i podkompleksów przebudowujących chromatynę INO80 o zdefiniowanych składach podjednostek 3. W tym miejscu przedstawiamy trzy testy biochemiczne, które umożliwiają analizę ilościową wiązania nukleosomów, ATPazy aktywowanej DNA i nukleosomów oraz działań remodelujących nukleosom związanych z takimi kompleksami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Testy przebudowy nukleosomów zależne od ATP

Aby zmierzyć aktywność przebudowy nukleosomów zależnych od ATP, immunooczyszczane podkompleksy INO80 lub INO80 są inkubowane z ATP i mononukleosomalnym substratem, który zawiera pojedynczy nukleosom umieszczony na jednym końcu fragmentu DNA znakowanego 216 pz, 32P. Produkty reakcji są następnie poddawane elektroforezie w natywnych żelach poliakrylamidowych.

  1. Aby wygenerować 32znakowane P fragment DNA "601", amplifikuj z pGEM-3Z-6014 fragment DNA o długości 216 pz zawierający umieszczoną na końcu sekwencję pozycjonowania nukleosomów 601, używając oligonukleotydów 5′-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG i 5′-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG jako startery do przodu i do tyłu.
    1. Przeprowadzić reakcję PCR o objętości 100 μl zgodnie z opisem w Tabeli 1.
    2. Przeprowadzić reakcje PCR w termocyklerze, stosując następujący program: 1 min w temperaturze 96 °C, następnie 45 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 57 °C, 60 s w temperaturze 72 °C przez 30 cykli; kończąc na 7 min w temperaturze 72 °C.
    3. Po zakończeniu reakcji PCR usuń niewłączone nukleotydy, dwukrotnie przepuszczając produkty reakcji przez kolumny spinowe bez nukleaz.
    4. Uruchom 5 μl oczyszczonego produktu PCR w 1,2% żelu agarozowym, aby potwierdzić, że reakcja PCR wygenerowała pożądany fragment DNA o długości ~216 pz.
    5. Rozcieńczyć 5 μl oczyszczonego produktu PCR 20-krotnie i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV. Średni plon wynosi ~40 ng/μl.
    6. Zmierzyć radioaktywność 1 μl oczyszczonego produktu PCR w liczniku scyntylacyjnym. Oszacuj wydajność etykietowania, obliczając cpm/ng. Oczekuje się, że udana reakcja znakowania przyniesie ~ 15 000 cpm/ng 601 fragmentów DNA.
  2. Przenieś nukleosomy z komórek Hela na znakowane DNA 601 przy użyciu metody seryjnego rozcieńczania 5.
    1. Zmieszać 2 pmol 32znakowanego P fragmentu DNA 601 z 6 μg nukleosomów Hela (przygotowanych zgodnie z opisem 5) w 50 μl buforu zawierającego 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF i 1 mM DTT i inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
    2. Kolejno rozcieńczyć mieszaninę do 0,8 M, 0,6 M i 0,4 M NaCl przez rozcieńczenie odpowiednio 12,5 μl, 20,8 μl i 41,6 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF i 1 mM DTT, z 30-minutową inkubacją w temperaturze 30 °C po każdym rozcieńczeniu.
    3. Następnie rozcieńczyć mieszaninę do 0,2 M, a następnie do 0,1 M NaCl przez dodanie 125 μl, a następnie 250 μl tego samego buforu zawierającego 0,1% Nonidet P-40, 20% glicerolu i 200 μg/ml BSA, z 30-minutową inkubacją w temperaturze 30 °C między dwoma ostatnimi rozcieńczeniami. Substrat mononukleosomu należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  3. Przeprowadzić zależne od ATP reakcje ślizgowe nukleosomów w całkowitej objętości 10 μl. Składniki reakcji wymieniono w tabeli 2. Ponieważ optymalne stężenie NaCl dla aktywności przebudowy nukleosomów INO80 wynosi ~50 mM NaCl (wyniki niepublikowane), należy dostosować całkowite stężenie NaCl w każdej reakcji do 50 mM, biorąc pod uwagę ilość NaCl zawartą w preparatach nukleosomów i enzymów.
    1. Przed przystąpieniem do wykonywania testów należy odlać natywne żele poliakrylowe (18 x 16 cm). Aby przygotować pojedynczy żel zawierający 5% akrylamidu (akryloamid:bisakryloamid 37,5:1), 0,5x TBE (45 mM tris boran, 1 mM EDTA), 0,01% nadsiarczanu amonu (APS) i 0,001% N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), należy wymieszać składniki wymienione w tabeli 3. Pozostawić żel do polimeryzacji przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Tymczasem, dla każdej przeprowadzonej reakcji, należy połączyć we wstępnie schłodzonej silikonowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml ~20 nM podkompleksu INO80 lub INO80 (przygotowanego zgodnie z opisem 3) z ilością buforu EB100 (Tabela 4) wystarczającą do uzyskania objętości 4,75 μl. Natychmiast ponownie zamrozić wszelkie pozostałe frakcje zawierające INO80 w sproszkowanym suchym lodzie lub ciekłym azocie.
    3. Przygotuj główny koktajl z pozostałymi składnikami, skalując w górę o współczynnik "X" (gdzie X = całkowita liczba reakcji +3). Ilość każdego składnika potrzebna do przeprowadzenia pojedynczej reakcji o objętości 10 μl jest podana w tabeli 5; Recepturę należy skalować w górę w zależności od liczby reakcji, które mają zostać przeprowadzone. Dobrze wymieszać, stukając w probówkę lub pipetując w górę i w dół za pomocą Pipetmana, a następnie obracać probówkę przez kilka sekund w mikrowirówce stołowej.
    4. Dozować 5,25 μl koktajlu wzorcowego do każdej z probówek reakcyjnych ustawionych w kroku 1.3.2. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Reakcje należy rozpocząć od przeniesienia probówek reakcyjnych do bloku grzewczego lub łaźni wodnej o temperaturze 30 °C i inkubować przez 2 godziny.
    5. W międzyczasie przygotuj koktajl "usuwający mieszankę" zawierający konkurencyjne DNA i nukleosomy, skalując się w górę o współczynnik X (X = całkowita liczba reakcji + 4). Ilość każdego składnika potrzebna do przygotowania 1,5 μl mieszanki usuwającej dla pojedynczej reakcji jest podana w tabeli 6; Receptura powinna być skalowana w zależności od liczby testów, które mają zostać wykonane.
    6. Zakończyć reakcje, dodając 1,5 μl mieszaniny usuwającej. Dobrze wymieszać, odwirować i inkubować w temperaturze 30 °C przez kolejne 30 minut.
    7. W międzyczasie należy wstępnie uruchomić natywny żel poliakryloamidowy w pionowej jednostce elektroforezy pod napięciem 100 V przez 30 minut w temperaturze 4 °C, używając 0,5 TBE jako bufora bieżącego z mieszadłem magnetycznym wewnątrz dolnej komory, aby utrzymać stałą cyrkulację bufora.
    8. Aby załadować próbkę, dodaj 2,5 μl barwnika ładującego zawierającego 3x TBE, 30% glicerolu, 0,25% błękitu bromofenolowego i 0,25% ksylenu Cyanol FF. Dobrze wymieszaj, krótko odwiruj próbki i załaduj na żel za pomocą końcówek ładujących.
    9. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 4,5 godziny w temperaturze 4 °C z obiegiem buforowym.
    10. Aby wykryć sygnał, przenieś żel na stos dwóch arkuszy bibuły filtracyjnej. Owinąć bibułę filtracyjną żelem na wierzchu za pomocą przezroczystej folii plastikowej, a następnie wystawić ją na ekran luminoforowy do przechowywania w temperaturze 4 °C przez żądany czas.
    11. Zeskanuj ekran za pomocą systemu skanera obrazowania izotopowego i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

2. Testy wiązania mononukleosomów

Aby sprawdzić powinowactwo wiązania danego kompleksu INO80 do mononukleosomów, wykonaj test EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Asset) przy użyciu substratu mononukleosomalnego wygenerowanego w kroku 1.2.

  1. Ustawić mieszaniny reakcyjne do testów wiązania zgodnie z opisem dla testów przebudowy nukleosomów, ale pominąć ATP i usunąć mieszaninę z reakcji; inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut.
  2. Do każdej mieszaniny reakcyjnej dodać 2,5 μl barwnika ładującego i nałożyć na natywny żel poliakrylamidowy zawierający 3,5% akrylamidu (akrylamid: bis 37,5:1), 1% glicerolu, 0,5x TBE, 0,01% APS i 0,001% TEMED.
  3. Używając 0,5x TBE jako bufora bieżącego, uruchom żel pod napięciem 200 V przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C z cyrkulacją buforową i wystaw na działanie sita fosforowego do przechowywania.

3. Testy ATPazy zależne od DNA i nukleosomów

Wykonaj testy ATPazy w 5 μl mieszaninach reakcyjnych zawierających 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glicerolu, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 μCi [α-32P] ATP (3,000 Ci/mmol). Dla każdego kompleksu INO80 lub ilości kompleksu INO80, który ma być testowany, należy ustawić trzy równoległe reakcje, jedną zawierającą bufor EB100 do pomiaru ATPazy niezależnej od DNA lub nukleosomów, jedną zawierającą zamkniętą kolistą plazmidową DNA (5,000 pz, ~30 nM) do pomiaru ATPazy zależnej od DNA i jedną zawierającą oligonukleosomy Hela (~185 nM) do pomiaru ATPazy zależnej od nukleosomów. Ustaw wszystkie reakcje na lodzie.

  1. Dla każdej reakcji należy połączyć 10-50 nM immunooczyszczanych podkompleksów INO80 lub INO80 z ilością buforu EB100 wystarczającą do uzyskania objętości 2,2 μl we wstępnie schłodzonych, nasmarowanych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Natychmiast ponownie zamrozić wszelkie frakcje zawierające INO80 w sproszkowanym suchym lodzie lub ciekłym azocie.
  2. Przygotuj mistrzowski koktajl. Ilość każdego składnika potrzebna do pojedynczej reakcji jest podana w tabeli 7. Zwiększyć skalę receptury, zwiększając ją o współczynnik 3(X+2) +1, gdzie X = liczba preparatów INO80 do oznaczenia.
  3. Aby przygotować "podkoktajle" zawierające tylko bufor, DNA lub nukleosomy, należy dozować 2,5 (X + 2) μl koktajlu głównego do trzech oddzielnych probówek. Dodaj 0,3 (X + 2) μl EB100, zamkniętego kolistego plazmidowego DNA (1,5 μg / μl) lub oligonukleosomów Hela (1,5 μg / μl) i dobrze wymieszaj.
  4. Dozować 2,8 μl odpowiedniego subkoktajlu do probówek reakcyjnych zawierających enzymy ustawionych w kroku 3.1. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać; Unikaj wprowadzania bąbelków.
  5. Aby rozpocząć reakcje, przenieść probówki reakcyjne do bloku grzewczego o temperaturze 30 °C.
  6. Po 5, 15, 30 i 60 minutach inkubacji umieścić 0,5 μl każdej mieszaniny reakcyjnej na płytce chromatografii cienkowarstwowej (TLC) z polietylenu celulozowego (TLC) w linii prostej, w odległości co najmniej 1,5 cm od dolnej krawędzi. Natychmiast należy zwrócić probówki reakcyjne do bloku grzewczego o temperaturze 30 °C, aby można było pobrać wiele punktów czasowych z jednej probówki. Po plamieniu wysusz płytki TLC za pomocą suszarki.
  7. Przenieść płytki TLC do szklanej komory zawierającej wystarczającą ilość 0,375 M fosforanu potasu (pH 3,5), aby umożliwić zanurzenie dolnego 0,5 cm płytki TLC w roztworze.
  8. Przykryj komorę i rozwijaj, aż czoło fazy ciekłej osiągnie górną część płytek TLC. Natychmiast dokładnie wysusz płytki za pomocą suszarki.
  9. Wystawić wysuszone płytki TLC na ekran fosforowy do przechowywania w temperaturze pokojowej. Zeskanuj ekran za pomocą systemu skanera do obrazowania izotopowego i określ ilość radioaktywnego substratu ATP i produktu ADP.
  10. Aby obliczyć ilość hydrolizowanego ATP, należy pomnożyć % zhydrolizowanego ATP przez ilość ATP obecnego w początkowej mieszaninie reakcyjnej, korzystając z następującego wzoru: pmol ATP zhydrolizowany = 10 pmol ATP w reakcji początkowej x [ADP/(ATP+ADP)]

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki pokazują reprezentatywne wyniki testów biochemicznych używanych do charakteryzowania aktywności INO80, w tym testów przesuwania nukleosomów (Rysunek 1) i wiązania (Rysunek 2) oraz testów ATPazy zależnej od DNA lub nukleosomów (Rysunek 3).

Eksperyment pokazany na rysunku 1 porównuje zdolność nienaruszonych kompleksów INO80 oczyszczonych przez FLAG-Ies2 lub FLAG-INO80E i podkompleksów INO80 oczyszczonych przez FLAG-Ino80...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby upewnić się, że remodelowanie nukleosomów i aktywność ATPazy, które obserwujemy w testach, zależy od aktywności katalitycznej kompleksów INO80, a nie od zanieczyszczającego przemodelowania i / lub enzymów ATPazy, rutynowo testujemy przebudowę nukleosomów i aktywność ATPazy katalitycznie nieaktywnych wersji kompleksów INO80, oczyszczonych równolegle z INO80 typu dzikiego przy użyciu tej samej procedury. Reakcja kontroli ujemnej pozbawiona ATP powinna być również przeprowadzana podczas oznaczania aktywności przebudowy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium autorów jest wspierana przez grant z National Institute of General Medical Sciences (GM41628) oraz przez grant dla Stowers Institute for Medical Research z Helen Nelson Medical Research Fund w Greater Kansas City Community Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340
10x bufor reakcyjny PCR Nauki stosowane Roche 
Polimeraza DNA Roche TaqNauki stosowane 
Kolumny wirujące NucAway bez nukleaz AmbionKat. # AM10070
ultraczysty ATP USB/Affymetrix77241 25 UM
albumina surowicy bydlęcej SigmaA9418 
40% Akrylamid/Bis 37,5:1Amresco0254-500ML
Dźwiękowe DNA nasienia łososia GE Healthcare27-4565-01
10% nadsiarczan amonu (APS)Thermo Scientific17874
benzonaza Novagen. Nr 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmolPerkinElmerBLU013Z250UC
termocykler PCR PTC 200MJ BadaniaPTC 200
Hoefer pionowa jednostka elektroforezyHoeferSE600X-15-1,5
ml smarowane probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml Costar3207
Ekran fosforowy do przechowywania Molecular Dynamics63-0034-79
Bibuła filtracyjna 3MMWhatman 28458-005VWR
Typhoon PhosphorImager Oprogramowanie GE Healthcare8600
ImageQuantGE Healthcarever2003.02
Płytki szklane TLC, PEI-celuloza FMilipore5725-7
Membrana transferowa Immobilon-FL 7 x 8,4miliporówIPFL07810
Miernik pomiarowy ogólnego przeznaczenia z oknem końcowym lub sondą typu naleśnikowego GM (Geiger-Mueller)BiodexModel 14C
1143509400111435094001Nr kat.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
  2. Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  3. Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
  4. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
  5. Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
  6. Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
  7. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
  8. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
  9. Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
  10. Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
  11. Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
  12. Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
  13. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  14. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
  15. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  16. Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza przesuwania nukleosom wmetoda oparta na EMSAcienkowarstwowa chromatografiaanaliza aktywno ci ATPaseaktywno wi zania nukleosom wludzki kompleks INO80analiza przesuni cia w elektroforezie EMSAdetekcja radioaktywnego substratukompleksy remodeluj ce chromatyn

Powiązane artykuły