Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

39.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51751

⸱

8 września 2014

 ,  , 
1CNRS, UMR-5203, Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, 2Inserm, U661, Montpellier, 3Universités de Montpellier

W tym artykule

Podsumowanie

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Streszczenie

Neurony dopaminergiczne stanowią mniej niż 1% całkowitej liczby neuronów w mózgu. Ta niewielka ilość neuronów reguluje ważne funkcje mózgu, takie jak kontrola motoryczna, motywacja i pamięć robocza. Nigrostriatalne neurony dopaminergiczne ulegają selektywnej degeneracji w chorobie Parkinsona (PD). Ta postępująca utrata neuronów jest jednoznacznie związana z objawami motorycznymi patologii (bradykinezja, drżenie spoczynkowe i sztywność mięśni). Główny czynnik odpowiedzialny za zwyrodnienie neuronów dopaminergicznych jest nadal nieznany. Jednak neurony te wydają się być niezwykle wrażliwe w różnych warunkach. Kultury pierwotne stanowią jeden z najistotniejszych modeli do badania właściwości i cech neuronów dopaminergicznych. Kultury te mogą być poddawane różnym czynnikom stresowym, które naśladują patologię PD oraz związkom neuroprotekcyjnym w celu zatrzymania lub spowolnienia degeneracji neuronów. Liczne transgeniczne mysie modele PD, które zostały wygenerowane w ciągu ostatniej dekady, jeszcze bardziej zwiększyły zainteresowanie naukowców hodowlami neuronów dopaminergicznych. W tym przypadku protokół wideo skupia się na delikatnej sekcji embrionalnych mózgów myszy. Precyzyjne wycięcie śródmózgowia brzusznego jest kluczowe dla uzyskania kultur neuronalnych wystarczająco bogatych w komórki dopaminergiczne, aby umożliwić późniejsze badania. Protokół ten może być realizowany na embrionalnych myszach transgenicznych i nadaje się do barwienia immunofluorescencyjnego, ilościowego PCR, kwantyfikacji drugiego przekaźnika lub oceny śmierci/przeżycia neuronów.

Wprowadzenie

Dopamina, jeden z podstawowych neuroprzekaźników mózgowych1,2, jest głównie uwalniana przez neurony dopaminergiczne (DA) śródmózgowia. Większość neuronów DA znajduje się w brzusznej części śródmózgowia2-6. Schematycznie neurony DA śródmózgowia można podzielić na trzy anatomicznie i funkcjonalnie odrębne systemy projekcyjne: szlaki mezostriatalne, mezolimbiczne i mezokortykalne2,5. Szlak nigrostriatalny jest zaangażowany w zachowania motoryczne, szlaki mezolimbiczne odgrywają ważną rolę we wzmacnianiu, motywacji i uczeniu się, podczas gdy szlaki dopaminergiczne rzutujące do kory przedczołowej są zaangażowane w poznanie2.

Neurony DA są zaangażowane w kilka zaburzeń neurologicznych człowieka, takich jak schizofrenia, deficyt uwagi, zespół nadpobudliwości i choroba Parkinsona (PD)2,4. PD charakteryzuje się postępującą i selektywną degeneracją neuronów DA łączących istotę czarną pars compacta (SNc) z prążkowiem. Utrata neuronów DA nigro-prążkowia powoduje poważne wyczerpanie dopaminy w prążkowiu, które jest odpowiedzialne za objawy motoryczne PD (bradykinezja, drżenie spoczynkowe i sztywność)7. Pierwotna przyczyna idiopatycznej choroby Parkinsona nie została ustalona, a obecne leczenie jest jedynie objawowe, mające na celu przywrócenie poziomu dopaminy w prążkowiu. Najczęściej przepisywanym lekiem jest L-Dopa (lewodopa), naturalny prekursor dopaminy. Chociaż podawanie lewodopy kompensuje utratę dopaminy przez pewien czas, powikłania motoryczne występują po długotrwałym leczeniu (dyskinezy i stany włączenia/wyłączenia)8,9.

Badania nad neuronami dopaminergicznymi i PD są w ciągłym postępie i podejmowane są intensywne wysiłki w celu opracowania terapii opartych na transplantacji komórek, terapii genowej lub środkach neuroprotekcyjnych10,11. Jednak główny problem pozostaje niewyjaśniony: jaka jest przyczyna ekstremalnej wrażliwości neuronów DA? Część odpowiedzi można znaleźć w aktywności neuronów DA. Zmniejszenie aktywności elektrycznej i pobudliwości neuronów DA wydaje się zwiększać ich skłonność do degeneracji12. Niemniej jednak złożoność patogenezy PD wymaga dalszych badań w celu zidentyfikowania mechanizmów zaangażowanych w degenerację neuronów DA13-15.

Kultury pierwotne są szczególnie istotne do badania właściwości neuronów DA16-19 i do wyzywania tych neuronów na różne stresy w celu oceny czynników neuroprotekcyjnych20-24. Najczęściej stosuje się modele hodowli szczurów, ponieważ rozwarstwienie śródmózgowia zarodka szczura jest łatwiejsze w porównaniu z myszą, a u szczura można uzyskać większą ilość neuronów. Jednak generacja transgenicznych mysich modeli choroby25 znacznie zwiększyła zainteresowanie społeczności neurobiologów pierwotnymi kulturami myszy26-29. Chociaż można stosować kultury przygotowane z nowonarodzonych zwierząt, lepiej jest przygotować je z zarodków w stadium postmitotycznym (E13.5 dla neuronów śródmózgowia), kiedy neurony zachowały zdolność różnicowania się. Poniższy protokół przedstawia izolowane neurony śródmózgowia w hodowli pierwotnej z zarodków myszy (E13.5), które są najtrudniejsze do przygotowania. Warto zauważyć, że udostępniamy protokół wykorzystujący pożywkę hodowlaną bez surowicy w celu uzyskania lepszej odtwarzalności. Dwa najważniejsze etapy przygotowania hodowli (rozbiór i dysocjacja mechaniczna) zostaną szczegółowo opisane w powiązanym filmie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy użyte w tej pracy były pod opieką i traktowane zgodnie z wytycznymi Rady Unii Europejskiej (86/609/UE) dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie wymaganych rozwiązań

  1. Roztwory podstawowe
    1. 10x roztwór poli-L-ornityny (PLO): odważyć 10 mg bromowodorku PLO (masa cząsteczkowa = 30 000-70 000) i rozpuścić w 70 ml sterylnej wody. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. 30% roztwór glukozy: odważyć 30 g D(+)-glukozy i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. 5x Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych Szynka F-12: odważyć 6 g proszku z szynki DMEM/F-12 i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podsycić i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. 7,5% roztwór wodorowęglanu sodu (NaHCO3): odważyć 7,5 g NaHCO3 i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. 1 M roztwór HEPES: Odważyć 23,8 g HEPES i rozpuścić w sterylnej wodzie do całkowitej objętości 100 ml. Przefiltrować, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. 70% (v/v) Etanol: Rozcieńczyć 70 ml absolutnego etanolu w 30 ml sterylnej wody.
  2. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z glukozą i antybiotykami (PBS-GAB): dodać 10 ml 30% roztworu glukozy i 5 ml roztworu penicyliny i streptomycyny do 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami firmy Dulbecco. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Inaktywowana płodowa surowica bydlęca (iFBS): Rozmrażać surowicę bydlęcą przez noc w temperaturze 4 °C i inaktywować w temperaturze 56 °C przez 30 min. Podwielokrotność porcji do 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Pożywka hodowlana: W sterylnej wodzie wymieszać kolejno 40 ml 5x DMEM/F12-Ham, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml 200 mM L-glutaminy, 2 ml penicyliny-streptomycyny, 4 ml 30% glukozy i 3 ml 7,5%NaHCO3 do końcowej objętości 180 ml. Przefiltrować i zużyć tego samego dnia.
  5. Mieszanka hormonów
    1. Przygotować 180 ml pożywki hodowlanej. W tym podłożu rozpuścić 200 mg apo-transferyny.
    2. Odważyć 50 mg insuliny i rozpuścić w 2 ml 0,1 M HCl. Powoli dodawać 8 ml sterylnej wody, delikatnie mieszając. Rozcieńczyć ten roztwór w pożywce hodowlanej.
    3. Odważyć 19,3 mg dichlorowodorku putrescyny i rozpuścić w 10 ml sterylnej wody. Dodać 10 ml roztworu do mieszanki hormonalnej.
    4. Przygotować 3 mM roztwór seleninu sodu w sterylnej wodzie i 2 mM roztwór progesteronu w absolutnym etanolu. Dodaj 20 μl każdego roztworu do mieszanki hormonalnej.
    5. Przefiltrować mieszaninę hormonów, porcjować do 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie płytek i instrumentów hodowlanych

  1. Powlekanie płytek hodowlanych FBS: Dzień przed sekcją należy przygotować 180 ml pożywki hodowlanej. Dodać 10 ml iFBS do 90 ml pożywki hodowlanej. Dodać 300 μl/basenik pożywki hodowlanej/10% iFBS do wstępnie pokrytych poli-D-lizyną 24-dołkowych płytek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Pozostałe podłoża (z iFBS lub bez) przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Wysterylizuj narzędzia i pipety Pasteura. Zbierz sprzęt wymieniony w tabeli materiałów, a także okap z przepływem laminarnym klasy II i inkubator CO2 .

3. Sekcja Mesencephalon myszy

  1. Złóż w ofierze ciężarną mysz E13.5 (zgodnie z wytycznymi instytucji). Oczyść brzuch myszy 70% etanolem i otwórz ścianę brzucha. Zbierz rogi macicy, otwórz je delikatnymi nożyczkami, wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy i usuń błony owodniowe. Umieścić zarodki na szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej sterylny PBS-GAB i umyć je przez przeniesienie w 3 kolejnych identycznych kąpielach za pomocą kleszczy. W celu przeprowadzenia sekcji należy umieścić zarodki w proporcjach 3 na sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm.
  2. Przesuń ostatnią szalkę Petriego pod mikroskop stereoskopowy. Nie ścinaj głów zarodków. Za pomocą nożyczek Vannas wytnij mózgi.
    1. Ostrożnie usuń i wyrzuć przed- i tylne obszary mózgu. Po stronie rostralnej przeciętej blisko obszaru wzgórza, po stronie ogonowej przeciętej w okolicy przesmyku, usuń górny wzgórek.
    2. Po odizolowaniu brzusznego śródmózgowia ostrożnie usuń opony mózgowe za pomocą ultracienkich kleszczy. Zebrać wypreparowane segmenty, bez opon mózgowych, do sterylnej probówki o pojemności 13 ml wypełnionej PBS-GAB.
  3. Wyczyść rurkę zawierającą śródmózgowie dokładnie 70% etanolem i umieść ją pod maską.

4. Dysocjacja komórek

  1. Przemyć śródmózgowie 3x sterylnym PBS-GAB. Pozwól, aby fragmenty mózgu osiadły między każdym myciem i unikaj uszkodzenia tkanki. Po ostatnim płukaniu ostrożnie usunąć jak najwięcej roztworu i inkubować segmenty mózgu w 3 ml trypsyny/EDTA przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
  2. Wypoleruj pipety Pasteura na gorąco, aby zmaksymalizować przeżycie neuronów, ponieważ końcówka pipety z niepolerowanego szkła jest ostra i może uszkodzić komórki podczas etapów dysocjacji. Nieznacznie zmniejsz średnicę końcówki (do 0,5 mm) pipety Pasteura podczas polerowania ogniowego.
  3. Ostrożnie usunąć jak najwięcej roztworu trypsyny/EDTA i dodać 10 ml pożywki hodowlanej/10% iFBS. Umyj segmenty mózgu 3x pożywką hodowlaną/10% iFBS.
  4. Za pomocą wypolerowanej na gorąco pipety Pasteura rozpocząć dysocjację śródmózgowia w 6 ml pożywki hodowlanej/10% iFBS. Rozcierać 10x (unikać pęcherzyków powietrza), pozostawić kawałki do osiadania, a następnie zebrać pożywkę do nowej sterylnej probówki o pojemności 13 ml.
  5. Dodać 6 ml pożywki hodowlanej, powtórzyć poprzedni krok raz i zebrać pożywkę zawierającą zdysocjowane komórki w tej samej probówce o pojemności 13 ml.
  6. Odwirować komórki w stężeniu 160 g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% mieszanką hormonów.

5. Poszycie komórek

  1. Policz komórki w zawiesinie w komórce Malasseza i dostosuj objętość pożywki do stężenia 600 000 komórek/ml. Z jednego śródmózgowia myszy można uzyskać około 1 700 000 komórek.
  2. Usuń pożywkę powlekającą zawierającą FBS z płytek 24-dołkowych i dodaj do każdej studzienki 1 ml zawiesiny komórek (600 000 komórek / studzienkę, 2-4% komórek TH+).
  3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2/95% powietrza. Nie jest konieczna żadna zmiana medium. Neurony dopaminergiczne osiągają dojrzałość po około 5-7 dniach in vitro (stała ekspresja transportera dopaminy). Utrzymuj komórki w hodowli do 15 dni bez wymiany pożywki.

6. Protokół immunofluorescencji

  1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
    1. Dzień przed rozbioru dodać 10 ml 1 M HCl do szalki Petriego. Połóż na powierzchni płynu 12-15 szklanych szkiełek nakrywkowych i odczekaj 15 minut.
    2. Zanurz szkiełko nakrywkowe w płynie i odczekaj 15 minut.
    3. Usuń HCl i przemyj 3x wodą.
    4. Szybko umyj szkiełka nakrywkowe czystym etanolem raz, a następnie dodaj czysty etanol do naczynia i odczekaj 30 minut.
    5. Pod maską usuń oczyszczone szkiełka nakrywkowe z etanolu i dodaj 1 szkiełko nakrywkowe na dołek 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej za pomocą wysterylizowanych kleszczy.
    6. Szkiełka nakrywkowe umyć dwukrotnie sterylną wodą (1 ml/studzienkę). Następnie umyj je raz sterylnym PBS.
  2. Powlekanie szkiełek nakrywkowych
    1. Usunąć PBS i dodać 500 μl/basenik 2x PLO (rozcieńczony w PBS). Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
    2. Usuń roztwór PLO i przemyj 3x sterylnym PBS.
    3. Usunąć PBS i dodać 500 μl/basenik 20% iFBS/1 g/ml Lamininy. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
  3. Posiewanie komórek w celu immunofluorescencji
    1. Usunąć podłoże powlekające z płytek 12-dołkowych.
    2. Dodać 900 000 komórek/studzienkę w objętości 2 ml i hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Komórki mogą być trzymane w hodowli do 15 dni bez wymiany pożywki.
  4. Barwienie immunologiczne
    1. Usunąć podłoże z płytek 12-dołkowych i przemyć 500 μl/studzienkę DMEM podgrzanym w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 500 μl/basenik DMEM podgrzanego w temperaturze 37 °C, następnie delikatnie dodać 160 μl/studzienkę 8% paraformaldehydu (PFA, 2% stężenie końcowe) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Usunąć PFA i przemyć 3x PBS/0,1 M glicyną przez 10 min.
    4. Usunąć PBS, dodać 300 μl/studzienkę PBS/0,05% Triton X-100/20% surowicy koziej i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usunąć pożywkę, dodać 300 μl/studzienkę pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w PBS/0,05% Triton X-100/1% surowicy koziej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przeciwciała pierwszorzędowe, które można wykorzystać do wykrywania neuronów dopaminergicznych i charakterystyki hodowli, są wskazane w tabeli Materiały. Trzymaj 1 studzienkę bez przeciwciał pierwszorzędowych, aby ocenić tło różnych przeciwciał drugorzędowych.
    6. Usunąć podłoże i przemyć 3x żelatyną PBS/0,2% przez 10 min.
    7. Usunąć pożywkę, dodać 300 μl/studzienkę przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w PBS/0,05% Triton X-100/1% surowicy koziej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności. Zastosowane przeciwciała drugorzędowe są wskazane w tabeli Materiały.
    8. Usunąć podłoże i przemyć 3x żelatyną PBS/0,2% przez 10 min.
    9. Usuń podłoże i przemyj 3x PBS.
    10. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach szklanych stroną do dołu w kropli VECTASHIELD. Trzymaj szkiełka w temperaturze pokojowej przez noc, aby podłoże montażowe wyschło, a następnie przechowuj je w temperaturze 4 °C.
    11. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu z kontrastem fazowym wyposażonego w epifluorescencję. Reprezentatywne obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego UV Leica SP2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zilustrowany schemat blokowy etapów hodowli śródmózgowia przedstawiono na Rysunku 1. W skrócie, po pobraniu embrionów E13.5 od ciążnej myszy szwajcarskiej, z całego embrionu wycina się brzuszna część śródmózgowia. Wyizolowane fragmenty mózgu poddaje się kolejno trawieniu enzymatycznemu i dysocjacji mechanicznej. Zdysocjowane komórki są pelletowane przez wirowanie, resuspenderowane w pożywce hodowlanej i wysiewane na uprzednio powlekane płytki 12- lub 24-dołkowe. Komórki utrzymuje się do 15 dni bez wymian...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W protokole tym przedstawiono procedury i odczynniki niezbędne do przygotowania pierwotnej hodowli neuronów śródmózgowia od myszy embrionalnej oraz procedurę immunofluorescencji w celu wykrycia neuronów dopaminergicznych. Krytycznymi etapami procedury są preparacja zarodków i mechaniczna dysocjacja pobranych fragmentów mózgu. Wysokiej jakości narzędzia preparacyjne pomagają opanować technikę preparacji. Neurony DA stanowią niewielką część śródmózgowia. W związku z tym pobranie prawej części brzusznego śródmózgowia jest n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wspierane przez granty z CNRS i INSERM. Premier dziękuje za wsparcie ze strony Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC dziękuje za wsparcie ze strony Fondation de France.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Surowica bydlęcapłodu Lonza14-801F
DMEM 4,5 g/L glukozy z L-glutaminąLonzaBE12-604F
0,05% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowaLife Technologies25300-054
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Life Technologies15140122
L-glutamina, roztwór 200 mMTechnologieżycia
Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-Aldrich D8537
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 SzynkaSigma-Aldrich D0547Proszek
Laminin - 1 mg/ml w buforowanym Tris NaClSigma-Aldrich L2020
Bromowodorek poli-L-ornitynySigma-Aldrich P3655
Insulina z trzustki świniSigma-Aldrich I5523
apo-Transferyna ludzkaSigma-Aldrich T1147
Dichlorowodorek putrescynySigma-Aldrich P5780
ProgesteronSigma-Aldrich P8783
Selenin soduSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlicynaSigma-Aldrich G7126Roztwór podstawowy 1 M w wodzie
ŻelatynaSigma-Aldrich G9391Roztwór podstawowy 2% (w/v) w wodzie
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldehyd 16% w wodzieMikroskopia elektronowa SciencesRT 15710-S
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-glukoza, monohydratMerck Millipore4074-2
Kwas solny - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Sterylna woda - Aqua B. BraunBraun
Absolutny etanol NORMAPUR odczynnik analitycznyVWR20821.321
Sterylne szalki PetriegoVWR82050-566
Pipety Pasteura ze szkła zwykłego - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Komora zliczająca MalassezVWR631-0975
Filtr strzykawkowy Acrodisc do surowicy z membraną Supor, sterylny, GF/0,2 i mikro; m, 37 mmPALL Life science4525
Nożyczki chirurgiczne - proste, ostro-ostre, o długości 14,5 cmNarzędzia do14002-14Do otwierania ściany brzucha
Nożyczki - Proste, spiczaste, delikatne, o długości 10 cmMORIA4877ADo otwierania ściany macicy
Kleszcze - Zakrzywione, zwykłe, ząbkowane szczęki 1 mmMORIA2183Do manipulowania zarodkami
Nożyczki Vannas - Zakrzywione, spiczaste, ostrza 7 mmMORIAMC50Do wyjmowania śródmózgowia
Ultra cienkie kleszcze - Zakrzywione, delikatne, o długości 13 cmMORIA9987Do usuwania opon
mózgowych BD BioCoat Poli-D-Lizyna 24-dołkowe płytki wielodołkoweBD Bioscience356414
BD Falcon 12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych, płaskie dno z pokrywkąBD Bioscience353043
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost, szlifowane krawędzie 90ºMENZEL-GLÄ SERAG00008032E
Precyzyjne szkła nakrywkowe o grubości nr 1,5H okrągłe 18 mm i Oslash;MARIENFELD117580
Poliklonalne przeciwciało przeciwko białku 2 związanemu z mikrotubulami królika (MAP2)Chemicon MilliporeAB56221/200
Monoklonalne mysie przeciwciało antyglutaminianu dekarboksylazy (GAD67), klon 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Monoklonalne szczurze przeciwciało antydopaminowe (DAT), klon DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
Monoklonalne mysie przeciwciało1/8,000 - Hojny prezent od Yves Charnay (Szwajcaria, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Kozia surowica, Nowa Zelandia OriginLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Kozia przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)Life TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA-110011/1,000
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Anti-Rat AntibodyLife TechnologiesA-110071/1,000
VECTASHIELD HardSet Medium montażoweVector LaboratoriesH-1400
Mikroskop stereoskopowyCarl Zeiss PalnikStemi-2000C
FIREBOYVWR451-0136
25030123 nauki anty-5-HT Bunsena

Bibliografia

  1. Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
  2. Iversen, S. D., Iversen, L. L. Dopamine: 50 years in perspective. Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).
  3. Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
  4. Chinta, S. J., Andersen, J. K. Dopaminergic neurons. Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).
  5. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  6. Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
  7. Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. Parkinson's disease. Lancet. 363, 1783-1793 (2004).
  8. Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
  9. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
  10. Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
  11. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
  12. Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
  13. Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
  14. Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
  15. Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. Pathogenesis of Parkinson's disease. Mov Disord. 28, 24-30 (2013).
  16. di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
  17. Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
  18. Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
  19. Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
  20. Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
  21. Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
  22. Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
  23. Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
  24. Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
  25. Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
  26. Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
  27. Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
  28. Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
  29. Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
  30. Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  31. Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
  32. Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
  33. Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
  34. Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
  35. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
  36. Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zarodekowy mózg myszysekcja śródmózgowiadysocjacja enzymatycznadysocjacja mechanicznabarwienie immunofluorescencyjnehydroksylaza tyrozynowawysiew komórekpożywka hodowlana
Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.