Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51983

⸱

12 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

Migracja neuronów jest regulowana przez liczne czynniki autonomiczne i nieautonomiczne komórki. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać elektroporację in utero do określenia, czy fenotyp u myszy transgenicznej jest spowodowany zakłóceniem wewnętrznego mechanizmu komórki lub upośledzeniem interakcji między neuronem a jego środowiskiem.

Streszczenie

Delecjonowanie genetyczne za pomocą systemu Cre-Lox w transgenicznych liniach myszy jest potężnym narzędziem używanym do badania funkcji białek. Jednakże, z wyjątkiem bardzo specyficznych modeli Cre, delecja białka w całej populacji tkanek lub komórek często prowadzi do złożonych fenotypów wynikających z wielu oddziałujących mechanizmów. Ustalenie, czy fenotyp wynika z zakłócenia autonomicznego mechanizmu komórki, który jest nieodłączny od danej komórki, czy też z nieautonomicznego mechanizmu niekomórkowego, który wynikałby z upośledzenia środowiska tej komórki, może być trudne do rozpoznania. Aby uzyskać wgląd w funkcję białka w kontekście in vivo, elektroporacja in utero (IUE) umożliwia delecję genów w niewielkim podzbiorze komórek w rozwijającej się korze mózgowej lub innym wybranym regionie mózgu. IUE może być używany do celowania w określone obszary mózgu, w tym kresomózgowie grzbietowe, kresomózgowie przyśrodkowe, hipokamp lub wyniosłość zwojową. Ułatwia to obserwację konsekwencji autonomicznej delecji genów w kontekście zdrowego środowiska. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób IUE może być wykorzystany do analizy defektu migracji radialnej w transgenicznej linii myszy floksowej, z naciskiem na rozróżnienie między autonomicznymi i nieautonomicznymi komórkami efektów delecji białka. Porównując fenotyp wynikający z delecji genu w całej korze z delecją genu za pośrednictwem IUE w ograniczonej populacji komórek, można uzyskać lepszy wgląd w funkcję białka w rozwoju mózgu niż przy użyciu którejkolwiek z tych technik w izolacji.

Wprowadzenie

Migracja promieniowa jest centralnym procesem wczesnego rozwoju kory mózgowej. Zależy to od różnych czynników autonomicznych komórki, takich jak prawidłowe wyjście mitotyczne i różnicowanie neuronów, polaryzacja komórek, regulacja dynamiki cytoszkieletu i ekspresja receptorów transbłonowych, a także czynniki autonomiczne dla komórek, takie jak tworzenie promienistego rusztowania glejowego i wydzielanie migrujących cząsteczek naprowadzających1-3. Ponieważ zakłócenie któregokolwiek z tych mechanizmów może upośledzać migrację neuronów w transgenicznym modelumyszy 4-8, określenie podstawowej przyczyny defektu migracji może być złożonym i trudnym procesem. Elektroporacja in utero (IUE) może być wykorzystana do uzupełnienia i uproszczenia interpretacji fenotypu genetycznego modelu nokautu, a tym samym do wyjaśnienia ważnych mechanizmów wymaganych do migracji radialnej7,9-11.

Elektroporacja in utero (IUE) to proces, w którym plazmid przenoszący zarówno interesujący gen, jak i reporter jest wstrzykiwany do komory w mózgu zarodka myszy lub szczura, a następnie wciągany do komórek wyściełających komorę za pomocą prądu elektrycznego12-14. Dzięki temu badacz może przeanalizować wpływ regulacji w górę lub w dół interesującego genu na rozwój lub funkcję neuronów elektroporowanych. Po IUE mózgi mogą być przetwarzane pod kątem immunohistochemii 7,9-11, elektrofizjologii 15 lub hodowli komórkowej 16,17. Główną zaletą IUE jest to, że pozwala na wysoce specyficzną manipulację ekspresją genów. Co więcej, IUE może być używany do celowania w określony obszar rozwijającego się mózgu za pomocą ukierunkowanego prądu (ryc. 2). IUE może być również stosowany do celowania w określony typ komórek poprzez wstrzykiwanie plazmidów przenoszących geny pod kontrolą różnych promotorów lub systemów aktywacji plazmidów (przykładem jest ekspresja genów indukowana tetracykliną) 10,18-21.

IUE może być używane w połączeniu z systemem wycinania genów za pośrednictwem Cre-Lox 7-9,11,22. Plazmid zawierający gen kodujący wiadomość dla białka Cre może być elektroporowany do zarodka homozygotycznego pod względem floksowanego allelu (w którym gen lub specyficzne regiony DNA są otoczone dwoma miejscami loxP dla rekombinacji DNA za pośrednictwem Cre). Cre następnie indukuje rekombinację genu będącego przedmiotem zainteresowania, szczególnie w elektroporowanych prekursorach neuronalnych, generując nokaut floksowanego allelu. Następnie można badać wpływ knockdownu białek na migrację i rozwój neuronów w obrębie poszczególnych neuronów. Elektroporacja Cre indukuje rekombinację tylko w niewielkiej populacji dotkniętych komórek, pozostawiając nienaruszone środowisko nośne. W przeciwieństwie do tego, specyficzna tkankowo ekspresja Cre pod kontrolą promotora specyficznego dla typu komórki zachodzi w całej tkance, tak że może to mieć wpływ zarówno na migrujące neuroblasty, jak i otaczające środowisko. Tak więc zestawienie tych dwóch podejść może określić, czy dana wada migracyjna jest spowodowana mechanizmami autonomicznymi komórkami, czy nieautonomicznymi komórkami. Wadliwa migracja w obu systemach eksperymentalnych sugeruje, że obserwowany fenotyp wynika z autonomicznego mechanizmu komórki; normalna migracja po elektroporacji Cre z wadliwą migracją w specyficznym dla tkanki modelu Cre wskazuje, że gen będący przedmiotem zainteresowania działa poprzez autonomiczny mechanizm niekomórkowy.

IUE może być również używane do przeprowadzania eksperymentów ratunkowych poprzez elektroporację potencjalnie oddziałujących genów na nokautujących zwierzętach 7,9,10. Na przykład, badacz może próbować uratować fenotyp migracji w modelu transgenicznym poprzez elektroporację celu i określenie, czy defekt migracji jest korygowany w neuronach poddanych elektropostacji. Ma to dodatkową zaletę, że udana akcja ratunkowa wskazuje, że normalna migracja może zostać przywrócona poprzez manipulowanie ekspresją białka w określonym neuronie, nawet jeśli otaczające środowisko jest nadal niewystarczające dla docelowego genu. Ponownie, podejście to jest bardziej efektywne czasowo i kosztowo niż krzyżowanie lub generowanie linii transgenicznych, z dodatkową korzyścią w postaci określenia, czy wadliwy mechanizm jest autonomiczny dla komórek.

IUE może być używane do śledzenia migrujących neuronów poprzez elektroporację plazmidu reporterowego do wybijanych zarodków (Rysunek 4C). Ponieważ tylko neurony wyściełające komorę w czasie operacji są elektroporowane 17, IUE może być używany do śledzenia neuronów urodzonych w określonym czasie z korzyścią wizualizacji ich morfologii in vivo.

Wreszcie, możliwe jest użycie IUE do celowania w obszary mózgu, takie jak kresomózgowie przyśrodkowe lub grzbietowe, hipokamp lub wyniosłość zwojowa (Rysunek 2). Daje to naukowcom możliwość badania funkcji genów w określonym obszarze niezależnie od powikłań wynikających z knockdownu białek w sąsiednich strukturach.

Białko siatkówczaka (pRb), p107 i p130 stanowią rodzinę białek kieszonkowych i są dobrze znanymi regulatorami wyjścia z cyklu komórkowego. Istnieje jednak coraz więcej dowodów na to, że białka te regulują również niezależne od cyklu komórkowego aspekty rozwoju neuronalnego. Jak wykazaliśmy wcześniej, pRb i p107 odgrywają kluczową rolę zarówno w migracji stycznej 4,23, jak i radialnej 6. W tym miejscu pokazujemy rolę członków rodziny białek kieszonkowych pRb i p107 w migracji neuronalnej 6, aby zilustrować zastosowanie elektroporacji Cre w macicy w modelu transgenicznym. Podsumowując, IUE zapewnia potężny sposób analizy autonomicznych efektów delecji genów (lub nadekspresji) komórek. W połączeniu z modelami nokautu specyficznymi dla tkanki, IUE może dostarczyć dodatkowych informacji na temat mechanizmów kontrolujących migrację neuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie i materiały przedoperacyjne

  1. Przygotowanie plazmidu:
    1. Przygotuj plazmidy za pomocą Qiagen MegaPrep zgodnie z protokołem producenta. Zaintruj co najmniej 400 ml bulionu LB przekształconymi bakteriami, aby zapewnić wysoką wydajność DNA i inkubuj przez noc.
    2. Zawiesić plazmid w 100-200 μl TE do końcowego stężenia co najmniej 5 μg/μl. Podwielokrotność DNA i przechowywać w temperaturze -20 °C. Jeśli stężenie jest zbyt niskie, nie wytrącaj i nie zawieszaj ponownie, ponieważ może to spowodować dodanie zanieczyszczeń. Zacznij od nowa z nowym preparatem.
    3. Przed zabiegiem należy rozcieńczyć pojedynczy plazmid (na przykład Cre-GFP) do 2 μg/μl w sterylnej wodzie z 1 μl 0,1% (w/v) barwnika Fast Green na 10 lub 20 μl rozcieńczonego roztworu plazmidu. Jeśli GFP i gen będący przedmiotem zainteresowania mają być elektroporowane na oddzielnych plazmidach, wstrzyknij plazmid GFP i plazmid przenoszący gen będący przedmiotem zainteresowania w stosunku 1:4, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo, że wszystkie komórki oznaczone GFP są koelektroporowane z obydwoma plazmidami.
  2. Wyciągnąć szklane rurki mikrokapilarne (średnica zewnętrzna 1 mm - zwane dalej igłami) za pomocą standardowego ściągacza igłowego, używając jednostopniowego pociągnięcia w temperaturze 62 °C.
  3. Autoklaw zestaw chirurgiczny zawierający następujące elementy: uchwyty do igieł, zwijacz rany, kleszcze, nożyczki do operacji, nożyczki do igieł, zszywacz, zszywki, gaza, osłony ran, obłożenia chirurgiczne (ryc. 1A, B; Tabela materiałów).
  4. Zbierz inne potrzebne narzędzia: Elektroporator, Mikroiniektor Femtojet, Pęseta (5 lub 7 mm), sól fizjologiczna, szew, strzykawka 5 ml (Tabela materiałów).

2. Przygotuj mysz do operacji

  1. W celu złagodzenia bólu należy wstrzyknąć myszom w ciąży w ciąży buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała) na godzinę przed zabiegiem. Zastosuj ten protokół do myszy, których czas trwał od 12,5 dnia embrionalnego (E12,5) do E17,5.
  2. Użyj końcówek do pipet z mikroładowarką, aby ponownie załadować ciągnięte igły roztworem plazmidu. Nie należy jeszcze napełniać igły do końca, ponieważ spowoduje to zatkanie igły.
  3. Znieczulić mysz za pomocą 2-5% gazu izofluranowego o stężeniu 1 l/minO2. Po unieruchomieniu umieść maskę na twarz i nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Wstrzyknąć 1 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) podskórnie w plecy.
    UWAGA: Podczas pracy z gazem izofluranowym należy użyć pochłaniacza gazu, aby wychwycić nadmiar gazu i zapobiec jego ucieczce do pomieszczenia.
  4. Ogolić brzuch. Umyj brzuch peelingiem chloroheksadynowym, spłucz wodą i nałóż końcowy roztwór przygotowawczy z chloroheksadyny i 70% etanolu. Przykryj mysz sterylną serwetą lub gazą, aby przykryć futro, ale pozostaw odsłonięty brzuch (ryc. 1C, D).

3. Elektroporacja in utero

  1. Wykonaj nacięcie w skórze nad brzuchem między dolnymi strzykami. Odciągnij skórę od leżącej pod spodem warstwy mięśniowej, rozrywając tkankę łączną, a następnie przetnij otrzewną do jamy brzusznej wzdłuż kresy białej. Włóż zwijacz rany, aby rozsunąć krawędzie rany.
  2. Wyjmij macicę z jamy brzusznej i ułóż ją, jak pokazano (ryc. 1E).
    1. Jeśli różne młode mają zostać wstrzyknięte z różnymi plazmidami (np. GFP vs. GFP z genem będącym przedmiotem zainteresowania), policz młode z każdej strony i zdecyduj, które z nich i ile wstrzyknąć z każdym plazmidem. Zamień jedną stronę macicy z powrotem do brzucha, aby zarodki były ciepłe i nasmarowane. Odsłoniętą macicę należy natychmiast zwilżyć solą fizjologiczną (najlepiej podgrzaną do temperatury ciała).
    2. W przypadku wstrzykiwania wszystkim szczeniętom tego samego plazmidu (np. podczas wstrzykiwania Cre-GFP do transgenicznych zarodków) należy usunąć tylko jeden róg macicy na raz.
  3. Umieścić obciążoną igłę w uchwycie różdżki iniekcyjnej i ostrożnie odciąć końcówkę małymi nożyczkami chirurgicznymi lub cienkimi kleszkami. Przeciąć końcówkę tak, aby igła pozostała tak długa, jak to możliwe, jednocześnie umożliwiając przepływ płynu (Rysunek 1Ji-iv).
    1. Dostosuj długość wstrzyknięcia (w sekundach) i ciśnienie wtrysku na mikrowtryskiwaczu tak, aby mała, ale łatwo widoczna kropla o stężeniu 0,1-0,2 μl pojawiła się na końcu igły po naciśnięciu podkładki stopy. Utrzymuj objętość tej kropli tak równomiernie, jak to możliwe między różnymi igłami.
      UWAGA: ten etap ma kluczowe znaczenie dla przeżycia zarodka (patrz dyskusja).
    2. Dla Femtojet należy stosować następujące parametry wtrysku: ciśnienie wtrysku (pi) = 250-300 hPa; czas wtrysku (ti) = 0,8-1,2 sek; ciśnienie kompensacyjne = 10-50 hPa. W razie potrzeby dostosuj te parametry, aby uwzględnić różnice między igłami.
  4. Wybierz zarodek i delikatnie ułóż go na plecach, z głową pochyloną do góry (ryc. 1F).
    UWAGA: Może to wymagać obrócenia lub przesunięcia zarodka; Należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku i unikać pęknięcia worka owodniowego podczas manipulowania zarodkiem.
  5. Gdy zarodek znajdzie się na miejscu, zlokalizuj komorę, która przedstawia się jako cień w kształcie półksiężyca równoległy do zatoki strzałkowej. Przyłóż końcówkę igły do macicy nad komorą pod niewielkim kątem i przeprowadź igłę przez ścianę macicy. Wymagana siła nacisku zależy od ostrości igły. Wbić igłę przez korę do komory.
    UWAGA: Chociaż rzadko występuje dodatkowy wykrywalny opór, głowa zarodka jest często lekko odsuwana, a następnie cofa się, gdy igła przechodzi przez korę do komory.
  6. Napompuj łopatkę nożną, aby wstrzyknąć roztwór plazmidu. Kontynuuj pompowanie, aż pojawi się zielony obszar, który dostosuje się do kształtu łuku komory (ryc. 1G). U młodych zarodków (E12,5 do E14,5) barwnik często dyfunduje do przeciwległej komory.
    UWAGA: Liczba pompek zależy od średnicy końcówki igły, wieku zarodka (i wynikającej z niego wielkości komory) oraz pożądanej objętości wstrzyknięcia. Utrzymuj jak najbardziej stałą objętość wstrzykniętych zarodków.
  7. Wstrzyknąć trzy lub cztery zarodki. Utrzymuj wszystkie odsłonięte zarodki wilgotne solą fizjologiczną przez cały czas trwania zabiegu.
  8. Wróć do pierwszych wstrzykniętych zarodków i umieść łopatki tak, aby elektroda dodatnia wciągnęła plazmid do pożądanego obszaru mózgu (ryc. 1H). Ustawić elektrodę ujemną pod takim kątem, aby najkrótsza droga między elektrodami przechodziła bezpośrednio przez strukturę przeznaczoną do elektroporacji (rysunek 2).
  9. Gdy łopatki znajdą się na miejscu, zastosuj amortyzator. W zależności od wieku i wielkości zarodków należy zastosować 5 impulsów o napięciu 35-50 V (patrz Tabela 1). Należy zastosować następujące parametry elektroporacji: długość impulsu 5 ms z interwałem impulsu 950 ms. Powtórzyć tę czynność ze wszystkimi wstrzykniętymi zarodkami.
  10. Odetnij końcówkę nowej, wstępnie załadowanej igły, jak w kroku 3.3, ponieważ ostatnia igła prawdopodobnie wyschła i zatkała się w kroku 3.9. Wstrzyknąć następny zestaw trzech lub czterech zarodków z tym samym lub innym plazmidem, a następnie zastosować wstrząs, jak w kroku 3.9. Kiedy wszystkie młode po jednej stronie macicy zostaną wstrzyknięte, usuń drugą stronę macicy z brzucha samicy, a następnie wymień gotową stronę, aby utrzymać ją w cieple.
  11. Zwróć obie strony macicy do samicy, uważając, aby powierzchnia była wilgotna solą fizjologiczną i nie wywierała zbyt dużego nacisku, aby zapobiec urażeniu worków owodniowych. Zszyj warstwę mięśniową zamkniętą za pomocą prostego ciągłego ściegu. Zszyj skórę zszywką. Jeśli zszywki nie są dostępne, zszyj skórę prostym przerywanym szwem. (Rysunek 1I)
  12. Podczas szycia stopniowo zmniejszaj dawkę izofluranu, aby znieczulenie ciężarnej kobiety uległo znieczuleniu.
    UWAGA: Przyspieszy to pobudzenie matki po zakończeniu operacji; Utrzymywanie samicy w znieczuleniu przez jak najkrótszy czas poprawi przeżywalność zarodka. Całkowity czas operacji, licząc od momentu pierwszego znieczulenia kobiety, powinien wynosić około 30 minut.

4. Opieka po leczeniu

  1. Umieść zszytą samicę w inkubatorze lub na poduszce grzewczej, aby wyzdrowiała ze znieczulenia. Ułóż ją na czystej pościeli i umieść standardowy żel regeneracyjny w klatce, aby utrzymać nawodnienie. W celu leczenia bólu po zabiegu chirurgicznym należy podać kobiecie trzy dawki buprenorfiny (0,05 mg/kg masy ciała) w odstępach 8 godzin po operacji, a następnie cztery dodatkowe dawki w odstępach 12-godzinnych.

5. Zbieranie mózgów

UWAGA: Mózgi mogą być zbierane w każdym wieku, aż do dorosłości. Poniższe zasady dotyczą pobierania mózgów przed urodzeniem. Należy pamiętać, że po urodzeniu szczeniąt porządek w macicy zostaje utracony, więc albo każde szczenię w miocie musi zostać wstrzyknięte tym samym plazmidem, albo należy opracować inną metodę rozróżniania między zwierzętami kontrolnymi a doświadczalnymi.

  1. Przygotuj zimny (4 °C), przefiltrowany 4% paraformaldehyd (PFA) przed eutanazją samic.
  2. Poddać samicy eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu (100 mg/kg masy ciała) i rozciąć brzuch. Wyciągnij obie strony macicy i ułóż tak, jak wtedy, gdy młode zostały początkowo wstrzyknięte.
    1. W przypadku, gdy wszystkie młode otrzymały ten sam plazmid, na przykład podczas wstrzykiwania Cre do transgenicznego miotu, kolejność zarodków nie jest ważna, dlatego wyciąć macicę z samicy i umieścić w PBS.
    2. Jeśli szczeniętom wstrzyknięto różne plazmidy, należy zlokalizować każde szczenię, zwracając uwagę na martwe szczenięta i określić, którym z nich wstrzyknięto plazmidy kontrolne i eksperymentalne przed usunięciem macicy od samicy. Uważaj, aby śledzić, które młode należy do której grupy po tym, jak macica znajduje się w PBS.
  3. Usuń każde szczenię z osobna, odetnij głowę ostrymi nożyczkami lub żyletką i umieść głowę w PBS. W przypadku myszy transgenicznych należy pobrać próbki tkanek do genotypowania i trzymać każdą głowę oddzielnie, na przykład na płytce 12-dołkowej.
  4. Pod lunetą sekcyjną usuń mózg z czaszki, uważając, aby nie naciąć kory ani nie rozerwać linii środkowej. Używając mikroskopu fluorescencyjnego, sprawdź, czy mózgi mają plaster GFP+, wskazujący, że zostały pomyślnie elektroporowane.
  5. Napraw mózg przez zanurzenie w PFA w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Sprawdź mózgi pod kątem ekspresji GFP przed fiksacją, ponieważ PFA często gasi sygnał.
  6. Cryoprotect mózgi poprzez zanurzenie w 20% sacharozie na co najmniej trzy dni przed zamrożeniem. Użyj gradientu sacharozy 10%, 15% i 20% (24 godziny w każdym roztworze), aby zapobiec uszkodzeniom tkanek spowodowanym ciśnieniem osmotycznym. Zamrożone mózgi należy przechowywać w temperaturze -80 °C i ciąć na kriostacie w odcinkach o grubości 10-14 μm.

6. Współbarwienie za pomocą anty-GFP

UWAGA: Jeśli konieczne jest pobranie antygenu w celu jednoczesnego barwienia z anty-GFP, ważne jest, aby użyć łagodnego protokołu odzyskiwania antygenu, który nie narusza sygnału GFP. Niektóre protokoły pobierania antygenu są zbyt surowe, aby można je było stosować w połączeniu z barwieniem GFP (nawet z przeciwciałem przeciwko GFP). Wstępna obróbka podstawowym kwasem cytrynowym przed zastosowaniem przeciwciała pierwszorzędowego jest skuteczna w przypadku większości epitopów 24.

  1. Przygotować 0,01 M roztwór kwasu cytrynowego w ddH2O. pH do 6 za pomocą skalibrowanego pH-metru.
  2. Podgrzej kwas cytrynowy w komorze barwienia w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej, aż kwas cytrynowy osiągnie temperaturę 75-80 °C. Umieść szkiełka w komorze barwienia na 10-15 minut. Utrzymuj temperaturę tak stabilną, jak to możliwe.
  3. Myć szkiełka w PBS 3x przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Zastosuj przeciwciało pierwszorzędowe i kontynuuj barwienie immunologiczne zgodnie ze standardowym protokołem.
  4. Walidacja wycięcia za pośrednictwem Cre poprzez wspólne znakowanie GFP i genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu potwierdzenia knock down (ryc. 3A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Różne obszary mózgu można poddać elektroporacji poprzez zmianę orientacji elektrod płatowych nad głową zarodka (Rysunek 2). W przypadku wszystkich części przedmózgowia plazmid wstrzykuje się do komory bocznej (do tylnomózgowia można dotrzeć, wstrzykując go do komory czwartej). Generalnie należy umieścić elektrody tak, aby linia prosta między nimi przechodziła przez obszar zainteresowania, przy czym DNA jest przyciągane w stronę elektrody dodatniej. Aby skierować działanie na korę boczną (Rysunek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dwa z głównych wyzwań związanych z wykonywaniem elektroporacji in utero to: 1) zapobieganie śmiertelności zarodków oraz 2) zmniejszanie zmienności między elektroporacjami. Jednym z najważniejszych czynników zapobiegających śmiertelności jest jakość igieł, ponieważ igły powodują większe uszkodzenia zarodka. Podczas nacinania igły należy trzymać końcówkę tak długo, jak to możliwe, jednocześnie pozwalając, aby po pompowaniu łopatki nożnej pojawiła się widoczna kropla 0,1-0,2 μl płynu (Rysunek 1J). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Pierre'owi Mattarowi i Fredzie Miller za ich pomoc przy elektroporacji in utero oraz Noelowi Ghanemowi i Bensun Fongowi za tworzenie diagramów. Dziękujemy Lindzie Jui i Jasonowi G. MacLaurinowi za doskonałą pomoc techniczną. Sprzęt został wsparty przez Centrum Rehabilitacji po Udarze Mózgu.

Ta praca była wspierana przez stypendium od HSFO i OGS dla D.S.S. oraz grant CIHR dla R.S.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elektroporator prostokątny ECM 830Aparat BTX Harvard45-0052Tylko elektroporator – kup osobno (45-0204)
1250FS Przełącznik nożny do ECM 830BTX Aparat Harvard45-0211Łopatka nożna jest niezbędna do elektroporacji bez użycia rąk
PęsetyBTX AparatHarvard45-0489 (5mm)                45-0488 (7mm)Platynowe elektrody kleszczowe
FemtojetEppendorf920010504Chwytak do mikroiniektorów
0Eppendorf920007414Trzyma ciągniętą igłę
Uniwersalny uchwyt kapilarnyEppendorf920007392Łączy chwytak z
rurką Rurka iniekcyjnaEppendorf920007431Łączy uchwyt kapilarny z Femtojet
Sterownik nożnyEppendorf920005098Łopatka nożna do wstrzykiwania bez użycia rąk
Końcówki do mikroładowarekEppendorf930001007Końcówki do ładowania ciągniętych rurek kapilarnych
Plasmid Mega KitQiagen121815 QIAGEN-tip 2500, odczynniki,
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252-5GNietoksyczny barwnik
Extra Fine Nożyczki BonnFine Science Tools14084-08Do przycinania igieł
Bonn Zez NożyczkiFine Science Tools14084-09
Kleszcze GraefeFine Science Tools11050-10Proste
zwijacze ColibriFine Science Tools17000-03
ZszywaczFine Science Tools12031-07Do klipsów
7mmCastroviejo Uchwyt igłyNarzędzia medyczneSNH-6737Prosty, z blokadą
Ściągacz do igiełNarishigePC-10Do wyciągania mikrokapilar
MikrokapilaryDrummond1-000-8000,4 mm szklane rurki kapilarne o średnicy wewnętrznej

Bibliografia

  1. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
  2. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
  3. Wu, Q., et al. The dynamics of neuronal migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).
  4. McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
  5. Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
  6. Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
  7. Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
  8. Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
  9. Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
  10. Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
  11. Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
  12. De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
  13. Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  14. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  15. Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
  16. Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).
  17. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  18. Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  19. Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 Forthcoming.
  20. Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
  21. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, Suppl 1. 120-125 (2009).
  22. Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. targeting in mice: a review. Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).
  23. Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
  24. Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
  25. Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
  26. Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 Forthcoming.
  27. Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System Cre Loxautonomiczno kom rkowabrak autonomiczno ci kom rkowejmigracja radialnaelektroporacja przedm zgowiareporter GFP
Indukcja delecji białka poprzez elektroporację in utero w celu zdefiniowania deficytów w migracji neuronów w modelach transgenicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.