Artykuł metodologiczny

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

55.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52099

⸱

20 listopada 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neurobiology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 2Division of Developmental Biology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 3Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh, 4Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Streszczenie

Pod koniec lat siedemdziesiątych po raz pierwszy publicznie zgłoszono użycie western blot, techniki oceny obecności i względnej obfitości określonych białek w złożonych próbkach biologicznych. Od tego czasu metodologia western blotting stała się powszechnym składnikiem eksperymentalnego repertuaru biologów molekularnych. Pobieżne przeszukanie PubMed przy użyciu terminu "western blot" sugeruje, że do roku 2014 ponad dwieście dwadzieścia tysięcy opublikowanych manuskryptów korzystało z tej techniki. Co ważne, w ciągu ostatnich dziesięciu lat nastąpił postęp techniczny w zakresie obrazowania w połączeniu z opracowaniem czułych etykiet fluorescencyjnych, które poprawiły czułość i zapewniły jeszcze większy zakres detekcji liniowej. Rezultatem jest teraz naprawdę kwantyfikowalny Western Blot oparty na fluorescencji (QFWB), który pozwala biologom przeprowadzać porównawczą analizę ekspresji z większą czułością i dokładnością niż kiedykolwiek wcześniej. Istnieje wiele "zoptymalizowanych" metodologii western blotting, które są stosowane w różnych laboratoriach. Często okazują się one trudne do wdrożenia ze względu na wymóg subtelnych, ale nieudokumentowanych zmian proceduralnych. Protokół ten zawiera wyczerpujący opis uznanej i niezawodnej metody QFWB, wraz ze strategiami rozwiązywania problemów.

Wprowadzenie

Western blotting (WB) to technika analityczna pierwotnie opracowana pod koniec lat siedemdziesiątych w celu określenia obecności lub braku interesującego białka w złożonej próbce biologicznej, takiej jak homogenat tkankowy1. Metodologia, powszechnie nazywana immunoblotem białkowym, ze względu na kluczową interakcję przeciwciało-antygen, składa się z 5 odrębnych etapów: 1) elektroforetycznego rozdzielania białek przez ich punkt izoelektryczny; 2) przenieść do membrany nitrocelulozowej lub polifluorku winylidenu (PVDF); 3) znakowanie przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała specyficznego dla białka będącego przedmiotem zainteresowania; 4) inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym skierowanym przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu; oraz 5) wizualizacja.

Metodologia wizualizacji ewoluowała z czasem, aby poprawić bezpieczeństwo i czułość. Niektóre z pierwszych balansów bieli przeprowadzono przy użyciu znaczników znakowanych radiowo, które następnie przeszły do metod kolorymetrycznych, a następnie szerzej stosowanych metod cheluminescencyjnych (ECL). Radioaktywność była bezpośrednio znakowana na sondach pod kątem określonych antygenów, podczas gdy metodologie kolorymetryczne i ECL wykorzystują technikę pośredniego znakowania za pomocą reportera enzymu, takiego jak fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa streptawidyny (HRP)2. Intensywność znakowania produktu chromagenowego lub luminescencyjnego mierzy się za pomocą densytometrii, przy czym siła sygnału, silna lub słaba, wskazuje mniej więcej na obecność białka będącego przedmiotem zainteresowania w próbce. ECL jest bardziej czułą i dlatego preferowaną metodologią2, ale wszystkie 3 metody zostały początkowo opracowane na kliszy rentgenowskiej, a następnie ustalono bardziej wyrafinowane techniki obrazowania cyfrowego3. Postęp w cyfrowym obrazowaniu WB nie tylko pozwolił badaczowi określić obecność lub brak interesującego go białka, ale także pozwolił na wnioskowanie o poziomie ekspresji wybranego białka w porównaniu z innymi próbkami i dlatego może być określany jako "półilościowy". Niedawno opracowano prawdziwie ilościową i bardziej czułą technologię western blotting, w której mierzony poziom fluorescencji jest bezpośrednio związany z ilością i ekspresją pojedynczego białka w próbce: ilościowy fluorescencyjny western blotting (QFWB).

Porównując QFWB z znakowaniem ECL, użycie fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego generuje liniowy profil wykrywania4. Jest to przeciwieństwo technik ECL, w których liniowość sygnału występuje na ogół przy niskich ładunkach białka poniżej 5 μg i nasyceniu sygnału bezpośrednio związanym z ekspresją białka, tj. z wszechobecną ekspresją genów porządkowych5,6. Rozbieżność ta jest najprawdopodobniej spowodowana większą liczbą miejsc wiązania dostępnych dla substratu ECL awidyny w celu związania się z biotynylowanym wtórnym, co skutkuje większym prawdopodobieństwem potencjalnego nasycenia sygnału. Jest to jeden z głównych powodów, dla których immunoblotty ECL określa się jedynie jako "półilościowe"7. Punkt nasycenia sygnału ma kluczowe znaczenie przy pomiarze subtelnych różnic w poziomach ekspresji i może prowadzić do niedokładnych pomiarów. W ostatnich latach pojawienie się szeroko rozpowszechnionych technik proteomicznych, szczegółowo opisujących coraz większą czułość i identyfikację subtelnych różnic w ekspresji, spowodowało coraz większe poleganie na prawdziwie ilościowym western blot w eksperymentach walidacyjnych8,9. Kluczowe znaczenie ma zatem zastosowanie wrażliwej, solidnej i prawdziwie ilościowej metodyki.

Wiele "zoptymalizowanych" metodologii western blotting zostało wykorzystanych przez niezależne laboratoria, które często okazują się trudne do skonfigurowania lub powtórzenia z powodu subtelnych zmian metodologicznych, które mogą nie być widoczne w formalnie udokumentowanych protokołach. Jest to sprawdzony i solidny protokół dla QFWB, a dodatkowo zapewnia cenne strategie rozwiązywania typowych problemów, które mogą pojawić się podczas implementacji.

Ten protokół został pierwotnie zoptymalizowany do użytku z homogenatami mózgu myszy, ale od tego czasu jest skutecznie stosowany w szerokim zakresie próbek tkanek i gatunków4,9,10. Uwzględniono potencjalne warianty protokołu wymagane w przypadku konkretnych problemów z rozwiązywaniem problemów.

Protokół

Niniejszy protokół został zoptymalizowany z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych buforów, żeli i zestawów do transferu w celu zmniejszenia zmienności i poprawy powtarzalności. Pełną listę wymaganych materiałów eksploatacyjnych znajduje się w Liście Materiałów.

Protokół fluorescencyjnego WB z wykorzystaniem szybkiego transferu I-Blot oraz systemu obrazowania LI-COR Odyssey

1. Przygotowanie próbki

  1. Wybór i przygotowanie buforu
    1. Wybierz odpowiedni bufor do ekstrakcji do homogenizacji próbek i upewnij się, że bufor jest kompatybilny ze wszystkimi stosowanymi w dalszym toku prac technikami. Przed izolacją próbek przygotuj bufor do ekstrakcji: bufor RIPA (25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholan sodu, 0.1% SDS) zawierający 5% koktajlu inhibitorów proteaz.
      UWAGA: Dostępnych jest wiele różnych rodzajów buforów do ekstrakcji, które dobiera się w zależności od lokalizacji badanego białka w komórce. Należą do nich m.in. bufor RIPA (całe komórki, komponenty mitochondrialne i jądrowe), bufor do lizy NP-40 (całe komórki lub białka związane z błoną) oraz Tris-Triton (białka związane z cytoszkieletem). Należy jednak pamiętać, że niektóre detergenty chemiczne zawarte w buforach do ekstrakcji mogą pomagać w solubilizacji lub nawet dezaktywacji białek, ale mogą zakłócać oznaczenie białka podczas stosowania konkretnych testów, np. testu kwasu bicinchoninowego (BCA). Sprawdź wytyczne producenta dotyczące kompatybilności chemicznej z testem.
  2. Ekstrakcja i solubilizacja białek
    1. Rozdrobnij ręcznie próbkę tkanki za pomocą nożyczek i/lub skalpela, a następnie przeprowadź homogenizację za pomocą homogenizatora Dounce'a lub ręcznego homogenizatora elektrycznego z końcówką z polipropylenu w przygotowanym buforze do ekstrakcji w stosunku około 1:10 w/v (masa tkanki/objętość buforu), aż do uzyskania gładkiego, jednorodnego homogenatu.
      UWAGA: W przypadku mniejszych, cennych lub trudnych do pozyskania próbek, ekstrakcje oparte na detergentach mogą być skuteczne nawet przy stosunku 1:5.
    2. Po homogenizacji odwiruj próbki przy 20 000 ×g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Pobierz supernatant zawierający zsolubilizowane białka i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Zachowaj nierozpuszczalne osady, aby umożliwić dalszą, bardziej rygorystyczną ekstrakcję w razie potrzeby. Przejdź do etapu oznaczania białka 1.3.
  3. Oznaczanie białka
    1. Wyznacz stężenie białka w każdej ekstrahowanej próbce, stosując test BCA, Bradforda lub podobny test. Podczas obliczania krzywej wzorcowej upewnij się, że współczynnik determinacji, wartość R-kwadrat, jest większa lub równa 0.99, co odzwierciedla najdokładniejsze oznaczenie zawartości białka w próbkach15.
      UWAGA: Wszystkie próbki porównywane metodą QFWB muszą być analizowane w odniesieniu do tej samej krzywej wzorcowej.
  4. Przygotowanie próbek
    1. Zaplanuj i zapisz kolejność nakładania markerów i próbek dla 2 identycznych żeli: żelu 1 do transferu oraz żelu 2 jako kontroli załadunku. Nakładaj próbki kontrolne i „traktowane” sekwencyjnie, aby uniknąć błędów, które mogłyby wynikać z niedokładnego lub niejednoznacznego transferu.
    2. Oblicz objętość białka wymaganą dla każdej próbki. Standardowym załadunkiem białka do detekcji białek w izolatach neuronalnych jest 15 μg. Doprowadź każdą próbkę do objętości 10 μl za pomocą dH2O. Dodaj 5 μl buforu do nakładania, wymieszaj w wortexie i podgrzej w temperaturze 98 °C przez 2 min.
    3. Uwzględnij próbkę kontrolną pozytywną, np. białko rekombinowane, aby ułatwić identyfikację właściwego prążka. Przygotuj jednak próbkę kontrolną pozytywną zgodnie z wytycznymi producenta, aby uniknąć wyboru błędnych prążków. Patrz Rysunek 1.

Żel elektroforetyczny wykazujący rozdzielenie białek; markery masy cząsteczkowej po lewej stronie, oznaczone jako A i B.
Rycina 1. Wybór kontroli dodatniej. Dodanie kontroli dodatnich do eksperymentu potwierdza, że wykryte znakowanie jest rzeczywiste. Należy jednak zachować ostrożność, aby upewnić się, że kontrola działa prawidłowo przed użyciem próbek badawczych. A) Białko fuzyjne TREM 2 naniesiono zgodnie z wytycznymi producenta w stężeniu 1 μg/ml, jednak znakowanie zaobserwowane przy 110 kDa jest niezgodne z masą cząsteczkową przewidzianą w karcie charakterystyki, wynoszącą 60-70 kDa. B) Po dodaniu i inkubacji z reduktorem znakowanie białka fuzyjnego wykryto przy przewidywanej masie cząsteczkowej. Oznaczało to jednak konieczność zastosowania większej ilości białka, ponieważ proces redukcji zmniejszył sygnał białka.

2. Elektroforetyczne rozdział białek

  1. Przygotowanie żelu Bis/tris 4-12% (1,0 mm)
    UWAGA: Żele gradientowe są stosowane w celu uzyskania lepszego rozdzielenia białek w szerokim zakresie mas cząsteczkowych.
    1. Wybrać i przygotować bufor do elektroforezy MES lub MOPS (1 L na komorę), rozcieńczając go wodą dH2O. Bufor MES zapewnia lepszą rozdzielczość białek w zakresie 3,5-160 kDa, natomiast bufor do elektroforezy MOPS jest preferowany do wykrywania białek o wyższej masie cząsteczkowej powyżej 200 kDa, jednak oferuje gorszą rozdzielczość białek o niższej masie cząsteczkowej poniżej 15 kDa.
    2. Wyjąć grzebień oraz usunąć pasek taśmy pokrywający dół żelu. Ostrożnie wypłukać dołki buforem do elektroforezy za pomocą pipety 1 ml. Napełnić dołki buforem do elektroforezy i upewnić się, że w żelu nie pozostały pęcherzyki powietrza.
  2. Przygotowanie żelu i nakładanie próbek
    1. Włożyć żele do komory i napełnić przestrzeń między żelami buforem do elektroforezy, aby upewnić się, że wszystkie uszczelki działają skutecznie.
    2. Nanieść 3 μl standardu masy cząsteczkowej do pierwszego dołka w żelu 1 i żelu 2. Nanieść 10 μl każdej próbki do kolejnych dołków.
      UWAGA: Z wyjątkiem markerów, żel 1 i żel 2 muszą być identyczne. Jest niezbędne, aby wstępnie barwiony standard masy cząsteczkowej użyty do żelu 2 był niebieski i widoczny przy stosowaniu całkowitego barwienia białek, aby był dostrzegalny w kanale 700 obrazera Odyssey.
    3. Po nałożeniu próbek na oba żele, napełnić komorę pozostałym buforem do elektroforezy i zabezpieczyć pokrywę.
  3. Elektroforeza
    1. Prowadzić elektroforezę przy 80 V przez 4 min, aby zapewnić jednorodne wprowadzenie próbek do macierzy żelu poliakrylamidowego. Następnie zwiększyć napięcie do 180 V i czas do 50 min lub do momentu, gdy barwnik próbek dotrze do dołu żelu.
      UWAGA: Można zastosować wyższe napięcia, aby skrócić czas prowadzenia elektroforezy. Może to jednak doprowadzić do powstania efektu „uśmiechu” (tzw. smiley gels), gdzie próbki w środkowych ścieżkach żelu przemieszczają się szybciej niż próbki w ścieżkach zewnętrznych, co jest spowodowane wzrostem temperatury14.

3. Barwienie białek całkowitych żelu kontroli załadunku

  1. Wyjmij żel 2 z kasety za pomocą noża do żeli. Usuń grzebienie oraz stopkę żelu. Oznacz żel, aby ułatwić orientację.
  2. Przelej około 30 ml barwnika do białek do kwadratowej szalki Petriego (o przybliżonym rozmiarze 12 x 12 cm). Umieść żel 2 w barwniku do białek, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa żel, a następnie inkubuj żel w ruchu przez minimum 1 h w temperaturze pokojowej w celu zabarwienia.
  3. Odlej barwnik do białek i przemyj żel 3x wodą destylowaną przed wizualizacją. Przejdź do kroku 6.3 w celu przeprowadzenia wizualizacji.

4. Szybki transfer białek metodą półsuchą I-Blot

UWAGA: Wszystkie odczynniki wymagane do transferu białek przy użyciu urządzenia I-Blot są produktami komercyjnymi zaprojektowanymi specjalnie dla metodologii I-Blot i znajdują się w liście materiałów.

  1. Przygotować dolny zestaw do transferu. Zdjąć pokrywę z folii i nawilżyć buforem do elektroforezy bezpośrednio z komory do żeli. Papier filtracyjny nawilżyć wodą destylowaną.
  2. Powtórzyć krok 3.1 i położyć żel 1 na przygotowanym dolnym zestawie do transferu.
  3. Położyć nawilżony papier filtracyjny na żelu. Przetoczyć papier filtracyjny i żel, aby upewnić się, że między warstwami nie uwięzione są żadne pęcherzyki powietrza.
  4. Zdjąć pokrywę z folii z górnego zestawu do transferu i położyć górny zestaw na papierze filtracyjnym i dolnym zestawie. Przetoczyć powstałą „kanapkę” zestawu transferowego, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  5. Włożyć gąbkę z zestawu do transferu na pokrywę urządzenia I-Blot. Umieścić „kanapkę” zestawu transferowego w wyznaczonym miejscu w urządzeniu I-Blot, a następnie szczelnie zamknąć pokrywę. Uruchomić urządzenie I-Blot i przeprowadzić transfer przez 8,5 min w programie 3.
  6. W przypadku niskiego sygnału białka lub nierównych stosunków białek o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej, należy przetestować czasy transferu zalecane przez producenta przy zastosowaniu półsuchej „szybkiej” metody transferu. Przeprowadzić prosty protokół optymalizacji, stosując powtórzenia próbek o identycznym obciążeniu, aby wyznaczyć optymalną kombinację napięcia i czasu transferu, zgodnie z Rysunkiem 2.

Elektroforeza DNA i analiza fluorescencyjna; ścieżki żelu i wykres słupkowy obrazujący czasy transferu.
Rycina 2. Optymalizacja transferu z użyciem urządzenia I-Blot. A) Pojedynczy żel z naniesionym markerem oraz 15 μg homogenatu całego mózgu mysiego w trzech tandemowych powtórzeniach został pocięty na trzy sekcje. Jedna sekcja nie została poddana transferowi, jedna była poddawana transferowi przez 7,5 min (zgodnie z wytycznymi producenta), a jedna przez 8,5 min. Sekcje żelu zabarwiono następnie barwnikiem białkowym Instant Blue, przeskanowano na obrazowniku podczerwonym w kanale 680 i poddano kwantyfikacji. B) Graficzna reprezentacja wartości kwantyfikacji wykazująca różnicę w pozostałej zawartości białka w każdym żelu po 0, 7,5 i 8,5 min transferu. Należy zauważyć, że dodatkowa minuta czasu transferu doprowadziła do dodatkowego transferu białka o wartości około 45%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Wykrywanie białek za pomocą przeciwciał

  1. Przygotowanie i blokowanie membrany
    1. Wyjmij kasetę transferową z urządzenia I-Blot. Usuń górną warstwę i papier filtracyjny, odsłaniając żel znajdujący się na dolnej części kasety.
    2. Wytnij obszar wokół żelu za pomocą skalpela, upewniając się, że na membranie znajduje się nacięcie w kształcie trójkąta w celu późniejszej orientacji. Po przycięciu membrany zabarw żel na białka, aby sprawdzić wydajność transferu i/lub go zutylizuj.
    3. Szybko przenieś membranę do czystej probówki 50 ml (lub równoważnego naczynia) zawierającej 5 ml 1x PBS i umieść ją na rollerze mechanicznym (lub platformie orbitalnej) w celu stałego mieszania.
      UWAGA: Krytyczne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia membrany. Podczas transferu półsuchego membrana rozgrzewa się. Odczekaj 2 min przed otwarciem kasety transferowej, co pozwoli jej ostygnąć i spowolni wysychanie podczas rozbiórki układu. Użycie rollera i probówki do mieszania podczas etapów przemywania i inkubacji pozwala na znaczną redukcję objętości wymaganych roztworów.
    4. Przemyj membranę 3 x 5 min w 1x PBS. Odlej 1x PBS i zablokuj membranę nierozcieńczonym buforem blokującym przez minimum 30 min w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotowanie przeciwciała pierwszorzędowego.
    1. Przygotuj przeciwciało pierwszorzędowe zgodnie z wytycznymi producenta w 5 ml buforu blokującego z 0.1% Tween20. Inkubuj membranę z przygotowanym przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C przy stałym mieszaniu.
      UWAGA: Bufor blokujący jest zazwyczaj stosowany bez rozcieńczania, ale może zostać rozcieńczony do 1:4 w PBS, jeśli przeciwciało pierwszorzędowe wykazuje wystarczająco wysoką swoistość.
    2. Odlej przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj membranę 6 razy po 5 min każdorazowo w 1x PBS.
  3. Wybór i przygotowanie przeciwciała drugorzędowego
    1. W przypadku oceny znakowania samym przeciwciałem drugorzędowym w celach kontrolnych, pomiń kroki 5.2.1 i 5.2.2 opisane powyżej i przejdź do kroku 5.3, aby określić specyficzne dla próbki wzory prążków przeciwciała drugorzędowego. Patrz Rycina 3.

Wyniki elektroforezy białek; detekcja przeciwciał, fluorescencja, prążki żelu, markery masy cząsteczkowej.
Rycina 3. Optymalizacja przeciwciał wtórnych. A) Porównanie nieswoistego znakowania wyłącznie przeciwciałami wtórnymi dla wielu gatunków przy zastosowaniu 15 μg homogenatów tkanki nerwowej myszy (M), owcy (O) i konia (E) z różnymi fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wtórnymi. L oznacza drabinę mas cząsteczkowych. Homogenat tkanki owczej był jedyną próbką wykazującą reakcję krzyżową z znakowaniem wtórnym przy użyciu przeciwciała osioł anty-kozie 800. B) Ważne jest również ustalenie, czy nieswoiste znakowanie występuje przy użyciu innej próbki tkanki, i.e., mięśnia brzuchatego łydki myszy (ładunek 15 μg). Próbka ta wykazuje reakcję krzyżową z wtórnym przeciwciałem osioł anty-mysie 680, jednak nie zaobserwowano tego przy użyciu homogenatu mózgu myszy.

  1. Przygotować wtórne przeciwciało znakowane fluorescencyjnie 680 lub 800 (kanał czerwony lub zielony), stosując stężenia zalecane przez producenta w buforze blokującym z 0,1% Tween20. Inkubować membranę w ciemności z przygotowanym przeciwciałem wtórnym przez 90 min w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu.
  2. Odlać przeciwciało wtórne i przemyć membranę 6 razy po 5 min każde płukanie w 1x PBS. Przejść do kroku 6 — wizualizacji.
    1. Jeśli wizualizacja markerów nie przebiega zgodnie z oczekiwaniami, jako dodatkowy krok należy sprawdzić drabinki z różnymi przeciwciałami wtórnymi. Nie wszystkie przeciwciała wtórne umożliwiają wizualizację wszystkich prążków markerów we wszystkich dostępnych komercyjnie drabinkach.
    2. Jeśli oczekiwane prążki nie są widoczne, należy zastosować alternatywnego gospodarza przeciwciała wtórnego, np. zastąpienie przeciwciała osioł przeciw królikowi przeciwciałem koza przeciw królikowi stanowi odpowiednią modyfikację protokołu. Patrz Rysunek 4. Gatunek gospodarza użyty do wytworzenia przeciwciała wtórnego może sporadycznie powodować problemy z wizualizacją ze względu na brak specyficzności względem konkretnych przeciwciał pierwotnych.

Schemat western blot z użyciem przeciwciała koziego anty-króliczego do detekcji białek w tkance tłuszczowej, mięśniowej, wątrobie i kościach.
Rycina 4. Rozwiązywanie problemów ze swoistością przeciwciała wtórnego. Western blot z szeregu próbek tkanek (15 μg białka na ścieżkę) — tkanki tłuszczowej, mięśniowej, wątroby i kości — inkubowanych z przeciwciałem pierwotnym ERK oraz trzema różnymi przeciwciałami wtórnymi. Panel górny: WB znakowany przeciwciałem wtórnym LI-COR goat anti-rabbit 680 wykazał słabe znakowanie tkanki tłuszczowej i kości, a w próbkach wątroby i mięśni nie wykryto sygnału. Panel środkowy: Membranę (z panelu górnego) poddano procesowi stripingu i ponownemu znakowaniu z wykorzystaniem metodologii ECL oraz przeciwciała wtórnego Goat anti-rabbit sprzężonego z HRP. Prążki są teraz widoczne w próbkach mięśni i wątroby, a znakowanie wydaje się bardziej intensywne w próbkach tkanki tłuszczowej i kości. Panel dolny: Membranę (z panelu górnego i środkowego) poddano stripingowi i ponownemu znakowaniu z użyciem przeciwciała wtórnego LI-COR Donkey anti-rabbit 680, które wykazało większe powinowactwo do przeciwciała pierwotnego ERK. Znakowanie mięśni i wątroby jest teraz widoczne, przy jednoczesnym zwiększeniu intensywności sygnału w próbkach tkanki tłuszczowej i kości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Wizualizacja

UWAGA: Wszystkie obrazy zostały pozyskane przy użyciu obrazownika LI-COR Odyssey Classic oraz powiązanego oprogramowania analitycznego Image Pro (wersja 3.1.4).

  1. Włącz i zaloguj się do komputera oraz obrazownika. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i utwórz nowy plik. Patrz Rysunek 5.

Analiza obrazu elektroforezy żelowej; wyniki rozdzielenia prążków DNA; kwantyfikacja sygnału fluorescencji.
Rycina 5. Wizualizacja i kwantyfikacja western blot. Skan western blot wykazujący mięsień brzuchaty myszy (ładunek 30 μg) z zastosowaniem przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko Annexin V (36 kDa) oraz koziego przeciwciała drugorzędowego anty-króliczego 800. Membrana została zeskanowana i zwizualizowana w kanale 800. Aby przeprowadzić kwantyfikację białka (Annexin V), wokół prążka w próbce 1 rysuje się prostokątną ramkę. Następnie jest ona kopiowana i wklejana nad pozostałe ścieżki próbek, aby zapewnić pomiar tego samego obszaru. Tło jest automatycznie uwzględniane wokół narysowanego kształtu, ale można to zmienić, aby zapewnić dokładne zdefiniowanie pomiaru tła. Poniższa tabela przedstawia skwantyfikowane pomiary każdego narysowanego kształtu, w tym całkowity uzyskany sygnał, tło oraz sygnał po odjęciu tła. Informacje te można następnie wyeksportować do programu arkusza kalkulacyjnego w celu obliczenia stosunków ekspresji (wyznaczonych na podstawie względnej intensywności fluorescencji), co umożliwia przeprowadzenie dalszych analiz statystycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Otwórz pokrywę urządzenia obrazującego. Wlej niewielką ilość 1x PBS na szkło w lewym dolnym rogu, a następnie umieść membranę na powierzchni PBS. Upewnij się, że membrana jest ustawiona równolegle do osi urządzenia i że między membraną a osią siatki zachowano odstęp 1 cm.
    1. Zwiń membranę, aby upewnić się, że między szkłem a membraną nie pozostały pęcherzyki powietrza.
    2. Policz liczbę pól, które membrana zajmuje na osi x i y. Zamknij pokrywę obrazownika. Wprowadź do oprogramowania komputerowego liczbę pól zajmowanych przez membranę.
    3. Wybierz odpowiedni kanał do skanowania membrany, zależnie od znacznika fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego, tj. kanał 700 lub 800 w przypadku zastosowania przeciwciała znakowanego odpowiednio fluorochromem 680 lub 800. W przypadku podwójnego znakowania należy przeprowadzić skanowanie w obu kanałach.
      UWAGA: Przed przystąpieniem do podwójnego znakowania należy zoptymalizować znakowanie pojedynczego białka.
    4. Wybierz natężenie skanowania membrany; w przypadku białka o wysokiej zawartości zastosuj skanowanie o niskim natężeniu. Alternatywnie, jeśli przeciwciało pierwszorzędowe wykazuje słabe powinowactwo do badanego białka, wybierz skanowanie o wyższym natężeniu. t. j. poziom 5. Naciśnij start, aby rozpocząć skanowanie. Przejdź do kroku 6.4.
  2. Wizualizacja żelu kontroli ładowania (Rycina 6).
    Protein electrophoresis; gel (A), fluorescence (B), bar graph (C); molecular weight analysis.
    Rycina 6. Znakowanie i analiza białek całkowitych. A) Fotografia żelu z barwieniem białek całkowitych zawierającego 20 μg homogenatu zwojów szyjnych konia na każdą studzienkę. B) Żel z panelu A przeskanowany w kanale 680. C) Wykres ilościowych pomiarów z żelu barwionego na całkowitą zawartość białka, uzyskany przy użyciu oprogramowania do obrazowania. Zakres pomiarów określony przez markery masy cząsteczkowej, t.j. zakres 30–110 kDa, pobierane są w celu przygotowania histogramu pomiarów, aby upewnić się, że błąd standardowy średniej (SEM) dla zgrupowanych próbek jest niski, co wskazuje na jednorodność całkowitego poziomu białek w każdej próbce w obrębie żelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
    1. Postępuj zgodnie z krokami 6.1 i 6.2.
    2. Wlej wodę destylowaną na szkło w dolnym rogu obrazownika, w miejscu, gdzie zaczyna się oś siatki.
    3. Umieść żel na powierzchni wody i ustaw go tak, aby ścieżki były prostopadłe do osi x lub y siatki. Pozostaw 1-centymetrową przerwę między osiami x i y siatki a żelem, a następnie odlicz liczbę pól siatki zajmowanych przez żel wzdłuż osi. Zamknij pokrywę urządzenia obrazującego.
    4. Wprowadź do oprogramowania komputerowego liczbę pól zajmowanych przez żel.
    5. Wybierz kanał 700 do skanowania żelu z barwieniem całkowitego białka.
      UWAGA: Kolor niebieski fluoreskuje w kanale 700.
    6. Ustaw natężenie na 5 i naciśnij start.
  3. Kwantyfikacja obrazu zeskanowanego
    1. Dostosuj przyciski jasności i kontrastu, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. Jeśli pojawi się wysoki szum tła, ponownie przeskanuj membranę przy niższej intensywności, korzystając z ustawienia skanowania wysokiej jakości.
      UWAGA: Wszelkie korekty nie wpłyną na dane fluorescencyjne uzyskane podczas skanowania.
    2. Obracanie obrazów 90°, 180° i 270° aby umożliwić oglądanie w pożądanej orientacji bez wprowadzania zmian w nabytych danych. Jednakże podczas dokonywania niewielkich korekt orientacji w trybie „wolnego obrotu” (free rotation) o wartość większą niż 3°dane pozyskane w postaci wartości pikselowych mogą ulec zniekształceniu, co może wpłynąć na wyniki ilościowe.
    3. Wybierz kształt z menu kształtów — w większości przypadków należy wybrać prostokąt — i obrysuj interesujący prążek (WB) lub całą ścieżkę (żel z całkowitą ilością białka) w ścieżce z próbką 1.
    4. Skopiuj i wklej kształt na interesujący prążek w ścieżce próbki 2 lub na całą ścieżkę. Powtórz czynność dla każdego interesującego prążka w każdej próbce oraz dla każdej ścieżki w przypadku żeli do białka całkowitego.
    5. Należy upewnić się, że pomiar tła nie obejmuje sygnału z sąsiedniego pasa. Tło może zostać odjęte automatycznie przez oprogramowanie i obejmować całą krawędź wokół narysowanego kształtu lub może zostać określone jako obszar powyżej/poniżej lub po lewej/prawej stronie kształtu. Alternatywnie można wyznaczyć obszar tła zdefiniowany przez użytkownika.
    6. Wyświetl sygnał w tabeli kształtów dla każdego narysowanego kształtu w dowolnych jednostkach fluorescencji. Tło zostanie automatycznie odjęte od sygnału.
    7. Wyeksportuj obraz jako plik TIF, aby móc go wyświetlić w innym oprogramowaniu. Nie eksportuj obrazu i nie manipuluj nim przy użyciu oprogramowania innego niż profesjonalne programy do obróbki obrazów, ponieważ zmieni to oryginalne dane pozyskane przez analizator obrazu, co doprowadzi do powstania błędnych danych.
    8. Powtórz kroki 6.4.3–6.4.7 podczas ilościowego oznaczania podwójnego znakowania lub przeprowadzania wielokrotnych pomiarów na żelach z kontrolą załadunku, aby wygenerować i zestawić dane dotyczące błędu standardowego. 

7. Po wizualizacji

  1. Przechowywać membrany w 1x PBS lub wysuszyć do długotrwałego przechowywania w celu przyszłego ponownego znakowania oraz usuwania przeciwciał (strippingu) dla innych białek zainteresowania.
  2. Usuwanie przeciwciał i ponowne znakowanie membran. Patrz Rysunek 7.
    Wynik elektroforezy pokazujący prążki białek, opisane ścieżki, analiza fluorescencyjna w badaniu białek.
    Rysunek 7. Stripping i ponowne znakowanie membrany. Reprezentatywne przykłady membran po kolejnych etapach usuwania przeciwciał, zeskanowane za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni. A. Pierwsza immunodetekcja została przeprowadzona z użyciem przeciwciała pierwszorzędowego CSP (królik) i zeskanowana na kanale 700. B. Pierwszy stripping i ponowne znakowanie z użyciem ROCK2 (królik) na kanale 800. Pomarańczowa strzałka wskazuje pozostałe przeciwciało pierwszorzędowe CSP obecne po strippingu i ponownym znakowaniu. Nie wpływa to na pomiar ROCK2, ponieważ prążek występuje przy wyższej masie cząsteczkowej (biała strzałka). C. Drugi stripping i ponowne znakowanie przeciwciałem β-Spectrin (koza), wizualizowane na kanale 800. D. Trzeci stripping i ponowne znakowanie przeciwciałem α-synuclein (królik). E. Czwarty stripping i ponowne znakowanie przeciwciałem przeciwko ubikwitynie (mysz) na kanale 800. Nadal widoczny jest sygnał z poprzedniego przeciwciała (α-synuclein, pomarańczowa strzałka). F. Piąty stripping i ponowne znakowanie przeciwciałem CALB2 (królik), obrazowane na kanale 700. Użyte przeciwciała wtórne to: koza anty-mysz 800cw, koza anty-królik 680rd, koza anty-królik 800cw, osioł anty-koza 800cw (patrz Lista Materiałów). Opisy ścieżek: L — drabinka, 1/2 — próbka 1/2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
    1. Umieścić membranę(y) w kwadratowej płytce Petri zawierającej około 30 ml buforu do strippingu Revitablot i inkubować od 5-20 min w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu.
    2. Przemyć membranę(y) 3 razy w PBS, a następnie ponownie zeskanować w urządzeniu obrazującym, aby upewnić się, że fluorescencja została całkowicie usunięta — krok ten należy powtórzyć po każdym strippingu.
    3. Inkubować membranę(y) przez dłuższy czas, jeśli fluorescencja nadal jest obecna. Przeskanuj membranę po każdym strippingu, aby potwierdzić brak pozostałego sygnału wtórnego.
      UWAGA: Membrany powinny być poddawane strippingowi i ponownemu znakowaniu maksymalnie 3 razy, aby zagwarantować, że integralność membrany nie została naruszona, co mogłoby skutkować niepożądanym wysokim stosunkiem tła do sygnału.

Wyniki

Ponieważ czułość QFWB i liniowy zakres wykrywania są większe niż konwencjonalne wykrywanie ECL, istnieje szereg środków kontrolnych, które są kluczowe dla zapewnienia dokładnych danych i tym samym pomagają w skutecznej interpretacji. Po pierwsze, włączenie dodatnich próbek kontrolnych, jak pokazano na rysunku 1. Po drugie, optymalizacja transferu w celu zagwarantowania równoważnego ruchu białek o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej z żelu do błony, jak pokazano na rysunku 2. Po trzecie, optymalizacja przeciwciał, zwłaszcza przeciwciał drugorzędowych, których optymalizacja jest często pomijana, ale które mogą wytwarzać niespecyficzne prążki zdolne do zakłócania prawidłowej interpretacji białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania. Zobacz rysunek 3. Po czwarte, może się również zdarzyć, że gdy białko wydaje się niewykrywalne, ale oczekuje się, że będzie obecne, może to być również problem z przeciwciałami wtórnymi, który można skorygować, po prostu używając wtórnego wyhodowanego w innym gatunku gospodarza. Zobacz rysunek 4. Po piąte, znakowanie i analiza białek ogółem jest znacznie bardziej wiarygodną i wymierną metodą w porównaniu z wykorzystaniem tradycyjnych pojedynczych białek, które są powszechnie eksprymowane dla wewnętrznych wzorców referencyjnych3. Stwierdzono, że wiele z tych pojedynczych białek ulega zróżnicowanej ekspresji w modelach chorób neurodegeneracyjnych, a także między różnymi próbkami tkanek, a jednorodność ekspresji może się zmieniać w tej samej tkance3. W związku z tym produkcja żelu do kontroli obciążenia potwierdzi jednorodność obciążenia próbki w połączeniu z analizą całkowitego białka poprzez porównanie i ilościowe określenie obciążenia białkami na każdym torze przy różnych zakresach mas cząsteczkowych mierzonych dla każdej próbki w celu wskazania błędu standardowego, jak pokazano na rysunku 6. Co ważne, wszystkie te techniki rozwiązywania problemów i kontrole są tak skuteczne, jak czułość i spójność narzędzi analitycznych stosowanych przez operatora (rysunek 5). Wreszcie, technika ta nadaje się do usuwania i ponownego sondowania membran z większą elastycznością niż ECL ze względu na takie czynniki, jak między innymi zwiększona czułość, zmniejszone tło, detekcja podwójnego koloru i stabilność membrany w warunkach długotrwałego przechowywania. Zobacz rysunek 7.

Dyskusja

Należyte rozważenie i planowanie są niezbędne przed każdym eksperymentem i mogą ostatecznie zadecydować o powodzeniu zastosowanej techniki. Postępy w wykrywaniu białek za pomocą WB mogą stanowić mnóstwo potencjalnych przeszkód przy próbie wyboru odpowiednich przeciwciał, metod transferu i wizualizacji do wykorzystania. Na szczęście, przy użyciu starannej listy kontrolnej i odpowiednich środków kontrolnych, QFWB może być rutynowo stosowany do określania obecności białek i coraz bardziej subtelnych różnic w ekspresji między próbkami. Protokół ten zawiera obszerny przewodnik po fluorescencyjnym ilościowym western blot, a także kilka strategii rozwiązywania problemów, aby uniknąć i/lub przezwyciężyć niektóre z wielu typowych pułapek z nim związanych.

Kluczowe kroki stosowane w celu utrzymania czułości i uzyskania naprawdę wymiernych i porównywalnych pomiarów obejmują: 1) solidną ekstrakcję białka z próbek tkanek; 2) przygotowanie próbki; 3) dokładne obciążenie białkami określone na podstawie analizy całkowitej białka; 4) optymalny transfer białek za pomocą I-Blot; 5) przygotowanie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych w buforze blokującym zawierającym 0,1% Tween20 oraz 6) prawidłowa wizualizacja i analiza za pomocą kamerytora w podczerwieni i powiązanego oprogramowania.

Detekcja fluorescencyjna w podczerwieni jest naprawdę ilościowa i zapewnia większą czułość w porównaniu z bardziej tradycyjnymi technikami wykrywania ECL3,11. Ten system wykrywania jest wieloaspektowy i jako taki nie ogranicza się do QFWB. System ten jest zdolny do obrazowania znakowania immunohistologicznego przy niskiej mocy, co pozwala na wizualizację i ilościowe określenie całych odcinków tkanek12. Jest to jeden z obszarów potencjalnego przyszłego rozwoju pod względem rozdzielczości, który może sprawić, że obrazowanie na czerwono będzie rywalizować z konwencjonalnym wychwytywaniem immunofluorescencji za pomocą konwencjonalnych mikroskopów pod względem oceny ilościowej.

Jednak przy większej wrażliwości na subtelne zmiany w ekspresji białek kluczowe znaczenie ma ograniczenie zmienności do minimum, a środki kontroli są rygorystyczne dzięki solidnym protokołom. Rozpoczyna się to od rygorystycznej ekstrakcji białka z próbki tkanki, a następnie produkcji całkowitych żeli barwionych białkami, aby zapewnić równomierne obciążenie próbki, optymalizacji przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych w celu określenia, czy wykrycie jest prawdziwe, oraz przetestowania wytycznych producenta w odniesieniu do czasu transferu w celu uzyskania wydajnego transferu białka.

Niemniej jednak, nawet jeśli warunki dla WB zostaną zoptymalizowane, nadal mogą pojawić się problemy związane z prowadzeniem westernów, które mogły nie zostać tutaj w pełni zbadane. Należą do nich między innymi takie czynniki, jak solubilizacja białek i wybór buforu ekstrakcyjnego. Niektóre mogą zakłócać testy stężenia białek, a niektóre tkanki są szczególnie trudne do rozludnienia, co wymaga bardziej niezawodnych technik, takich jak użycie automatycznego macerowania szczelnych pojemników, takich jak probówki M, wraz z dysocjatorem Macs. Ponadto proste środki kontroli przechowywania materiału ekstrahowanego i nieekstrahowanego w temperaturze -80 °C mogą stanowić różnicę między uzyskaniem optymalnego etykietowania natychmiast po ekstrakcji a uzyskaniem słabych wyników kilka tygodni później.

Udowodniono, że nowoczesne metody QFWB są bardziej czułe na wychwytywanie subtelnych różnic w ekspresji białek i są bardziej wszechstronne, umożliwiając jednoczesne podwójne znakowanie3 w porównaniu ze starszymi technikami, takimi jak ECL. Bardzo ważne jest, aby protokoły western blotting były solidne i łatwe do powtórzenia w celu dokładnej kwantyfikacji i analizy statystycznej. Protokół ten jest wystarczająco czuły i solidny, aby można go było rutynowo stosować do wykrywania białek w różnych próbkach tkanek i gatunkach3 oraz umożliwia ilościowe określanie białek o niskiej i wysokiej liczebności w tym samym QFWB, zmniejszając w ten sposób zużycie materiałów eksploatacyjnych, a także czas na eksperyment11. Ponadto zwiększona czułość tej techniki pozwala na walidację coraz bardziej popularnych badań -omicznych 9,14 , jednak dokładność ma kluczowe znaczenie i należy przestrzegać odpowiednich środków kontroli, unikając w ten sposób błędnego pozyskiwania danych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe: Finansowanie Programu Strategicznego Instytutu BBSRC - CF & TMW; Finansowanie BBSRC East Bio DTP – LG; Darwin Trust w Edynburgu – MLH. Chcielibyśmy również podziękować dr Barry'emu McCollowi za zgodę na włączenie optymalizacji TREM2 do tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor RIPAFisher Scientific UK Ltd10230544
M TubesMiltenyi Biotec Inc.130-093-236
Stos transferowy iBlot, PVDF RegularLife Technologies, Wielka BrytaniaIB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)Life Technologies, Wielka BrytaniaLC5602Zastosowanie w żelu 1 do Western blotting
SeeBlue Wstępnie barwione białko standardLife Technologies, Wielka BrytaniaLC5625 Stosować w żelu 2 Żel barwiony białkiem całkowitym
Bufor do próbek NuPAge LDS 4xLife Technologies, Wielka BrytaniaNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (tylko dla żeli Bis-Tris) (20x)Life Technologies, Wielka BrytaniaNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 12 wellLife Technologies, Wielka BrytaniaNP0322BOX
Tabletka soli fizjologicznej buforowana fosforanemSigma-Aldrich, Wielka BrytaniaP4417-100TAB
Micro BCA, Zestaw do oznaczania białekFisher Scientific UK Ltd10249133
Odyssey bufor blokującyLi-Cor BiosciencesP/N 927-40000
IRDye 680RD Kozia anty-królicza IgG (H+L), 0,5 mgLi-Cor Biosciences926-68071
IRDye 680RD IgG przeciw mysim osłom (H+L), 0,5 mg Li-Cor Biosciences926-68072
IRDye 800CW Kozia anty-królicza IgG (H + L), 0,5 mgLi-Cor Biosciences926-32211
IRDye 800CW Osioł anty-kozi IgG (H + L), 0,5 mgLi-Cor Biosciences926-32214
ODYSSEY CL Kamera na podczerwieńLi-Cor BiosciencesZaproszenie do składania ofert
iBlot 7-minutowy system Blotting Lifetechnologies, Wielka BrytaniaTen model nie jest już produkowany
InstantBlue Protein stainExpedeon, Wielka BrytaniaISB1L
Revitablot bufor do usuwania western blot Rockland Immunochemicals Inc.MB-085-0050

Bibliografia

  1. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).
  2. Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
  3. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10(2008).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8 (8), 72457(2013).
  5. Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
  6. Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
  7. Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
  8. Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
  9. Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5 (10), 95(2013).
  10. Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.
  11. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
  12. Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).
  13. Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).
  14. Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
  15. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescencyjny Western Blotdetekcja bia ekilo ciowe oznaczanie bia ekbarwienie ca kowitego bia katransfer p suchyfluorescencyjne przeciwcia o wt rneobrazowanie w podczerwieniblokowanie membranyrozcie czanie przeciwcia

Powiązane artykuły