Mysia resekcja jelita krętniczo-okrężniczego z zespoleniem pierwotnym

Podsumowanie

Resekcja jelitowo-kolkowa jest powszechnie wykonywana w wielu chorobach ludzkich; jednak niewiele wiadomo na temat wpływu resekcji jelita na choroby chirurgiczne. Niniejszy artykuł zawiera instrukcje dotyczące wykonywania zabiegu na myszach z dużym powodzeniem, zapewniając środki do badania skutków resekcji krętniczo-okrężnicy w modelach choroby.

Streszczenie

Resekcje jelit są często wymagane w leczeniu chorób związanych z przewodem pokarmowym, a choroba Leśniowskiego-Crohna i rak jelita grubego to dwa typowe przykłady. Pomimo częstości tych zabiegów, nadal istnieje znaczna luka w wiedzy na temat nieodłącznego wpływu resekcji jelita na fizjologię gospodarza i patofizjologię choroby. Ten artykuł zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące resekcji jelita krętniczego z pierwotnym zespoleniem end-to-end u myszy, a także podstawowe aspekty opieki okołooperacyjnej w celu maksymalizacji sukcesu pooperacyjnego. Przy ścisłym przestrzeganiu procedura ta zapewnia 95% długoterminowego przeżycia, brak zaburzeń rozwoju i minimalizuje powikłania pooperacyjne związane z niedrożnością jelit i nieszczelnością zespolenia. Wyzwania techniczne związane z wykonywaniem zabiegu na myszach stanowią barierę dla jego szerokiego zastosowania w badaniach. Umiejętności opisane w tym artykule można nabyć bez wcześniejszego doświadczenia chirurgicznego. Po opanowaniu, procedura resekcji krętniczo-jelitowej myszy zapewni powtarzalne narzędzie do badania skutków resekcji jelita w modelach chorób ludzkich.

Wprowadzenie

Resekcja jelitowo-kolkowa (ICR) jest powszechnym zabiegiem wykonywanym zarówno w sytuacjach nagłych, jak i planowych w przypadku różnych chorób. Choroba Leśniowskiego-Crohna i rak jelita grubego to dwa najczęstsze wskazania do ICR. W obu chorobach nawroty w jelicie w miejscu operacji stanowią poważny problem kliniczny. Miejscowe wskaźniki nawrotów raka jelita grubego pozostają problemem nawet w przypadku najbardziej agresywnych resekcji¹. Po ICR w chorobie Leśniowskiego-Crohna choroba najczęściej (do 80%) nawraca w neopenalnym jelicie krętym po 1 roku od operacji². Biorąc pod uwagę wpływ tych dwóch chorób i ich nawrót po operacji, ważne jest zrozumienie lokalnych czynników jelitowych po ICR, które mogą mieć wewnętrzny wpływ na naturalną historię tych chorób. Ponadto ważne jest również, aby wziąć pod uwagę gojenie zespolenia po ICR. We wczesnym okresie pooperacyjnym nieszczelności zespolenia mogą mieć druzgocące konsekwencje dla pacjentów, prowadząc do powtórnych operacji, powstania stomii, znacznej zachorowalności, a nawet śmiertelności³. Pomimo wagi tego tematu, nasza obecna wiedza na temat gojenia zespoleń pozostaje w powijakach jako przedmiot badań. Modele zwierzęce ICR, w szczególności myszy, są doskonałą platformą do badania gojenia się jelit i zespoleń po operacji.

Mysi model ICR został początkowo opracowany przez Helmratha i wsp. do wykorzystania jako model zespołu krótkiego jelita⁴. Autorzy eksperymentowali z różnymi reżimami dietetycznymi i rozmiarami szwów, aby zoptymalizować przeżywalność zwierząt po ICR. Stwierdzili, że karmienie dietą płynną w okresie okołooperacyjnym i stosowanie szwów monofilamentowych 9-0 skutkowało optymalnym przeżyciem pooperacyjnym na poziomie 88%. Od czasu tej pierwszej publikacji, ICR u myszy usuwających 50% jelita cienkiego został wykorzystany w kilku badaniach w celu zbadania dynamiki masywnej resekcji jelita cienkiego i adaptacyjnej odpowiedzi wzrostu w celu opracowania nowych terapii zespołu krótkiego jelita^5,6.

Pierwsze zastosowanie mysiego modelu ICR do choroby Leśniowskiego-Crohna wykorzystywało mysi model IL-10^-/-, który spontanicznie rozwija zapalenie jelita grubego^{typu 7}. Autorzy odkryli, że po ICR u tych zwierząt rozwinął się stan zapalny w neoterminalnym odcinku jelita krętego podobny do tego, który obserwuje się u pacjentów z pooperacyjną chorobą Leśniowskiego-Crohna, i że to zapalenie było zależne od obecności bakterii⁷. Niedawno model ten został wykorzystany do zbadania zmian bakteryjnych wywołanych przez ICR. W chorobie Leśniowskiego-Crohna występuje dysbioza związana ze względnym spadkiem liczby bakterii, o których wiadomo, że mają właściwości przeciwzapalne, i wzrostem liczby inwazyjnych gatunków bakterii^8,9. Związek ten jest prawdziwy w przypadku nawrotu pooperacyjnego¹⁰. Dwa badania miały na celu zidentyfikowanie zmian mikrobiologicznych wynikających z ICR. W pierwszym z nich wykorzystano myszy zerowe IL-10 i przeprowadzono elektroforezę w żelu denaturującym, aby porównać podobieństwo bakterii między jelitem cienkim a okrężnicą po ICR¹¹. Badanie to wykazało, że populacje bakterii stały się podobne w jelicie cienkim i okrężnicy po ICR. W kolejnym badaniu wykorzystano myszy typu dzikiego i pirosekwencjonowanie 16 s do filogenetycznej klasyfikacji gatunków bakterii po operacji. Badanie to wykazało wyraźną zmianę w gatunkach bakterii wynikającą z samej operacji, przy czym gatunki Clostridium stały się dominujące, a także wzrost liczby Υ-proteobakterii. Wyniki potwierdziły również wyniki poprzedniego badania z podobnymi populacjami znalezionymi w jelicie cienkim i okrężnicy po ICR¹².

ICR jest powszechną procedurą dla pacjentów z rakiem jelita grubego obejmującym jelito ślepe i okrężnicę wstępującą, i coraz częściej uznaje się, że odpowiedź gospodarza na operację prawdopodobnie przyczynia się zarówno do miejscowego, jak i odległego nawrotu nowotworu¹³. Pomimo tej obserwacji, modele ICR nie zostały wykorzystane do badania raka jelita grubego i nawrotów pooperacyjnych. Zrozumienie zarówno ogólnoustrojowych, jak i miejscowych zmian immunologicznych wynikających z ICR będzie ważne dla badania przyszłych terapii. Potencjalne szlaki zaangażowane w nawrót raka po ICR obejmują regulację czynników wzrostu, które mogą ratować komórki przed apoptozą i stymulować proliferację, mechaniczne rozerwanie guza z wydalaniem komórek oraz utratę nadzoru immunologicznego poprzez pooperacyjną immunosupresję^13,14.

Mysie modele ICR mają potencjał, aby stać się potężnym narzędziem do badania zespołu krótkiego jelita, choroby Leśniowskiego-Crohna i raka jelita grubego. Mogą również dostarczyć lekcji na temat tego, jak zapobiegać wczesnym powikłaniom zespolenia pooperacyjnego poprzez dalsze definiowanie szlaków komórkowych i biochemicznych zaangażowanych w gojenie nowo powstałego zespolenia. Główną przeszkodą w wykorzystaniu mysiego modelu ICR jest trudność techniczna. Zespolenie jelitowe wymaga użycia 8-0 lub szew 9-0, mikroskop operacyjny i szkolenie z technik mikrochirurgicznych. Celem tego artykułu jest dostarczenie jasnych instrukcji, jak wykonywać ICR u myszy w celu wykorzystania tej procedury w modelach choroby.

Protokół

Protokoły użytkowania zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Naukach o Zdrowiu na Uniwersytecie Alberty.

1. Przygotowanie instrumentów, zwierząt i konfiguracji operacyjnej

1. Przenieść zwierzęta do nowej, czystej klatki bez wszelkiego stałego pokarmu na 24 godziny przed zabiegiem. Mogą mieć swobodny dostęp do wody i płynnej diety ad lib do czasu zabiegu.
2. W autoklawie należy umieścić wszystkie narzędzia potrzebne do zabiegu. Oczyść powierzchnię operacyjną i znieczulający stożek nosowy 70% etanolem.
3. Ustaw powierzchnię operacyjną z mikroskopem operacyjnym, aparatem anestezjologicznym i materiałami eksploatacyjnymi w sposób wygodny dla chirurga operującego. Łokcie chirurga powinny wygodnie spoczywać na stole operacyjnym, a dłonie i ramiona nie są zasłonięte sprzętem. Narzędzia, szwy, waciki i strzykawkę o pojemności 10 ml należy umieścić w miejscu umożliwiającym łatwy dostęp podczas zabiegu.
4. Ustaw górne lampy grzewcze, aby zapewnić zarówno ciepło zwierzęciu podczas zabiegu, jak i światło na powierzchni operacyjnej.
5. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 50 ml 0,9% solą fizjologiczną, a probówkę o pojemności 1,5 ml wazeliną i umieść w pobliżu powierzchni roboczej.
   UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne. Ponieważ jelito jest przecięte, sam zabieg nie jest sterylny. Jest uważany za czysty zanieczyszczony. Podejmij środki, aby uniknąć wprowadzenia egzogennych źródeł infekcji.

2. Resekcja jelitowo-okrężnicza z zespoleniem

1. Wywołaj znieczulenie, podając 4% izofluranu o natężeniu przepływu tlenu 2 l/min przez stożek nosowy z parownika izofluranu, aż częstość oddechów zwierzęcia zwolni do około 30-40 oddechów/min. Przed rozpoczęciem zabiegu należy wywierać umiarkowany nacisk na tylną stopę myszy, aby upewnić się, że nie ma reakcji bólowej. W tym momencie zmniejsz poziom izofluranu do 2% i przepływ tlenu do 0,5 l/min. Okresowo sprawdzaj reakcję na ból podczas zabiegu i odpowiednio dostosuj szybkość przepływu izofluranu.
2. Nałóż wazelinę na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji, i unieruchamij mysz w pozycji leżącej z kończynami zabezpieczonymi przezroczystą taśmą.
3. Oczyść brzuch roztworem wody i jodu i zmień na nowe sterylne rękawiczki.
4. Wykonaj 1,5 cm nacięcie skóry w górnej linii środkowej brzucha za pomocą ostrych nożyczek preparujących, aby odsłonić powięź i otrzewną. Otwórz warstwę powięziową/otrzewnową w podobny sposób przez linea alba, aby odsłonić zawartość otrzewnej.
5. W przeciwieństwie do ludzi, jelito ślepe myszy zwykle znajduje się w lewym górnym kwadrancie brzucha. Po zidentyfikowaniu delikatnie chwyć jelito ślepe kleszczami i przeprowadź je przez nacięcie. Użyj zwilżonych bawełnianych wacików, aby rozciągnąć około 3 cm końcowego odcinka jelita krętego wystającego z jelita ślepego na sterylną gazę udrapowaną na powierzchni brzucha (ryc. 1A). Upewnij się, że odsłonięte jelito jest wilgotne 0,9% soli fizjologicznej przez cały czas trwania zabiegu.
6. Zidentyfikuj tętnicę krętniczo-kątniczą odgałęziającą się od tętnicy krezkowej górnej wzdłuż okrężnicy (ryc. 1A) za pomocą mikroskopu operacyjnego. Wypreparuj beznaczyniowe tkanki przylegające do tętnicy krętniczo-kątniczej, optymalizuj i podwiązuj tętnicę jedwabnym krawatem 5-0. Następnie zlokalizuj regionalny dopływ krwi do końcowego odcinka jelita krętego i wybierz punkt przecięcia 1,5-2 cm proksymalnie do połączenia krętniczo-kątniczego. Podwiązać gałęzie do tej sekcji jelita krętego, jak powyżej. Podziel tętnice mikronożyczkami preparacyjnymi.
7. Podziel niedokrwienne części jelita krętego i okrężnicy, upewniając się, że do przeciętych końców jest odpowiedni dopływ krwi (ryc. 1B). Często pomocne jest przecięcie jelita krętego poprzez podzielenie go pod kątem 30 stopni, aby zwiększyć średnicę światła, aby bardziej pasowało do okrężnicy. Po usunięciu części jelita krętniczo-kątniczego wyrównaj skrzyżowane końce jelita krętego i okrężnicy na gazie, upewniając się, że granice krezki każdego z nich są wyrównane.
8. Zbuduj zespolenie, aproksymując przecięty koniec jelita krętego do przeciętego końca okrężnicy za pomocą przerywanego 8-0 szwy polipropylenowe (ryc. 1C). Pierwszy szew zakłada się na granicy krezki, a kolejne szwy zakłada się co 0,5 mm, aż do uzyskania wodoszczelności zespolenia krętniczo-kolkowego. Podczas przekładania igły do szycia przez jelito kręte i okrężnicę należy upewnić się, że krawędź cięcia nie jest zwinięta, a ugryzienia igły znajdują się 0,5 mm od przeciętych krawędzi jelita. Typowe zespolenie będzie wymagało od 14 do 16 przerwanych szwów. Przetestuj integralność i drożność zespolenia po zakończeniu, zwijając wacik proksymalnie do dystalnego nad jelitem krętym, aby przepchnąć zawartość przez zespolenie. Treść z jelita cienkiego powinna swobodnie przechodzić do jelita grubego bez wycieku zespolenia.
9. Przepłukać odsłonięte jelito 3-4 ml 0,9% soli fizjologicznej ze strzykawki o pojemności 10 ml, aby zmyć stolec z powierzchni jelita i wprowadzić jelito z powrotem do jamy otrzewnej. Za pomocą 2 ml 0,9% soli fizjologicznej przepłukać jamę otrzewnej, a następnie odsączyć ten płyn, delikatnie uciskając bocznie ścianę brzucha.
10. Zamknij nacięcie jedwabnym szwem biegnącym 3-0 i przerwij przepływ izofluranu. Podawać 0,1 mg/kg długo działającego opiatu – buprenorfiny – podskórnie w celu kontroli bólu pooperacyjnego.
11. Obserwuj zwierzęta pod lampą grzewczą, aż staną się mobilne, a następnie przenieś je do stale ogrzewanej klatki.

3. Opieka pooperacyjna i monitorowanie

1. Monitoruj zwierzęta w stale ogrzewanej klatce pod kątem oznak niepokoju przez pozostałą część dnia. Przenieś zwierzęta z powrotem do placówki opieki nad zwierzętami w nowej sterylnej klatce z dostępem do płynnej diety i wody ad lib. Zwierzęta mogą być trzymane w grupach po 3-4 osoby.
2. Następnego ranka należy przeprowadzić kontrolę zwierząt pooperacyjnych, upewniając się, że nie wydają się być w niebezpieczeństwie. Karm tylko dietę płynną. Jeśli wydają się niewygodne (np. zgarbiona postawa lub minimalna aktywność), należy podać dodatkową dawkę podskórnej buprenorfiny. Sprawdź zwierzęta jeszcze raz po południu w 1. dniu po operacji.
3. Rankiem w 2. dniu po operacji zwierzęta powinny wyglądać na w pełni wyleczone. Dowody na spożywanie pokarmu i stolec są pozytywnymi oznakami powrotu do zdrowia. Teraz wznów stałą dietę dla zwierząt.
   UWAGA: Oznaki niepokoju obejmują zgarbioną postawę, złą pielęgnację i minimalną aktywność. Jeśli oznaki niepokoju są wyraźne, zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji.
4. Poddaj zwierzęta eutanazji poprzez wywołanie głębokiego znieczulenia 4% izofluranem przy natężeniu przepływu_O2 2 l/min, aż zwierzęta przestaną reagować na nacisk stóp. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy i obserwuj oznaki prawidłowej eutanazji.
5. Wytyczne są różne, dlatego należy zapoznać się z zaleceniami instytucji dotyczącymi wskazań i odpowiednich metod eutanazji u myszy.

Wyniki

Wskaźniki śmiertelności i zmiana masy ciała po operacji.
Wskaźniki śmiertelności po ICR u myszy typu dzikiego 129S1 wynoszą zazwyczaj ~ 5%. Najczęstszą przyczyną śmiertelności jest niedrożność jelit w miejscu anastomozy. Inne przyczyny śmiertelności obejmują nieszczelność anastomozy oraz przepuklinę wewnętrzną prowadzącą do niedrożności jelit.

Utrata masy ciała może być obserwowana do 14 dni po operacji, lecz zazwyczaj jest nieistotna. Myszy mają tendencję do całkowitego odzyskani...

Dyskusja

Mysi ICR to potężny model, który można wykorzystać do badania skutków operacji w chorobach jelit. W tym artykule opisano metodę wykonywania ICR u myszy ze wskaźnikiem sukcesu wynoszącym 95% i bez problemów z brakiem rozwoju, co znajduje odzwierciedlenie w stabilnej wadze do 28 dni po zabiegu. Do najważniejszych wyzwań związanych ze skutecznym ICR należy unikanie niedrożności jelit w zespoleniu i nieszczelności zespolenia.

Techniczne elementy operacji zapobiegające niedrożności mają na celu mak...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LD101 płynna dieta dla gryzoni	testdiet.com
0,9% NaCl	Baxter	FKE1324	Sól fizjologiczna do wstrzykiwań
Mikroskop operacyjny	Ziess
Izofluran Anestezjologiczny Waporyzator	Harvard Apparatus	34-0483
Isofluran	Abbott	05260-05
Szklana płyta			Do powierzchni roboczej
Waciki bawełniane
Micro Castroviejo Uchwyt na igłę, zakrzywiony	World Precision Instruments	503377
Proste nożyczki Castroviejo	World Precision Instruments	555530S
Nożyczki preparacyjne	World Precision Instruments	15922
Kleszcze opatrunkowe x 2	World Precision Instruments	500363
5-0 Jedwabne szwy wstępnie cięte	Ethicon	A182H	Do podwiązania naczyń krwionośnych
8-0 Prolene na igle BV130-5	Ethicon	8732H	Do zespolenia
3-0 Jedwab na igłach FS-2	Ethicon	8665G	Do zamykania ścian brzucha
Wazelina z	wazeliny
Strzykawka 10 ml	BD biosciences
Powidon-jod 7,5% Peeling chirurgiczny	betadine.com
Lampy
buprenorfina 0,3 mg/ml	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	PL36699/0006

grzewcze