Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych. Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące ze szpiku kostnego (BM-MSC) są uważane za złoty standard dla zastosowań inżynierii tkankowej opartej na komórkach macierzystych. Jednak proces, w którym muszą być zbierane, może wiązać się ze znaczną zachorowalnością w miejscu dawczym. W przeciwieństwie do tego, komórki zrębowe pochodzenia tłuszczowego (ASC) są łatwiej dostępne i łatwiejsze do zebrania, co czyni je atrakcyjną alternatywą dla BM-MSC. Podobnie jak BM-MSC, ASC mogą różnicować się w osteogenne komórki rodowe i mogą być wykorzystywane w zastosowaniach inżynierii tkankowej, takich jak wysiew na rusztowaniach w celu stosowania w wadach szkieletu twarzoczaszki. ASC uzyskuje się z frakcji zrębu naczyniowego (SVF) strawionej tkanki tłuszczowej, która jest niejednorodną mieszaniną ASC, komórek śródbłonka naczyniowego i komórek ściennych, komórek mięśni gładkich, perycytów, fibroblastów i komórek krążących. Analiza cytometryczna przepływowa wykazała, że profil znacznika powierzchniowego dla ASC jest podobny do profilu dla BM-MSC. Pomimo kilku opublikowanych doniesień ustalających markery fenotypu ASC, nadal brakuje konsensusu co do profili identyfikujących komórki osteoprogenitorowe w tej niejednorodnej populacji. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wyizolować i wykorzystać subpopulację ASC o zwiększonej zdolności osteogennej do naprawy krytycznych rozmiarów ubytków kalwarii.
Wprowadzenie
Heterogeniczność populacji komórek macierzystych nie jest jeszcze w pełni zrozumiała i pozostaje główną przeszkodą w rozwoju klinicznie skutecznych zastosowań terapeutycznych opartych na komórkach macierzystych. Jednym z najczęstszych sposobów scharakteryzowania heterogenicznej populacji komórek macierzystych jest zastosowanie metody sortowania komórek, takiej jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), w celu oddzielenia komórek na podstawie ich profili ekspresji markerów powierzchniowych. W miarę jak metody sortowania stają się coraz bardziej złożone, możliwe staje się zidentyfikowanie bardziej wyraźnych funkcjonalnych subpopulacji komórek. Technologie mikroprzepływowe są coraz częściej wykorzystywane do analizy ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki. Multipleksowana ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) w układzie mikroprzepływowym pozwala na skuteczną i niezawodną analizę transkrypcji pojedynczej komórki w wysokiej rozdzielczości. 1-5
W poprzednim badaniu wykorzystującym profilowanie transkrypcyjne pojedynczej komórki 48 genów, zaobserwowano znaczną heterogeniczność transkrypcji wśród ASC. 6 Jednak dystrybucja genów MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 wykazywała silny związek z klastrem komórek o wysoce osteogennych profilach transkrypcyjnych. Aby wyizolować komórki zgodnie z tym osteogennym profilem ekspresji genów, wzorce ekspresji antygenu powierzchniowego skorelowano z wzorcami transkrypcji, a następnie odkryto, że ekspresja markera powierzchniowego endoglinu (CD105) ściśle koreluje ze zwiększonym potencjałem różnicowania osteogennego ASC. Niezależnie od ekspresji CD105, ekspresja receptora powierzchniowego Thy-1 (CD90), białka błonowego połączonego z glikozylofosfatydyloinozytolem, jak wcześniej wykazano przez Chen i wsp., że jest związane z komórkami osteoprogenitorowymi, była również skorelowana z ekspresją genów osteogennych. 6,7 Odkrycia te dają możliwość prospektywnego wyizolowania subpopulacji w ramach większej heterogenicznej puli ASC o zwiększonej zdolności osteogennej do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej opartej na komórkach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie próbki pacjentów zostały pobrane za świadomą zgodą, a protokoły eksperymentalne zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Stanforda (Protokoły #2188 i #9999).
1. Izolacja komórek i hodowla:
- Pozyskanie ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej od zdrowych pacjentek poddawanych planowej lipoaspiracji brzucha, boku i/lub uda w znieczuleniu miejscowym/ogólnym. Upewnij się, że uzyskano zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) na protokół izolacji ASC z tkanek ludzkich i przestrzegaj instytucjonalnych środków ostrożności podczas pracy z takimi materiałami.
- Aby uzyskać SVF z lipoaspirowanej tkanki tłuszczowej, należy najpierw trzykrotnie przemyć lipoaspirat równymi objętościami 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Ostrożnie zassać i wyrzucić dolną warstwę wodną.
- Przygotuj bufor do trawienia kolagenazy: 0,075% kolagenazy typu I w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS). Przygotuj bufor FACS: 2% FBS, 1% P188 i 1% Pen-Strep w PBS. Przefiltruj oba roztwory za pomocą dostępnego na rynku filtra polieterosulfonowego o wielkości porów 0,22 μm o szybkim przepływie.
- Aby strawić przemytą tkankę tłuszczową, dodać równą objętość buforu do wytrawiania kolagenazy i bezpiecznie umieścić naczynie wytrawiające w łaźni wodnej z wytrząsaniem na 60 minut w temperaturze 37 °C (około 180 wstrząsów/min).
UWAGA: Najlepiej jest używać naczynia do wytrawiania o większej objętości niż jest to wymagane, ponieważ pozwala to na maksymalne trawienie podczas wytrząsania (tj. 250 ml buforu do trawienia kolagenazy, 250 ml umytej tkanki tłuszczowej w sterylnej kolbie o pojemności 1L). - Zneutralizować aktywność enzymatyczną, dodając równą objętość buforu FACS i pozostawiając w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie odwirować przy 233 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu SVF o dużej gęstości.
- Zawiesić osad w 5-10 ml buforu do lizy krwinek czerwonych RT, w zależności od wielkości osadu. Pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut i odwirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 5-10 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej, w zależności od wielkości osadu (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]/10% FBS/1% roztwór penicyliny-streptomycyny [pen-strep]).
- Przefiltruj zawiesinę przez nylonowe sitko o średnicy 100 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
- Wirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu.
- Zawiesić osad w 5-10 ml tradycyjnej pożywki wzrostowej, w zależności od wielkości osadu.
- Umieścić 2 x 106 komórek w standardowym naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm i założyć kultury pierwotne O/N w temperaturze 37 °C/21%O2, 5% CO2 . Utrzymywać na poziomie sub-konfluentnym, aby zapobiec spontanicznemu różnicowaniu w temperaturze 37 °C/21%O2, 5% CO2 w pożywkach wzrostowych.
UWAGA: Gęstość komórek w całkowicie zlewającej się płytce o długości 15 cm wynosi około 4-6 x 106 komórek.
2. Barwienie
- Hodowla ASC w tradycyjnym podłożu wzrostowym w temperaturze 37 °C/21% O2, 5% CO2 przez 36 godzin przed barwieniem/sortowaniem.
- Usunąć ASC z płytek hodowlanych za pomocą Accutase (zgodnie z protokołem producenta).
- Umyj komórki raz buforem FACS (PBS z 2% FBS i 1% paciorkowcem).
- Wirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić komórki w 0,5-1 ml buforu FACS (w zależności od liczby komórek i ilości pożądanego przeciwciała).
UWAGA: Objętość zawiesiny komórek, zgodnie z zaleceniami producenta przeciwciał FACS, określa stężenie przeciwciał. Jednak miareczkowanie stężenia przeciwciał przy użyciu stężenia początkowego 1:100 jest zwykle zalecane, jeśli stosuje się przeciwciało po raz pierwszy. - Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
- Zarezerwować 100 ul. podwielokrotności w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml do użycia dla niebarwionej próbki i jednokolorowych próbek kontrolnych (w zależności od liczby użytych przeciwciał fluorescencyjnych).
- Dodać odpowiednie znakowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne (w określonych stężeniach, zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubować przez 20-30 minut na lodzie, osłonięty przed światłem.
- Aby oznaczyć subpopulację osteogenną: Rozcieńczyć anty-CD90 (APC anty-ludzki CD90 (Thy1)) lub anty-CD105 (FITC anty-ludzki CD105 (endoglin)) w buforze FACS do stężenia 1:50.
- Aby oznaczyć inne populacje komórek (np. komórki krwiotwórcze i śródbłonka): Rozcieńczyć anty-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), anty-CD34 (Anti-Human CD34 APC) i/lub anty-CD31 (Anti-Human CD31 PE) w buforze FACS do stężenia 1:50.
- W przypadku niestosowania przeciwciał sprzężonych bezpośrednio, należy użyć biotynylowanego przeciwciała pierwszorzędowego z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym ze streptawidyną, takim jak streptawidyna PE-Cy7, w rozcieńczeniu 1:100.
- Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie: napełnić probówki buforem FACS i odwirować przy 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zasysając supernatant.
- Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 400-500 μl i przefiltrować próbki przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm w celu usunięcia grudek komórek.
- Przenieść oznakowane komórki do probówek FACS z filtrem i przechowywać próbki na lodzie przez cały czas analizy.
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją
UWAGA: Poniższe kroki wymagają wcześniejszej wiedzy na temat sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) lub pomocy wykwalifikowanego technika.
- Korzystając z odpowiedniego oprogramowania FACS, zaprojektuj wykresy analityczne w celu zbadania rozproszenia do przodu (FSC), rozproszenia bocznego (SSC), fikoerytryny (PE)-Texas Red, błękitu pacyficznego, izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), allofikocyjaniny (APC) i dowolnego innego fluoroforu używanego do znakowania komórek.
- Przed załadowaniem do sortownika komórek należy na krótko zawirować każdą próbkę, aby ponownie zawiesić komórki.
- Rozpocznij od analizy niebarwionej próbki w celu ustawienia bramek dla całej populacji komórek, wykluczenia resztek komórkowych i określenia podstawowej autofluorescencji.
- Dodać jodek propidyny (PI) do niebarwionej próbki i przeanalizować ją w celu wizualizacji populacji żywych komórek w całej populacji komórek. Zbuduj bramę wokół tej populacji.
- Przeanalizuj jednokolorową próbkę kontrolną dla każdego fluorochromu w celu ustawienia kompensacji fluorescencji.
- Przeanalizuj zabarwioną próbkę, aby ustawić położenie bramek do sortowania.
- Dodaj PI do barwionej próbki w celu wybarwienia martwych komórek.
- Sortowanie oznaczonych populacji komórek. Sortować do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml lub probówek stożkowych (15 ml) zawierających pożywkę hodowlaną.
- Ręcznie przerwij sortowanie po uzyskaniu wymaganej liczby komórek.
- Korzystając z FACS, przeprowadź kontrolę czystości, analizując niewielką frakcję (np. 500 komórek) pozyskanej populacji komórek.
UWAGA: Ten krok potwierdza czystość posortowanych populacji komórek. Idealnie, czystość powinna być większa niż 90-95%. - Odwirować komórki w temperaturze 233 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C natychmiast po zakończeniu sortowania i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki zawierającej 10% FBS.
UWAGA: Ilość użytego podłoża może zostać zwiększona w zależności od wielkości osadu komórkowego. - Płytka na płytkach pokrytych żelatyną w celu poprawy żywotności komórek. W zależności od końcowej wydajności komórek, płytka 300 000 komórek na dołek w płytce 6-dołkowej, 100 000 komórek na studzienkę w płytce 12-dołkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystanie CD90 jako markera dla komórek o zwiększonym potencjale osteogenicznym pozwala na wyizolowanie silnie wzbogaconych populacji ludzkich ASC (Rysunek 1A, 1B). Komórki ASC barwiono przeciwciałami anty-ludzkimi CD45 sprzężonymi z Pacific Blue, anty-ludzkimi CD105 sprzężonymi z FITC oraz anty-ludzkimi CD90 sprzężonymi z APC. Po sortowaniu poziom czystości wynosił ponad 98%, co potwierdzono w analizie po sortowaniu.
Zdefiniowanie grup komórek na podstawie profilów transk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecnie izolacja jednorodnych subpopulacji ASC z SVF ludzkiej tkanki tłuszczowej pozostaje trudnym, choć pożądanym celem. Izolacja proosteogennych subpopulacji ASC jest szczególnie pożądana, ponieważ takie komórki mogą być wykorzystywane do badania powstawania i homeostazy tkanek szkieletowych. Jednak SVF tkanki tłuszczowej wykazuje znaczną niejednorodność pod względem pojemności komórek macierzystych i potencjału różnicowania. 11 Molekularnych podstaw tej niejednorodności nie można zrozumieć na podstawie zbio...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Żaden z autorów nie ma interesu finansowego w żadnym z produktów, urządzeń lub leków wymienionych w tym manuskrypcie. Żaden z autorów nie ma konkurencyjnego interesu finansowego do zgłoszenia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant National Institutes of Health Research R01-DE021683-01 oraz grant National Institutes of Health Research R01-DE019434 dla M.T.L.; Stypendium badawcze Howard Hughes Medical Institute dla M.T.C. D.C.W. było wspierane przez A.C.S Franklin Martin Faculty Research Fellowship, The Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine oraz Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Jednorazowe probówki stożkowe 250 ml | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, wysoka glukoza, Suplement GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antyseptyczny roztwór powidonu/jodu | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Zbilansowany roztwór soli Hanka, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenie z USA | Gibco | 16000-044 | |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (zamiennik Pacific Blue) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anty-ludzki CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anty-ludzki CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptawidyna PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Instrument Aria II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Oprogramowanie | BD Biosciences |
Bibliografia
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
- Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
- Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
- Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
- Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
- Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
- James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720(2009).
- Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
- Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211(2011).
- Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585(2013).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
- Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
- McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
- Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8(2014).
- Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
