Opisujemy technikę pomiaru sztywności aorty na podstawie jej relacji ciśnienie-średnica in vivo u myszy. Średnica aorty jest rejestrowana za pomocą ultradźwięków, a ciśnienie w aortze jest mierzone inwazyjnie za pomocą półprzewodnikowego cewnika ciśnieniowego. Ciśnienie krwi zmienia się stopniowo i mierzy się uzyskaną średnicę.
Artykuł metodologiczny
Pomiar sztywności aorty wstępującej in vivo u myszy za pomocą ultradźwięków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedstawiamy protokół pomiaru in vivo sztywności aorty u myszy za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości. Średnicę aorty mierzy się za pomocą ultradźwięków, a ciśnienie krwi w aorcie mierzy się inwazyjnie za pomocą cewnika ciśnieniowego w stanie stałym. Ciśnienie krwi jest podnoszone, a następnie stopniowo obniżane przez dożylny wlew leków wazoaktywnych fenylefryny i nitroprusydku sodu. Średnica aorty jest mierzona dla każdego kroku ciśnienia, aby scharakteryzować stosunek ciśnienia do średnicy aorty wstępującej. Na podstawie zebranych danych można obliczyć wskaźniki sztywności wynikające z zależności ciśnienie-średnica. Obliczanie zgodności tętniczej jest opisane w niniejszym protokole.
Ta technika może być wykorzystana do zbadania mechanizmów leżących u podstaw zwiększonej sztywności aorty związanej z chorobami układu krążenia i starzeniem się. Technika ta daje fizjologicznie istotną miarę sztywności w porównaniu z podejściami ex vivo, ponieważ fizjologiczne wpływy na sztywność aorty są uwzględniane w pomiarze. Podstawowym ograniczeniem tej techniki jest błąd pomiaru wynikający z ruchu aorty podczas cyklu pracy serca. Ruch ten można skompensować, dostosowując położenie sondy do ruchu aorty, a także wykonując wiele pomiarów zależności ciśnienie aorty do średnicy i zwiększając wielkość grupy eksperymentalnej.
Wprowadzenie
Zwiększona sztywność aorty jest cechą charakterystyczną chorób sercowo-naczyniowych. Wykazano, że starzenie się1, palenietytoniu2, cukrzyca3, hiperlipidemia4 i inne czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych zwiększają sztywność aorty. Badania epidemiologiczne wykazały ponadto, że sztywność aorty jest silnym niezależnym czynnikiem prognostykicznym wystąpienia choroby niedokrwiennej serca i udaru mózgu, a także występowania zdarzeń sercowo-naczyniowych i śmiertelności5-8. Ze względu na znaczenie kliniczne i zdrowotne zwiększonej sztywności aorty, obecne badania koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i progresji sztywności naczyń krwionośnych. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem dokładnych pomiarów sztywności naczyń krwionośnych w eksperymentalnych modelach chorób sercowo-naczyniowych.
Sztywność materiału można scharakteryzować za pomocą relacji naprężenie-odkształcenie i określić ilościowo jako moduł sprężystości. Liniowy materiał sprężysty odkształca się odwracalnie, a jego naprężenie wzrasta proporcjonalnie do odkształcenia. Aorta i duże tętnice są nieliniowymi ciałami elastycznymi: po rozciągnięciu sztywność tętnicy nie pozostaje stała, ale wzrasta wraz ze stopniem rozdęcia. Ta nieliniowość właściwości mechanicznych dużych tętnic wynika z różnych właściwości sztywności elementów nośnych, a mianowicie elastyny i kolagenu, które tworzą ścianę naczynia. Elastyna jest wysoce rozciągliwa dzięki modułowi sprężystości 0,6 MPa. Dla porównania, kolagen jest bardzo sztywny o module sprężystości 1 GPa9. Początkowa sztywność wykazywana przez aortę przy niższych wartościach odkształcenia jest przypisywana elastynie, podczas gdy wysoka sztywność wykazywana przy wysokich wartościach odkształcenia jest spowodowana kolagenem. Obciążenie jest przenoszone z elastyny na kolagen, gdy naczynie się rozszerza, a ten obszar przenoszenia obciążenia jest miejscem, w którym działa układ naczyniowy. Dlatego przy ciśnieniach fizjologicznych sztywność tętnic zależy od udziału zarówno elastyny, jak i kolagenu10.
Rozmieszczenie i orientacja elastyny i kolagenu różnią się w zależności od warstwy w obrębie ściany tętnicy. W pożywce elastyna, kolagen i komórki mięśni gładkich są zgrupowane w ciasne helisy, które są ułożone koncentrycznie. Taki układ pozwala tętnicy wytrzymać duże obciążenia w kierunku obwodowym. Przydanka składa się głównie z kolagenu z niewielką ilością elastyny, a włókna kolagenowe są zorganizowane w sposób przypominający siatkę. Te włókna kolagenowe są faliste w stanie nieobciążonym i prostują się wraz ze wzrostem obciążenia. Sztywność wzrasta, gdy włókna kolagenowe prostują się, zapobiegając w ten sposób nadmiernemu rozciąganiu i pękaniu tętnicy. Ze względu na organizację strukturalną i różną orientację włókien kolagenowych, tętnice są anizotropowe: wykazywana sztywność zależy od tego, czy naczynie jest rozciągnięte wzdłużnie czy obwodowo11. Sztywność in vivo jest zatem złożeniem sztywności wzdłużnej i obwodowej aorty.
Sztywność tętnic jest zazwyczaj określana in vivo jako podatność lub prędkość fali pulsacyjnej (PWV). Podatność tętnicza definiuje się jako C = ∆D / ∆P, gdzie ∆D to zmiana średnicy, a ∆P to odpowiadająca jej zmiana ciśnienia. Niższe wartości podatności wskazują na sztywniejsze zbiorniki. Podatność jest obliczana na podstawie zależności ciśnienie-wymiar tętnicy i dlatego jest bezpośrednią miarą sztywności. Ponieważ sztywność jest rozsiewana nierównomiernie w układzie naczyniowym12, zgodność powinna być mierzona w tym samym/podobnym miejscu u każdego badanego, aby dokonać miarodajnych porównań między grupami eksperymentalnymi.
Różnica między modułem sprężystości a modułem sprężystości polega na tym, że moduł sprężystości jest znormalizowany do wymiarów materiału. Podatność odzwierciedla zatem sztywność konstrukcyjną, podczas gdy moduł sprężystości odzwierciedla sztywność materiału. Wraz z wiekiem zwiększa się grubość ściany tętnicy i zmniejsza się stosunek elastyny do kolagenu, więc zarówno sztywność strukturalna, jak i sztywność materiału są większe.
W porównaniu do zgodności, PWV jest pośrednią miarą sztywności tętnic. PWV to prędkość, z jaką impuls ciśnienia przemieszcza się wzdłuż tętnicy i zależy od właściwości ściany naczynia. Równanie Moensa-Kortewega służy do modelowania zależności między PWV a modułem sprężystości: PWV2 = E h / (2 ρ r), gdzie E to przyrostowy moduł sprężystości, h to grubość ścianki, ρ to lepkość krwi, a r to promień naczynia. Wyższa wartość PWV sugeruje zatem sztywniejsze naczynie.
Zgodność i moduł sprężystości mogą być mierzone eksperymentalnie ex vivo na wyciętym segmencie naczynia. Aby określić zgodność, segment naczynia jest montowany na miografie ciśnieniowym13,14. Ciśnienie w naczyniu jest zwiększane stopniowo, a wynikająca z tego zmiana średnicy jest śledzona za pomocą wideomikroskopii. Zgodność określa się na podstawie danych dotyczących ciśnienia i średnicy. Przyrostowy moduł sprężystości można zmierzyć za pomocą próby rozciągania. W tych eksperymentach naczynie jest stopniowo rozrywane, a dane dotyczące siły i przemieszczenia są zbierane aż do pęknięcia pierścienia naczynia. Wartości naprężeń i odkształceń można obliczać i wykreślać w celu określenia przyrostowego modułu sprężystości. Te podejścia ex vivo można wykorzystać do oceny zmian właściwości pasywnych, które wpływają na sztywność.
In vivo, oprócz zawartości ścian, na sztywność naczyń wpływa dynamicznie napięcie mięśni gładkich i ciśnienie krwi13,15,16. PWV jest najczęściej stosowaną metodą pomiaru sztywności aorty in vivo w modelach eksperymentalnych. PWV można oznaczyć nieinwazyjnie za pomocą USG Dopplera lub tonometrii aplanacyjnej17. Impuls ciśnienia jest mierzony w dwóch oddzielnych miejscach, a czas potrzebny impulsowi na pokonanie odległości jest prędkością fali tętna. Ponieważ PWV jest mierzona na całej długości aorty, jest to uśredniona wartość sztywności. Duże tętnice są nieliniowo elastyczne, więc sztywność, a tym samym PWV, będzie się zmieniać wraz z ciśnieniem tętniczym. Wyższa wartość PWV może zatem wynikać ze zwiększonej sztywności lub podwyższonego ciśnienia. W związku z tym wartości PWV muszą być znormalizowane do ciśnienia krwi, aby wyciągnąć wnioski na temat sztywności naczynia. Metody pomiaru, które uwzględniają wpływ ciśnienia krwi z pasywnymi właściwościami ściany naczynia krwionośnego oraz działaniem mediatorów wazoaktywnych, które zmieniają ton, dałyby fizjologicznie istotny wskaźnik sztywności tętnic. Podejście to jest realizowane poprzez inwazyjny pomiar PWV za pomocą cewnika z dwoma czujnikami ciśnienia oddzielonymi w ustalonej odległości13. Ten cewnik o podwójnym ciśnieniu jest wprowadzany do aorty, a leki wazoaktywne, takie jak fenylefryna lub nitroprusydek sodu, są podawane dożylnie przez cewnik żylny w celu podniesienia i obniżenia ciśnienia tętniczego.
Ten protokół opisuje metodę określania sztywności aorty in vivo na podstawie jej zależności ciśnienie-wymiar w modelu mysim. Takie podejście ma kilka zalet w porównaniu z inwazyjnym pomiarem PWV. Wskaźniki sztywności, takie jak podatność, można obliczyć na podstawie danych dotyczących wymiaru ciśnienia zebranych za pomocą tej procedury. Co więcej, technika ta pozwala na pomiar miejscowej sztywności aorty, ponieważ sztywność jest mierzona z jednego miejsca. Takie podejście jest szczególnie przydatne w pomiarze sztywności aorty wstępującej, ponieważ krótka długość tego obszaru utrudnia uzyskanie pomiaru PWV. Zainteresowanie badawcze jest szczególnie związane z aortą wstępującą, ponieważ jej właściwości mechaniczne wpływają na perfuzję krążenia wieńcowego i odpowiedź serca na dysfunkcję naczyń krwionośnych.
Aby zmierzyć stosunek ciśnienia do średnicy aorty in vivo, wizualizuje się aortę wstępującą, a jej średnicę mierzy się za pomocą obrazowania ultradźwiękowego. Ciśnienie krwi w aorcie mierzy się inwazyjnie za pomocą cewnika ciśnieniowego. Ciśnienie krwi zmienia się stopniowo przez dożylny wlew leków wazoaktywnych. Fenylefryna zwęża naczynia krwionośne i jest stosowana w celu podniesienia ciśnienia w aorcie. Nitroprusydek sodu rozszerza naczynia krwionośne i jest stosowany w celu obniżenia ciśnienia w aorcie. Skurczowe i rozkurczowe średnice aorty oraz odpowiadające im ciśnienie w aorcie są mierzone dla każdego przyrostu ciśnienia. Zgodność można obliczyć na podstawie zebranych danych dotyczących ciśnienia i średnicy.
Protokół
Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa.
1. Przygotowanie roztworów, materiałów i zwierząt
- Przygotować 300 μg/ml roztwór fenylefryny (PE) i 300 μg/ml roztwór nitroprusydku sodu (SNP) w 0,9% roztworze soli fizjologicznej. Przygotować oddzielny roztwór heparyny i soli fizjologicznej, mieszając 1 ml 1 000 j./ml heparyny z 10 ml 0,9% soli fizjologicznej.
UWAGA: Przed użyciem leki powinny mieć temperaturę pokojową. - Wykonaj cewnik do dożylnego wlewu leku z dwóch igieł podskórnych 30 G x 1/2" i rurki z polietylenu PE 10. Aby wykonać cewnik, włóż jedną igłę do jednego końca rurki. Usunąć część igły z drugiej igły podskórnej i włożyć koniec do drugiego końca rurki. Podłączyć cewnik do strzykawki o pojemności 1 ml i napełnić cewnik roztworem heparyny i soli fizjologicznej.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia zawierającej 2-2,5% izofluranu w 100% tlenu. Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne.
- Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść ją na podgrzewanej podkładce do elektrokardiogramu (EKG). Utrzymuj zwierzę na poziomie 2% izofluranu.
- Nałóż maść weterynaryjną lub roztwór soli fizjologicznej na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
2. Wprowadzenie cewnika do żyły ogonowej
- Ponieważ żyły ogonowe znajdują się bocznie po obu stronach ogona, połóż zwierzę na boku, aby uzyskać lepszy dostęp. Przymocuj mysz do podkładki EKG za pomocą taśmy. Upewnij się, że zwierzę jest utrzymywane w cieple, aby przyspieszyć rozszerzenie naczyń krwionośnych żył ogonowych.
- Używając kawałka rurki silastycznej jako opaski uciskowej, zawiąż opaskę uciskową wokół podstawy ogona. Zawiąż opaskę uciskową na tyle mocno, aby zapadły się żyły, ale nie na tyle, aby odciąć krążenie tętnicze. Po 2-3 minutach żyła powinna się wybrzuszyć i stać się bardziej widoczna.
- Delikatnie pociągnij ogon do naciągu. Jedną ręką zegnij ogon pod kątem, a drugą trzymaj igłę równolegle do ogona. Przebij igłę w miejscu, w którym ogon jest zgięty przez skórę do żyły. Krew wepchnie się z powrotem do cewnika, jeśli igła zostanie wprowadzona do żyły.
- Umieść jedną kroplę kleju tkankowego w miejscu, w które wprowadzana jest igła, aby zabezpieczyć cewnik. Zdjąć opaskę uciskową i potwierdzić drożność, wstrzykując sól fizjologiczną z niewielkim oporem.
3. Wprowadzenie cewnika do pomiaru ciśnienia krwi przez tętnicę udową
- Umieścić cewnik ciśnieniowy w strzykawce o pojemności 30 ml wypełnionej wodą destylowaną i podłączyć cewnik do jednostki sterującej ciśnieniem. Namocz cewnik w wodzie, podłączony do prądu, na 30-45 minut podczas ustawiania i zabiegów chirurgicznych.
- Ułóż zwierzę na wznak i przyklej jego łapy do podkładki EKG. Nałóż krem do depilacji na klatkę piersiową i obszar nad tętnicą udową.
- Odczekaj 3-5 minut i usuń krem i włosy. Dokładnie usuń włosy z klatki piersiowej, aby zapobiec artefaktom podczas ultradźwięków. Przetrzyj zarówno klatkę piersiową, jak i tylne kończyny zwilżoną podkładką, aby usunąć nadmiar kremu do depilacji.
- Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj nacięcie w skórze powyżej miejsca tętnicy udowej. Przeprowadź sekcję podskórnej tkanki tłuszczowej, aby odsłonić tętnicę udową. Tętnica udowa jest częściowo pokryta przez jamę brzuszną. Użyj hemostatów, aby odsunąć brzuch. Utrzymuj tkanki wilgotne, przykrywając je wilgotną gazą lub alternatywnie okresowo skrapiając je solą fizjologiczną, aby zapobiec wysychaniu tkanek.
- Za pomocą cienkich kleszczy oddziel nerw od pęczka tętnicz-żyła. Delikatnie przebij osłonkę wokół pęczka tętnica-żyła, aby oddzielić tętnicę od żyły. Przełóż jeden szew wokół tętnicy na bliższym końcu i umieść dwa szwy na dystalnym końcu.
- Bezpiecznie zawiąż najbardziej dystalny szew, aby zatrzymać dystalny przepływ krwi. Użyj hemostatów, aby pociągnąć szew proksymalny, aby tymczasowo zatrzymać przepływ krwi do tętnicy udowej. Użyj mikronożyczek, aby wykonać małe nacięcie w tętnicy udowej. Wykonaj nacięcie w pobliżu dystalnego węzła.
- Skalibruj oprogramowanie do akwizycji danych do cewnika, korzystając z ustawień kalibracji w jednostce sterującej ciśnieniem. Przełącz jednostkę sterującą ciśnieniem z powrotem na odczyt przetwornika i zrównoważ cewnik ciśnieniowy tak, aby cewnik wyprowadzał 0 mm Hg w strzykawce wypełnionej wodą.
- Wprowadzić cewnik do tętnicy udowej. Jedną ręką otwórz nacięcie cienkimi kleszkami, a drugą ręką włóż głowicę cewnika do tętnicy.
- Zawiąż środkowy szew wokół drutu cewnika, aby przymocować cewnik do tętnicy. Rozluźnij szew proksymalny i przesuń cewnik do przodu do aorty brzusznej. Zawiąż szew proksymalny w celu dalszego zabezpieczenia cewnika i zapobieżenia krwawieniu.
- Ostrożnie przesunąć podkładkę EKG z myszą, cewnikiem ciśnieniowym i strzykawką z solą fizjologiczną do etapu obrazowania ultrasonograficznego. Podłącz cewnik do pomiaru ciśnienia krwi do jednostki sterującej ciśnieniem. Umieścić strzykawkę z solą fizjologiczną w pompie strzykawkowej. Pozwól zwierzęciu i cewnikowi zrównoważyć się przez 20 minut.
4. Pomiar średnicy aorty w szerokim zakresie ciśnienia krwi
- Zmniejsz izofluran do 1,5%. Wizualizuj wznoszącą się aortę wzdłużnie w trybie B, korzystając z widoku z długiej osi. Zamontuj przetwornik na systemie szynowym tak, aby ten sam widok był zachowany przez cały czas trwania eksperymentu.
- Na ramie głównej ultrasonografu umieść kursor trybu M na odcinku aorty, który ma być śledzony. Śledź zmianę średnicy aorty w cyklu pracy serca za pomocą trybu M.
- Zmienić sól fizjologiczną w strzykawce na roztwór PE i umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej.
- Zarejestruj tryb M przy wyjściowym ciśnieniu w aorcie. Rozpocznij infuzję od 360 μg/kg/min i podawaj przez 1 minutę, aby ciśnienie w aorcie osiągnęło plateau. W przypadku myszy o masie 25 g dawka ta odpowiada 30 μl/min.
- Nagraj tryb M, a następnie przerwij infuzję i odczekaj 2 minuty, aż ciśnienie krwi powróci do wartości wyjściowej.
- Zmniejszenie szybkości infuzji do 240 μg/kg/min. W przypadku myszy o masie 25 g dawka ta odpowiada 20 μl/min. Rozpocznij infuzję, podawaj przez 1 minutę, aby ciśnienie krwi się ustabilizowało i zapisz tryb M. Należy przerwać infuzję i odczekać 2 minuty, aż ciśnienie krwi powróci do wartości wyjściowej.
- Powtórz krok 4.4 dla 120 μg/kg/min PE (10 μl/min dla myszy 25 g).
- Zastąp PE solą fizjologiczną i wlej sól fizjologiczną z szybkością stosowaną do infuzji 360 μg/kg/min (30 μl/min dla myszy 25 g). Podawać w infuzji przez 2-3 minuty, aż dalsza infuzja nie spowoduje wzrostu ciśnienia w aorcie i ciśnienie powróci do wartości wyjściowej. Odczekaj 5 minut, aż ciśnienie krwi ustabilizuje się na początku badania.
- Zamień sól fizjologiczną na SNP.
- Zarejestruj tryb M przy wyjściowym ciśnieniu w aorcie. Infuzję należy rozpocząć od dawki 240 μg/kg/min (20 μl/min dla myszy 25 g) i podawać w infuzji przez 1 minutę. Gdy ciśnienie w aorcie osiągnie plateau, zapisz tryb M. Należy przerwać infuzję i odczekać 2 minuty, aż ciśnienie krwi powróci do wartości wyjściowej.
- Zmniejsz szybkość infuzji do 120 μg/kg/min (10 μl/min dla myszy 25 g). Rozpocznij infuzję, podawaj przez 1 minutę, aby ciśnienie krwi się ustabilizowało i zapisz tryb M. Należy przerwać infuzję i odczekać 2 minuty, aż ciśnienie krwi powróci do wartości wyjściowej.
- Powtórz krok 4.8 dla SNP 60 μg/kg/min (5 μl/min dla myszy 25 g).
5. Zakończenie eksperymentu
- Aby poddać zwierzę eutanazji, zwiększ izofluran do 4%. Gdy oddech zwolni, zwykle w ciągu 1-2 minut, przeciąć mostek nożyczkami, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce.
- Chwyć serce średnimi kleszczami i wytnij je z ciała, przecinając nożyczkami aortę wstępującą.
Wyniki
Obraz podłużny lewej komory i aorty wstępującej jest rejestrowany w trybie B, jak pokazano na Rysunku 1. Alternatywnie można uzyskać obraz podłużny samej aorty, jak na Rysunku 2. Ruch ściany aorty podczas cyklu sercowego pojawia się jako dwie białe linie w trybie M, jak pokazano na Rysunku 3. Światło aorty to obszar pomiędzy liniami. Ciśnienie w aorcie jest modulowane poprzez infuzję leków naczynio czynnych. PE podnosi ciśnienie w aorcie, co pokazano na Rysunku 4A, a SNP obniża ciśnienie, co pokazano na Rysunku 4B. Tryb M jest rejestrowany, gdy ciśnienie krwi się stabilizuje, 1 min po rozpoczęciu infuzji. Ciśnienie w aorcie jest zmieniane stopniowo poprzez zmianę dawki podawanego leku, jak pokazano na Rysunku 5. Dawka leku jest kontrolowana poprzez tempo infuzji. Wszystkie dawki leków podano w µg/kg/min. Średnice maksymalne i minimalne są mierzone z obrazu w trybie M, pokazanego na Rysunku 3. Średnice te odpowiadają skurczowemu i rozkurczowemu ciśnieniu w aorcie zarejestrowanemu przez cewnik pomiarowy.
Wartości średnicy oraz ciśnienia skurczowego i rozkurczowego mierzone są dla trzech cykli serca w stanie spoczynkowym oraz dla każdej dawki PE i SNP. Odchylenie standardowe pomiędzy trzema pomiarami średnicy przy jednej dawce leku wynosi od 0,01 mm do 0,04 mm. Średnicę aorty można nanieść na wykres w zależności od odpowiadającego jej ciśnienia aorty, aby zilustrować zależność między ciśnieniem a średnicą, jak pokazano na Rysunku 6A.
Wartości te, określające zależność ciśnienia od średnicy, są wykorzystywane do obliczenia podatności aorty. Podatność tętnic oblicza się według wzoru
C = (Dsys– Ddia) / (Psys– Pdia)(1)
gdzie Dsys i Ddia to średnice skurczowa i rozkurczowa, a Psys i Pdia to ciśnienia skurczowe i rozkurczowe. Podatność oraz średnie ciśnienie w aorcie (MAP) oblicza się w stanie wyjściowym oraz dla każdej dawki PE i SNP. Podatność jest naniesiona na wykres w funkcji MAP, aby wykazać zależność sztywności od ciśnienia. Ze względu na nieliniową sprężystość aorty, podatność maleje wraz ze wzrostem MAP, co przedstawiono na Rysunku 6B.
Rysunek 1: Widok podłużny aorty wstępującej w trybie B. Pomiary średnicy wykonuje się na obrazie podłużnym aorty wstępującej wychodzącej z lewej komory. LV: lewa komora; PA: tętnica płucna; AA: aorta wstępująca. Wizualizacja tętnicy płucnej zależy od ułożenia głowicy. Średnicę aorty mierzy się dystalnie w stosunku do zastawki aortalnej. Częstotliwość głowicy użytej do wykonania tego obrazu wynosi 40 MHz.
Rycina 2: Alternatywny widok aorty wstępującej w trybie B. Aorta wstępująca jest bardziej widoczna, natomiast lewa komora i ściany serca są mniej wyraźne. AA: aorta wstępująca; LV: lewa komora. Częstotliwość głowicy użytej do zarejestrowania tego obrazu wynosi 40 MHz.
Rysunek 3: Aorta w trybie M. Średnicę aorty mierzy się na obrazie z trybu M. Ruch ściany aorty widoczny jest jako dwie faliste linie. Przestrzeń między tymi liniami stanowi światło aorty. W trybie M mierzone są skurczowe i rozkurczowe średnice aorty z trzech cykli serca. Na tym obrazie ciśnienie aorty zarejestrowane za pomocą cewnika ciśnieniowego, sygnał EKG oraz cykl oddechowy wyświetlone są odpowiednio na czerwono, zielono i żółto. Częstotliwość głowicy użytej do rejestracji tego obrazu wynosi 40 MHz, a prędkość przesuwu akwizycji to 1,200 Hz.
Rycina 4: Stopniowa zmiana ciśnienia w aorcie. Ciśnienie w aorcie jest zmieniane stopniowo poprzez dawkę podawanego leku. Dawka leku jest regulowana za pomocą szybkości infuzji. Wszystkie dawki podano w µg/kg/min.
Rysunek 5: Modulowanie ciśnienia aortalnego lekami naczyniokurczowymi i naczyni rozszerzającymi. Ciśnienie aortalne wzrasta po infuzji leku naczyniokurczowego fenylefryny (PE) i spada po infuzji leku naczyniorozszerzającego nitroprusydu sodu (SNP). Ciśnienie aortalne stabilizuje się na plateau 1 min po rozpoczęciu infuzji leku. W fazie plateau rejestrowany jest tryb M średnicy aorty. (A) przedstawia wzrost ciśnienia aortalnego przy infuzji PE w dawce 360 µg/kg/min. (B) przedstawia spadek ciśnienia aortalnego przy infuzji SNP w dawce 240 µg/kg/min. Na zapisach zaznaczono czas rozpoczęcia infuzji oraz czas rejestracji w trybie M. Ciśnienie aortalne zmienia się stopniowo w zależności od podanej dawki leku. Dawka leku jest regulowana poprzez szybkość infuzji. Wszystkie dawki podano w µg/kg/min.
Rysunek 6: Wykresy zależności średnicy od ciśnienia oraz podatności od średniego ciśnienia aortalnego. Średnicę aorty można nanieść na wykres w funkcji odpowiadającego jej ciśnienia aortalnego, aby przedstawić zależność ciśnienie-średnica (A). Podatność można obliczyć dla każdego przyrostu ciśnienia i nanieść na wykres w funkcji średniego ciśnienia aortalnego (MAP), aby wykazać zależność sztywności aorty od ciśnienia (B).
Dyskusja
Wykonywanie pomiarów średnicy przy kilku przyrostach ciśnienia w szerokim zakresie wartości ciśnienia jest niezbędne do dokładnego scharakteryzowania zależności ciśnienie-średnica. Górne i dolne granice ciśnienia, które mogą być indukowane farmakologicznie, mogą się różnić w zależności od grupy eksperymentalnej, ale idealny zakres wynosi około 25 mm Hg do 125 mm Hg rozkurczowych i 50 mm Hg do 200 mm Hg skurczowych. Dawki 360 μg/kg/min PE i 240 μg/kg/min SNP na ogół wywołują granice zakresu ciśnień. Jednak dawki PE można zwiększyć do 480 μg/kg/min, a SNP do 360 μg/kg/min w celu sprawdzenia, czy limity zostały osiągnięte. Stężenia robocze PE i SNP można zmniejszyć, aby uzyskać drobniejsze przyrosty ciśnienia. Ponieważ średnica będzie się zmieniać wraz z ciśnieniem w aorcie, indukowanie tych samych wartości ciśnienia między zwierzętami i grupami doświadczalnymi nie jest ważne.
Kanilęcję żylną i tętniczą można wykonać w innych lokalizacjach z takimi samymi wynikami. Kaniulacja żyły ogonowej może być trudna ze względu na mały rozmiar żyły ogonowej. Co więcej, żyła ogonowa nie jest łatwo widoczna u myszy o ciemnym umaszczeniu. Alternatywnie można kaniulować żyłę udową. Ta trasa może być łatwiejsza, ponieważ żyła udowa jest bardziej dostępna. W celu wprowadzenia cewnika ciśnieniowego, oprócz tętnicy udowej, cewnik można wprowadzić przez tętnicę szyjną. Tętnica udowa jest jednak lepsza niż tętnica szyjna, ponieważ obszar klatki piersiowej pozostaje nienaruszony podczas obrazowania ultrasonograficznego. Kaniulacja tętnicy udowej może być trudniejsza, ponieważ tętnica udowa jest mniejsza. Użycie cewnika 1,2 F i wprowadzenie cewnika do bliższej tętnicy udowej poniżej jamy brzusznej ułatwi proces kaniulacji. Umieszczenie kilku kropli środka rozszerzającego naczynia krwionośne, takiego jak lidokaina, na tętnicy udowej lub użycie wprowadzacza cewnika, może również pomóc w powiększeniu naczynia, aby ułatwić wprowadzenie cewnika. Z cewnikiem ciśnieniowym należy obchodzić się i używać go zgodnie z instrukcjami producenta.
Lokalizacja cewnika w aorcie nie musi być spójna u zwierząt, ponieważ spadek ciśnienia w aorcie jest nieznaczny. Jednak umieszczenie cewnika w aorcie brzusznej może być lepsze, aby zminimalizować zakłócenia w obrazowaniu ultrasonograficznym aorty piersiowej. Niektóre ultrasonograficzne komputery mainframe mogą rejestrować ciśnienie w czasie rzeczywistym za pomocą śledzenia w trybie M, zapewniając w ten sposób pomiar ciśnienia dla każdej średnicy mierzonej w trybie M. Niestety, ponieważ miejsce, w którym mierzona jest średnica, nie jest tym samym miejscem, w którym rejestrowane jest ciśnienie, istnieje opóźnienie między ciśnieniem zarejestrowanym na cewniku a rzeczywistym ciśnieniem w aorcie wstępującej. W związku z tym do analizy danych można używać tylko pomiarów maksymalnej i minimalnej średnicy.
Podstawowym ograniczeniem tej metody jest niepewność pomiaru wprowadzana przez przesuwanie się aorty do i z płaszczyzny ultrasonograficznej podczas cyklu pracy serca. Błąd wprowadzony ruchem jest wspólny dla wszystkich badań opartych na obrazowaniu, w tym MRI i CT. Strategie kompensacji obejmują wykorzystanie cech anatomicznych do przesunięcia układu odniesienia wraz z ruchem18 i są realizowane podczas przetwarzania danych. Ponieważ oprogramowanie do kompensacji ruchu nie jest łatwo dostępne, badacz musi zachować czujność przy dostosowywaniu lokalizacji sondy, aby śledzić zmianę lokalizacji aorty wraz ze wzrostem i spadkiem ciśnienia krwi. Pomiary średnicy należy również wykonywać przez środek aorty. Jednak ustalenie, czy miejsce zapisu w trybie M przechodzi przez środek, może być trudne do oceny na obrazie ultrasonograficznym, zwłaszcza przy zmieniających się pozycjach aorty. Niepewność wynikająca z tych ograniczeń przejawia się w stopniu rozproszenia danych, co widać na rysunku 6. Rozwiązaniem może być uzyskanie obrazu przekroju poprzecznego zamiast osi podłużnej aorty wstępującej. Jednak uzyskanie tego widoku może być czasami trudniejsze, a wynikowy ślad trybu M może być mniej wyraźny. Obwód przekroju poprzecznego z obrazu w trybie B można było zmierzyć zamiast średnicy z obrazu w trybie M. Jednak określenie, kiedy osiągnięto maksymalny i minimalny obwód, będzie ograniczone przez liczbę klatek na sekundę w trybie B i może być trudniejsze do oceny niż w trybie M.
Wykonanie wielu pomiarów wykresu ciśnienie-średnica i zwiększenie wielkości grupy eksperymentalnej może poprawić dokładność danych. Dane dotyczące średnicy ciśnienia można zbierać z kilku miejsc wzdłuż klatki piersiowej. Protokół ten byłby najpierw przeprowadzany z sondą umieszczoną w jednym miejscu na klatce piersiowej. Następnie aorta zostałaby uwidoczniona z sondą umieszczoną w innym miejscu i protokół zostałby powtórzony.
Środki wazoaktywne stosowane do modulacji ciśnienia krwi mogą potencjalnie wpływać na napięcie mięśni gładkich aorty, co z kolei wpływa na sztywność. Wykazano jednak, że manipulacja ciśnieniem w aorcie poprzez powrót żylny powoduje podobne zmiany w inwazyjnie mierzonym PWV, jak manipulacja farmakologiczna u szczurów. Wyniki te pokazują, że wlew leków wazoaktywnych działa przede wszystkim na tętnice obwodowego oporu i nie wpływa znacząco na napięcie mięśni gładkich aorty19.
Protokół ten można wykonać u szczurów z kilkoma niewielkimi modyfikacjami. Klatka piersiowa jest golona przed nałożeniem kremu do depilacji. Dostępny na rynku cewnik 27 G x 1/2" służy do infuzji leków. Dawki leków stosowane do modulacji ciśnienia w aorcie wynoszą 40, 80 i 120 μg/kg/min PE oraz 40, 80 i 120 μg/kg/min SNP.
Oprócz aorty wstępującej, za pomocą tego protokołu można określić regionalne różnice w sztywności aorty. Sztywność regionalna mierzona za pomocą tego podejścia byłaby bardziej precyzyjna niż za pomocą PWV, ponieważ pomiary są wykonywane z jednego miejsca, a nie z dwóch miejsc dla PWV. Jednak obszary wzdłuż aorty, które można zmierzyć za pomocą tej techniki, są ograniczone do tych, które można uwidocznić za pomocą ultradźwięków.
Moduł sprężystości można również obliczyć na podstawie danych zebranych tą metodą, jeśli można uzyskać pomiar grubości ścianki. Dokładny pomiar in vivo aorty myszy jest ograniczony przez ograniczenia rozdzielczości obecnej technologii ultradźwiękowej. Przyszłe udoskonalenie technologii ultradźwiękowej może sprawić, że pomiar grubości ścianek in vivo stanie się bardziej wykonalny. Alternatywnie pomiary grubości można wykonywać ex vivo. Miografia ciśnieniowa zapewniłaby najdokładniejsze pomiary, ponieważ grubość można zmierzyć przy każdym wzroście ciśnienia.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant National Heart, Lung, and Blood Institute 1RO1-HL-105296-01 (dla D.E. Berkowitza) oraz DP110101134 grantu Australian Research Council (dla A. Avolio).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt | |||
| Ultrasonograf o wysokiej rozdzielczości Przetwornik | Visual Sonics | Vevo2100 | |
| 13-24 MHz Visual | Sonics | MS250 | Używany do obrazowania szczurów |
| Przetwornik 22-55 MHz | Visual Sonics | MS550D | Używany do obrazowania myszy |
| Stacja obrazowania | Visual Sonics | Imagine Station 1 | |
| 1.2F Cewnik ciśnieniowy | Transonic | FTH-1211B-0018 | |
| SP200 Jednostka sterująca ciśnieniem | Transonic | FFS-095-DP01 | |
| Tylko standardowa infuzja Pompa strzykawkowa Harvard Pump 11 Plus | Aparat Harvard | 702208 | |
| Waporyzator izofluranu | VetEquip | 911103 | |
| Komora indukcyjna | VetEquip | 941443 | |
| 100% O2 | Airgas | OX USP200 | |
| Jednostopniowy mosiężny regulator butli ogólnego przeznaczenia 0-50 psi CGA540 | Airgas | Y11215B540 | |
| Stereo Boom Stand Microscope | National Optical | 420-BMSQ | |
| Oświetlacz światłowodowy i światłowód | Cole Palmer | EW-41500-50 | |
| Materiały eksploatacyjne | |||
| 30G x 1/2" BD PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | Do kaniulacji żył ogonowych u myszy |
| Rurka polietylenowa PE10 | Becton Dickinson | 427401 | Do kaniulacji żył ogonowych u myszy |
| 27G x 1/2" Zestaw do infuzji skrzydeł Surfloe | Terumo | SV*27EL | Do kaniulacji żył ogonowych u szczurów |
| Signa Gel Electrode Gel | Parker | 15-25 | Służy do zapisu EKG |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel | Parker | 03-08 | Służy do ultradźwięków |
| 1ml Strzykawki Sub-Q, 26G x 5/8 " | BD | 309597 | |
| Nair | Krem | do depilacji | |
| Histoacryl | TissueSeal | TS1050071FP | Klej do tkanek |
| Pleciony jedwabny szew 6-0 | Teleflex | 104-S | |
| Dumostar P55 drobny kleszcze | Roboz | RS-4984 | |
| Mikronożyczki | WPI | 501839 | |
| Cienkie nożyczki | FST | 14060-11 | |
| Średnie kleszcze | Ted Pella | 5665 | |
| Kleszcze hemostatyczne | Roboz | RS-7131 | |
| Niesterylna bawełniana gąbka z gazy | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| Bawełniana końcówka aplikatory | Oritan | 803-WC | |
| Taśma etykietowa | Fisherbrand | 15-901-20 | |
| Leki | |||
| Chlorek sodu | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Chlorowodorek R-fenylefryny | Sigma Aldrich | P6126 | |
| Nitroprusydek sodu dwuwodny | Sigma Aldrich | 71778 | |
| Oprogramowanie | |||
| Prism | GraphPad | ||
| Excel | Microsoft |
Bibliografia
- Mitchell, G. F., et al. Changes in arterial stiffness and wave reflection with advancing age in healthy men and women - The Framingham Heart Study. Hypertension. 43, 1239-1245 (2004).
- Mahmud, A., Feely, J. Effect of smoking on arterial stiffness and pulse pressure amplification. Hypertension. 41, 183-187 (2003).
- Lehmann, E. D., Gosling, R. G., Sonksen, P. H. Arterial wall compliance in diabetes. Diabet Med. 9, 114-119 (1992).
- Wang, Y. -X., et al. Reduction of cardiac functional reserve and elevation of aortic stiffness in hyperlipidemic Yucatan minipigs with systemic and coronary atherosclerosis. Vasc. Pharmacol. 39, 69-76 (2002).
- Ben-Shlomo, Y., et al. Aortic Pulse Wave Velocity Improves Cardiovascular Event Prediction: An Individual Participant Meta-Analysis of Prospective Data From 17,635 Subjects. J. Am. Coll. Cardiol. 63, 636-646 (2014).
- Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
- Mattace-Raso, F. U., et al. Arterial stiffness and risk of coronary heart disease and stroke: the Rotterdam Study. Circulation. 113, 657-663 (2006).
- Laurent, S., et al. Aortic stiffness is an independent predictor of all-cause and cardiovascular mortality in hypertensive patients. Hypertension. 37, 1236-1241 (2001).
- Fung, Y. C. Biomechanics: Mechanical Properties of Living Tissues. , 2nd edn, Springer. New York, NY. (1993).
- Shadwick, R. E. Mechanical design in arteries. J Exp Biol. 202, 3305-3313 (1999).
- Gasser, T. C., Ogden, R. W., Holzapfel, G. A. Hyperelastic modelling of arterial layers with distributed collagen fibre orientations. Journal of The Royal Society Interface. 3, 15-35 (2006).
- Zieman, S. J., Melenovsky, V., Kass, D. A. Mechanisms, Pathophysiology, and Therapy of Arterial Stiffness. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25, 932-943 (2005).
- Jung, S. M., et al. Increased tissue transglutaminase activity contributes to central vascular stiffness in eNOS knockout mice. Am. J. Physiol.-Heart Circul. Physiol. 305, 803-810 (2013).
- Santhanam, L., et al. Decreased S-Nitrosylation of Tissue Transglutaminase Contributes to Age-Related Increases in Vascular Stiffness. Circ. Res. 107, 117-243 (2010).
- Fitch, R. M., Vergona, R., Sullivan, M. E., Wang, Y. X. Nitric oxide synthase inhibition increases aortic stiffness measured by pulse wave velocity in rats. Cardiovasc. Res. 51, 351-358 (2001).
- Bergel, D. H. The static elastic properties of the arterial wall. The Journal of Physiology. 156, 445-457 (1961).
- Leloup, A. J., et al. Applanation Tonometry in Mice: A Novel Noninvasive Technique to Assess Pulse Wave Velocity and Arterial Stiffness. Hypertension. 21, 21(2014).
- Morrison, T. M., Choi, G., Zarins, C. K., Taylor, C. A. Circumferential and longitudinal cyclic strain of the human thoracic aorta: age-related changes. J Vasc Surg. 49, 1029-1036 (2009).
- Butlin, M., Hammond, A., Lindesay, G., Viegas, K., Avolio, A. P. In vitro and in vivo use of vasoactive agents in characterising aortic stiffness in rats: testing the assumptions. Hypertens. 30, 42(2012).
Przedruki i uprawnienia
