Pomiar szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

Podsumowanie

Poziom w stanie stacjonarnym określonych mRNA jest określany przez szybkość syntezy i rozpadu mRNA. Tempo degradacji mRNA w całym genomie lub tempo rozpadu określonych mRNA można zmierzyć, określając okresy półtrwania mRNA. Protokół ten koncentruje się na pomiarze szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

poziomy mRNA w stanie stacjonarnym różnią się w zależności od warunków środowiskowych. Regulacja poziomów akumulacji mRNA w stanie stacjonarnym zapewnia syntezę odpowiedniej ilości białka dla określonych warunków wzrostu komórki. Jednym z podejść do pomiaru szybkości rozpadu mRNA jest hamowanie transkrypcji, a następnie monitorowanie zaniku już obecnego mRNA. Szybkość rozpadu mRNA można następnie określić ilościowo, a dokładny okres półtrwania można określić za pomocą kilku technik. W przypadku S. cerevisiae opracowano protokoły mierzące okres półtrwania mRNA i obejmują hamowanie transkrypcji mRNA przy użyciu szczepów, które zawierają wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II, rpb1-1. Inne techniki pomiaru okresów półtrwania mRNA obejmują hamowanie transkrypcji za pomocą inhibitorów transkrypcji, takich jak tiolutyna lub 1,10-fenantrolina, lub alternatywnie, poprzez wykorzystanie mRNA, które są pod kontrolą regulowanego promotora, takiego jak promotor indukowany galaktozą i system TET-off. W tym miejscu opisujemy pomiar szybkości rozpadu mRNA S. cerevisiae przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II. Technika ta może być stosowana do pomiaru szybkości rozpadu mRNA poszczególnych mRNA lub w całym genomie.

Wprowadzenie

Transkrypcja i rozpad specyficznego mRNA są kluczowymi determinantami ekspresji genów. Szybkość syntezy i rozpadu określonych mRNA określa poziom w stanie stacjonarnym tego konkretnego mRNA. Poziomy mRNA w stanie stacjonarnym regulują obfitość mRNA i określają, ile każdego mRNA jest dostępne do syntezy białek. Pomiary okresów półtrwania mRNA są szeroko stosowane do określania szybkości rozpadu mRNA. Specyficzne mRNA rozpadają się w różnym tempie, co jest związane z cechami mRNA, funkcją białka kodowanego przez mRNA i warunkami środowiskowymi. W zależności od techniki zastosowanej do określenia szybkości rozpadu mRNA, pomiary szybkości rozpadu można określić globalnie lub dla poszczególnych transkryptów. W drożdżach S. cerevisiae techniki, które są najczęściej stosowane do pomiaru globalnego tempa rozpadu mRNA, obejmują wykorzystanie szczepu drożdży zawierającego wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II i chemicznych inhibitorów transkrypcji, takich jak tiolutyna i 1,10-fenantrolina ^1-5. Metody te mogą być również wykorzystywane do pomiaru szybkości rozpadu poszczególnych mRNA ⁴. Inne metody mogą być również wykorzystane do pomiaru szybkości rozpadu mRNA. Metody te obejmują podejście do znakowania w stanie ustalonym lub wykorzystania cząsteczek mRNA, które są wyrażane z regulowanego promotora, który ulega ekspresji tylko w wybranych warunkach. Każda z tych technik ma pewne zalety i ograniczenia. Opisana tutaj technika wykorzystuje wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II. Metoda ta wykorzystuje S. cerevisiae jako model, ale może być modyfikowana i wykorzystywana w innych systemach przy użyciu specyficznych technik hamowania transkrypcji ⁶.

pomiary okresu półtrwania mRNA przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II są szeroko stosowane zarówno do pomiarów całego genomu, jak i indywidualnych pomiarów rozpadu mRNA ^4-5. Technika ta wymaga użycia specyficznego szczepu drożdży, który zawiera wrażliwy na temperaturę allel polimerazy RNA II, rpb1-1¹. Uzasadnieniem dla tej techniki jest to, że wystawienie wrażliwego na temperaturę szczepu drożdży na niedopuszczalną temperaturę hamuje syntezę mRNA. Następnie rozpad istniejącego wcześniej mRNA jest monitorowany w różnych punktach czasowych po zahamowaniu transkrypcji. Zniknięcie istniejącego wcześniej mRNA jest monitorowane poprzez ekstrakcję RNA z komórek drożdży w różnych punktach czasowych po wyłączeniu transkrypcji. Punkty czasowe, w których zbierane są komórki drożdży, są z góry określone w eksperymencie pilotażowym i zależą od badanych transkryptów i systemu. Szybsze punkty czasowe są używane w przypadku krótkotrwałych transkrypcji, podczas gdy dłuższe punkty czasowe są używane w przypadku dłuższych żyjących transkryptów. Następnie rozpad mRNA jest monitorowany za pomocą analizy northern blot, ilościowego PCR lub RNAseq.

Pomiar okresów półtrwania mRNA przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II ma swoje zalety. Po pierwsze, ta technika jest łatwa i prosta. Po drugie, po pozyskaniu lub wytworzeniu szczepu drożdży w laboratorium, pomiary okresu półtrwania mRNA można określić w różnych warunkach wzrostu; umożliwiające określenie wpływu środowiska na rozpad mRNA. Po trzecie, tempo rozpadu mRNA można monitorować w całym genomie. Stosowanie innych technik hamowania transkrypcji ma również zalety i ograniczenia. Na przykład użycie indukowalnego promotora wymaga subklonowania w celu wytworzenia mRNA, które jest pod kontrolą regulowanego promotora. Tiolutyna nie jest łatwo dostępna i jest droga, gdy jest dostępna. Ponadto sposób działania tiolutyny nie jest w pełni zrozumiały i doniesiono, że wpływa ona na inne procesy komórkowe, w tym hamowanie rozpadu mRNA ⁷. Alternatywnie, 1,10-fenantrolina, jest łatwiej dostępny. Co więcej, wszystkie techniki stosowane do hamowania transkrypcji mogą zaburzać funkcje komórkowe i mogą wpływać na różne mRNA w różny sposób. Badacz musi określić najbardziej odpowiednią metodę do zastosowania w warunkach eksperymentalnych, aby uzyskać najbardziej wiarygodne wyniki. Aby określić, która metoda jest najbardziej odpowiednia do ich zastosowania, badacz musi zidentyfikować transkrypty i funkcję białek kodowanych przez badane transkrypty. Najbardziej wiarygodne pomiary szybkości rozpadu mRNA to te, które są określane przy użyciu wielu technik i wykazują tę samą szybkość rozpadu. Żadna pojedyncza technika nie jest zawsze najlepsza, a najbardziej odpowiednia technika zależy od konkretnej sytuacji.

Liczne badania nad S. cerevisiae mierzyły tempo rozpadu mRNA w różnych warunkach i tłach genetycznych. Warunki, w których mierzy się szybkość rozpadu mRNA, zależą od konkretnego badanego eksperymentu. Pomiar szybkości rozpadu mRNA w różnych środowiskach komórkowych określa, czy badane warunki preferencyjnie wpływają na szybkość rozpadu określonych mRNA. Szybkość rozpadu mRNA może się również różnić w zależności od użytego szczepu drożdży. Na przykład tempo rozpadu mRNA można określić w komórkach drożdży typu dzikiego i komórkach drożdży z niefunkcjonalnym szlakiem degradacji mRNA za pośrednictwem nonsensu (NMD). Ten szlak degradacji mRNA znajduje się we wszystkich organizmach eukariotycznych, które zostały do tej pory zbadane i wyzwala degradację mRNA, które przedwcześnie kończą translację ⁸. NMD został początkowo zidentyfikowany jako szlak, który degraduje mRNA za pomocą kodonów przedwczesnej terminacji lub kodonów nonsensownych, ale obecnie jest uznawany za szlak, który reguluje również ekspresję nonsensownych mRNA zawierających naturalne mRNA. mRNA, które są celami szlaku, są szybko degradowane w komórkach drożdży z funkcjonalnym szlakiem NMD i stabilizowane w komórkach drożdży z niefunkcjonalnym szlakiem NMD. W związku z tym okresy półtrwania mRNA, które są bezpośrednimi celami tego szlaku, są krótsze w komórkach drożdży typu dzikiego w porównaniu z komórkami drożdży z niefunkcjonalnym szlakiem NMD.

Protokół

1. Wzrost komórek drożdży

1. Wybierz odpowiednie szczepy drożdży, które zostaną wykorzystane do pomiarów szybkości rozpadu mRNA. Aby zahamować transkrypcję przy użyciu wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy II RNA, należy użyć szczepów drożdży zawierających mutację rpb1-1 ¹. Zdobądź ten szczep drożdży z laboratorium, które już je posiada, lub wygeneruj go w laboratorium przy użyciu standardowych technik, jeśli wymagane jest określone tło genetyczne⁹.
2. Stosując sterylną technikę, przygotuj pożywkę drożdżową przy użyciu standardowych procedur ¹⁰. Jeśli wybór nie jest wymagany, przygotuj multimedia, takie jak YPD. Alternatywnie, przygotuj selektywne podłoża, jeśli komórki drożdży są przekształcane za pomocą plazmidów i wymagana jest selekcja. Autoklaw pożywki.
3. Hoduj komórki drożdży w temperaturze 28 °C, która jest temperaturą dopuszczalną dla tego szczepu drożdży. Zrób to w dwóch krokach:
   1. W przypadku pierwszego O/N hoduj komórki drożdży w 5 ml pożywki wzrostowej do nasycenia.
   2. Ustaw drugi O/N pod koniec drugiego dnia. W przypadku drugiego O/N należy zaszczepić różne ilości komórek drożdży z pierwszego O/N w 100 do 150 ml pożywki wzrostowej (w zakresie od 100 μl do 1 ml, 2 ml lub więcej, w zależności od tego, kiedy komórki drożdży muszą zostać zebrane następnego dnia). Wykonaj ten krok, aby upewnić się, że następnego dnia jedna z kultur ma prawidłowy OD₆₀₀.

2. Zbierz komórki drożdży

1. Przygotuj się do zebrania komórek drożdży. Czas na ten krok ma kluczowe znaczenie; Oznacz wszystkie wymagane probówki i zbierz cały wymagany sprzęt i materiały w jednym miejscu. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 39 °C i podgrzać dwie 15 ml probówki z podłożem wzrostowym w temperaturze 28 °C i 60 °C.
   UWAGA: Objętość pożywki wzrostowej wynoszącą 15 ml można zmieniać w zależności od liczby punktów czasowych, w których komórki mają zostać pobrane.
2. Zbierz komórki drożdży, gdy osiągną OD₆₀₀ od 0,4 do 0,7. Przenieś komórki do 4 - 6 sterylnych butelek z zakrętką o pojemności 50 ml. Wirować przy 7 500 x g w wirówce szybkoobrotowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osady w 15 ml pożywce wzrostowej, która równoważyła się w temperaturze 28 °C. Zebrać komórki drożdży w jednej sterylnej kolbie o pojemności 250 ml i równoważyć je przez ~5 minut w temperaturze wzrostu 28 °C.
4. Po osiągnięciu przez komórki drożdży równowagi w temperaturze wzrostu, natychmiast dodać 15 ml pożywki wzrostowej o temperaturze 60 °C w celu podniesienia temperatury do 39 °C (temperatura niedopuszczalna) i natychmiast umieścić kolbę w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C. Upewnij się, że pożywka hodowlana pozostaje w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C przez cały pozostały etap pobierania komórek, aby upewnić się, że transkrypcja jest wyłączona.
5. Zebrać komórki w różnym czasie po umieszczeniu kolby w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C. Po raz pierwszy pobrać komórki natychmiast po umieszczeniu kolby w temperaturze 39 °C. Zebrać 3 ml porcji i rozprowadzić 3 ml do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Osadzać komórki przez 10 sekund w mini wirówce lub picofuge z szybkim zwalnianiem i wylać supernatant.
6. Natychmiast zamrozić granulki w kąpieli suchego lodu/etanolu lub w ciekłym azocie. Wyznacz pierwszy punkt czasowy, w którym komórki są zbierane, jako punkt czasu zerowego.
7. Eksperymentalnie określ punkty czasowe, w których komórki są następnie zbierane w eksperymencie pilotażowym, w zależności od interesujących mRNA. Zwykle zbieraj komórki drożdży w następujących punktach czasowych: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 25 i 35 minut (ryc. 2B). Jeśli nie można określić okresu półtrwania mRNA za pomocą wyżej wymienionych punktów czasowych, dostosuj te punkty czasowe. Na przykład w przypadku mRNA z przewidywanymi krótkimi okresami półtrwania należy stosować krótsze punkty czasowe (tj. 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 i 18 minut), a w przypadku mRNA z przewidywanymi długimi okresami półtrwania należy wydłużyć punkty czasowe.
8. Po pobraniu komórek należy je przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji RNA.

3. Ekstrakcja RNA z komórek drożdży

1. W przypadku części protokołu dotyczącej ekstrakcji RNA należy użyć technik wolnych od RNaz, aby zapobiec degradacji RNA przez RNazy. Przygotować roztwory wolne od RNaz, szkło i wyroby z tworzyw sztucznych do użycia w ekstrakcji RNA.
2. Wyodrębnij RNA z komórek drożdży zgodnie ze standardowymi protokołami. Zazwyczaj stosuje się metodę gorącego fenolu ¹². Alternatywnie użyj zestawów, które można użyć do ekstrakcji RNA z komórek drożdży.
3. Określić ilość i czystość RNA, zwykle mierząc absorbancję 2 μl RNA przy A₂₆₀ i A₂₈₀ za pomocą Nanodrop. Określ stężenie RNA z A_260. W oparciu o stężenie rozcieńczyć RNA do 1 μg/μl za pomocą wody uzdatnionej DEPC.
   UWAGA: Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ dostarcza informacji o czystości RNA. Próbka RNA jest czysta, jeśli stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ wynosi 2,0 ± 0,1.

4. Analiza Northern Blot

UWAGA: Użyj northern blot, aby określić ilościowo poziomy mRNA i uzyskać informacje na temat wielkości transkryptów. Ponadto użyj northern blot do wykrycia mRNA, które wytwarzają wiele izoform tego samego mRNA.

1. Przygotuj 1,0% żel agarozowo-formaldehydowy. Uruchomić równe ilości próbki RNA na żelu agarozowo-formaldehydowym za pomocą elektroforezy zgodnie ze standardowymi protokołami ¹². Uruchom drabinkę RNA obok próbek RNA i użyj jej do określenia rozmiarów RNA, które są wykrywane na northern blot. Przed przeniesieniem RNA oddzielonego na żelu agarozowo-formaldehydowym do membrany, należy odciąć pas z drabinką RNA od żelu i uwidocznić za pomocą bromku etydyny.
   UWAGA: Alternatywnie, cały żel można zabarwić bromkiem etydyny przed przeniesieniem RNA.
2. Po tym, jak próbki RNA przeniosą się na odpowiednią odległość na żelu, przenieś RNA do błony przy użyciu technik wolnych od RNazy. Użyj jednego z kilku dostępnych protokołów, aby przenieść RNA do błon ^12-13. Aby przenieść RNA do błony, przytnij błonę do mniej więcej tego samego rozmiaru co żel. Przenieś RNA zgodnie ze standardowymi protokołami ¹².
3. Sieciowanie UV RNA z membraną za pomocą środka sieciującego UV zgodnie z instrukcjami producenta. Alternatywnie piecz membranę w piekarniku nastawionym na 80 °C przez 1 godzinę. Przechowywać membranę w temperaturze -20 °C w plastikowej torbie przez czas nieokreślony, aż zostanie zhybrydyzowana z określonymi sondami.
   UWAGA: Sucha membrana może być również przechowywana w temperaturze pokojowej między bibułami filtracyjnymi.

5. Hybrydyzacja sond komplementarnych do RNA interesującego błonę

UWAGA: Jednym ze sposobów wykrywania mRNA na błonie jest hybrydyzacja ³²sond DNA znakowanych P. UWAGA: Badacze pracujący z ³²P muszą stosować procedury ochronne, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi stosowania materiałów promieniotwórczych.

1. Przygotuj sondę DNA, znakując 25 - 50 ng DNA, które ma być zhybrydyzowane z błoną, zgodnie ze standardowymi protokołami ¹². Wygeneruj fragment DNA przez PCR lub trawienie plazmidowe. Określić specyficzną aktywność sondy DNA, zliczając 1 μl znakowanej radioaktywnie sondy DNA po usunięciu nieinkorporowanych nukleotydów ¹².
2. Podgrzej bufor prehybrydyzacyjny/hybrydyzacyjny w temperaturze 42 °C. Użyj ~10 ml buforu prehybrydyzacji/hybrydyzacji na 100^cm2 membrany ¹².
3. Hybrydyzować 1 - 5 x 10⁶ cpm znakowanej radioaktywnie sondy DNA na ml buforu hybrydyzacyjnego do błony O / N w piecu do hybrydyzacji w celu wykrycia mRNA zainteresowania ¹². Upewnij się, że podczas hybrydyzacji obrót pieca do hybrydyzacji odbywa się w kierunku, który powoduje, że cała membrana jest wystawiona na działanie roztworu hybrydyzacyjnego, aby zapewnić prawidłową hybrydyzację.
4. Przemyć membranę dwa razy w temperaturze pokojowej przez 15 minut 50 ml 2x SSPE i jeden raz w temperaturze 65 °C 50 ml 2x SSPE/2% SDS przez 15 minut ¹². Owiń membranę w folię spożywczą, aby upewnić się, że nie wyschnie ani nie zanieczyści ekranu fosforowego.
5. Korzystając z licznika Geigera, oszacuj intensywność radioaktywności na membranie.
   UWAGA: To oszacowanie zapewnia, że membrana jest wystawiona na działanie ekranu fosforowego przez odpowiedni czas. Dłuższe czasy ekspozycji należy stosować w przypadku membran o niskiej radioaktywności.
6. W przypadku plam północnych użyj kontroli obciążenia, aby potwierdzić, że w każdym miejscu załadowane są równe ilości RNA. Aby to zrobić, zdejmij błonę i ponownie sonduj ją RNA, na który badany proces nie ma wpływu. Zdjąć membranę, umieszczając ją w szklanej tacce zawierającej 200 ml wrzącego roztworu do odpędzania (0,1% SDS/0,01 X SSC) na 2 minuty. Wylej roztwór do usuwania i powtórz procedurę pięć razy ¹²,
   UWAGA: Przykładem RNA używanego jako kontrola obciążenia jest SCR1. SCR1 to transkrypt polimerazy III RNA, który jest stabilny i obfity. Zobacz materiał SCR1 Liczebność RNA nie powinna ulec znaczącej zmianie podczas krótkich okresów hamowania polimerazy II RNA.

6. Określ ilościowo RNA, które jest związane z błoną

UWAGA: Aby określić ilościowo ilość radioaktywności na membranie, wystaw membranę na działanie ekranu fosforowego. Po upływie odpowiedniego czasu naświetlania zeskanuj ekran luminoforowy za pomocą luminowizatora.

1. Zeskanuj ekran luminoforowy, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta luminoforu.
2. Określ ilościowo mRNA w każdym punkcie czasowym. Określ ilościowo poziomy mRNA za pomocą oprogramowania ImageQuant lub oprogramowania pokrewnego. Normalizuj mRNA w każdym punkcie czasowym do kontroli obciążenia. Jeśli SCR1 został użyty jako kontrola obciążenia, znormalizuj okres półtrwania północnych do SCR1.
3. Okres półtrwania mRNA oblicza się, dzieląc ilość mRNA pozostałą w każdym punkcie czasowym przez ilość mRNA obecnego w punkcie czasowym 0 (początkowy punkt czasowy). Wykres procentowy pozostałego mRNA w funkcji czasu na wykresie półlogarytmicznym (Figura 2C). Oblicz okresy półtrwania mRNA za pomocą następującego równania:
   t_1/2 = -0,693/k (minus 0,693)
4. k to nachylenie linii najlepszego dopasowania, a t_1/2 to okres półtrwania mRNA.

Wyniki

Zdolność tego protokołu do dokładnego pomiaru szybkości rozpadu mRNA zależy od zahamowania transkrypcji, zbioru komórek drożdży w odpowiednich punktach czasowych oraz stosowania technik wolnych od RNaz podczas ekstrakcji RNA i analizy northern blotting. Wykrywanie dwóch kontrolnych mRNA, z których jedno jest znane jako niestabilne, a drugie jako stabilne, daje pewność co do poprawności przeprowadzenia eksperymentu. Można to na przykład osiągnąć, stosując sondę wykrywającą zarówno pre-mRNA, jak i mRNA CYH2.

Dyskusja

Hamowanie syntezy mRNA i monitorowanie obrotu mRNA w przypadku braku nowej syntezy jest metodą często stosowaną do pomiaru szybkości rozpadu mRNA. U S. cerevisiae jedną z najczęściej stosowanych metod jest pomiar szybkości rozpadu mRNA poprzez hamowanie transkrypcji za pomocą wrażliwego na temperaturę allelu polimerazy RNA II. Ta metoda specyficznie hamuje polimerazę RNA II. Najbardziej krytyczne etapy określania szybkości rozpadu mRNA przy użyciu tej techniki to: 1) Przed pobraniem komórek drożdży upewnij się, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka szybkoobrotowa	Eppendorf	22628169
Mini wirówka	Fisher Scientific	05-090-100
Membrana Genescreen Plus	PerkinElmer	50-905-0169
Piec do hybrydyzacji	Fisher Scientific	95-0030-01
Spektrofotometr Nanodrop	Thermo Scientific	ND-8000
Ekran fosforowy	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Phosphorimager Typhoon	GE Healthcare Life Sciences	29004080
Sieciownik UV	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatywnie membranę można piec w piekarniku ustawionym na 80° przez 1 godzinę
Bufor prehybrydyzacyjny/hybrydyzacyjny NorthernMax	Life Technologies	AM8677
Szczepy drożdży z mutacją		Szczepy drożdży można uzyskać z laboratorium lub stworzyć na określonym tle

rpb1-1