Artykuł metodologiczny

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

27.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52246

⸱

24 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 4Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Streszczenie

Mapowanie wzorca metylacji DNA jest intensywnie badane w normalnych i chorych tkankach. Opracowano różne metody badania wzorców metylacji cytozyny w komórkach. Opracowano zmniejszoną reprezentację sekwencjonowania wodorosiarczynów całego genomu w celu wykrycia wzorców metylacji cytozyny o rozdzielczości par zasad w loci genomu bogatych w GC. Osiąga się to poprzez połączenie użycia enzymu restrykcyjnego, po którym następuje konwersja wodorosiarczynu. Sekwencjonowanie wodorosiarczynowe o zwiększonej reprezentacji (ERRBS) zwiększa pokrycie biologicznie istotnych loci genomowych i zostało wykorzystane do profilowania metylacji cytozyny w DNA organizmów ludzkich, mysich i innych. ERRBS rozpoczyna trawienie DNA przez enzym restrykcyjny w celu wygenerowania fragmentów o niskiej masie cząsteczkowej do wykorzystania w przygotowaniu biblioteki. Fragmenty te są poddawane standardowej konstrukcji biblioteki w celu sekwencjonowania nowej generacji. Konwersja wodorosiarczynów niemetylowanych cytozyn przed końcowym etapem amplifikacji pozwala na ilościową rozdzielczość bazową poziomów metylacji cytozyny w pokrytych loci genomu. Protokół może zostać wypełniony w ciągu czterech dni. Pomimo niskiej złożoności pierwszych trzech sekwencjonowanych baz, biblioteki ERRBS dostarczają danych wysokiej jakości przy użyciu wyznaczonego toru kontrolnego sekwencjonowania. Następnie przeprowadzane jest mapowanie i analiza bioinformatyczna, które uzyskują dane, które można łatwo zintegrować z różnymi platformami obejmującymi cały genom. ERRBS może wykorzystywać niewielkie ilości materiału wejściowego, co umożliwia przetwarzanie próbek klinicznych u ludzi i ma zastosowanie w wielu zastosowaniach badawczych. Wytworzony film demonstruje krytyczne kroki protokołu ERRBS.

Wprowadzenie

Metylacja DNA w cytozynie (5-metylocytozyna) jest cechą epigenetyczną krytyczną w komórkach ssaków dla różnych procesów biologicznych, w tym, ale nie ograniczając się do imprintingu, inaktywacji chromosomu X, rozwoju i regulacji ekspresji genów1-8. Badanie wzorców metylacji DNA w chorobach nowotworowych i innych zaburzeniach określiło wzorce specyficzne dla choroby i przyczyniło się do zrozumienia patogenezy choroby i potencjalnych odkryć biomarkerów9-17. Istnieje wiele protokołów, które badają epigenom pod kątem statusu metylacji DNA. Można je podzielić na testy oparte na powinowactwie, enzymach restrykcyjnych i konwersji wodorosiarczynów, które wykorzystują mikromacierze lub platformy sekwencjonowania poniżej. Ponadto istnieje kilka protokołów, które łączą te ogólne kategorie, w tym między innymi Połączona Analiza Ograniczeń Wodorosiarczynu18 i Sekwencjonowanie Wodorosiarczynu o Zmniejszonej Reprezentacji (RRBS19).

RRBS został pierwotnie opisany przez Meissnera i wsp.19,20. W protokole wprowadzono etap mający na celu wzbogacenie regionów genomowych bogatych w GC, a następnie sekwencjonowanie wodorosiarczynów, co zaowocowało ilościowymi danymi o rozdzielczości par zasad, które są opłacalne21,22. Regiony bogate w GC są ukierunkowane na enzym restrykcyjny MspI (C^CGG), a metylacja cytozyny jest rozwiązywana przez konwersję cytozyn wodorosiarczynową (deaminacja niezmodyfikowanych cytozyn do uracylu), a następnie amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). RRBS objął większość promotorów genów i wysp CpG w ułamku sekwencjonowania wymaganego dla całego genomu; jednak RRBS miał ograniczony zasięg na wybrzeżach CpG i innych regionach międzygenowych o znaczeniu biologicznym. Kilka grup opublikowało zaktualizowane protokoły RRBS od czasu pierwotnego raportu, które ulepszają metodologię i wynikowe pokrycie tych regionów genomu23-25. Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynowe o zmniejszonej reprezentacji (ERRBS) obejmuje modyfikacje przygotowania biblioteki i alternatywne podejście do wyrównania danych26 w porównaniu z RRBS. ERRBS zaowocował większą liczbą CpG reprezentowanych w wygenerowanych danych i zwiększonym pokryciem wszystkich badanych regionów genomu26. Metoda ta została wykorzystana do wyjaśnienia wzorców metylacji DNA u ludzi, pacjentów i innych próbek zwierzęcych26-30.

Opisany protokół ERRBS oferuje szczegółowe informacje na temat wszystkich kroków potrzebnych do ukończenia, a dane zostały wygenerowane przy użyciu reprezentatywnego ludzkiego DNA (próbki zostały uzyskane z wcześniej zgłoszonych, zanonimizowanych próbek pacjentów31, oraz próbki szpiku kostnego CD34+ od normalnego ludzkiego dawcy). Protokół obejmuje zautomatyzowany proces wyboru rozmiaru, który skraca czas przetwarzania na próbkę i pozwala na zwiększenie dokładności w doborze rozmiaru biblioteki. Protokół łączy w sobie szereg uznanych technik biologii molekularnej. DNA o dużej masie cząsteczkowej jest trawione za pomocą niewrażliwego na metylację enzymu restrykcyjnego (MspI), a następnie następuje naprawa końców, ogon A i ligacja metylowanych adapterów. Po wyborze wielkości fragmentów bogatych w GC następuje konwersja wodorosiarczynu i amplifikacja PCR przed sekwencjonowaniem. Konwersja wodorosiarczynu została już wcześniej opisana32, a szczegółowy przegląd analizy danych i zastosowań wykracza poza zakres tego artykułu, jednak zawarto zalecenia i odniesienia do użytku czytelników. Protokół może być wykonywany przez cztery dni i jest podatny na niewielkie ilości materiału wejściowego (50 ng lub mniej). Opisany protokół dostarcza danych o wysokim pokryciu na miejsce CpG, wystarczających nie tylko do różnicowego oznaczania miejsca metylacji i regionu, ale także do wykrywania polimorfizmu epigenetycznego, jak opisano przez Landana i wsp.Lokal mieszkalny 33.

Protokół

UWAGA: Uzyskano zgodę komisji rewizyjnej w Weill Cornell Medical College (numer protokołu 0805009783) i to badanie zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem helsińskim.

UWAGA: Proszę zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów odpowiednich dla odpowiednich materiałów przed użyciem (oznaczonych w całym protokole jako "UWAGA"). Niektóre z zastosowanych odczynników są toksyczne i zaleca się stosowanie odpowiednich środków bezpieczeństwa (środki ochrony osobistej i wyciąg

).

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że w protokole zaznaczono inaczej

.

1. Przygotowanie i trawienie genomowego DNA

  1. Przygotować 50 ng wysokiej jakości genomowego DNA (> wielkości 40 kilozasad dla ludzkiego DNA) jako materiał wyjściowy w 50 mikrolitrach (μl) wody wolnej od DNaz. Określ ilościowo DNA za pomocą testu ilościowego opartego na fluorescencji zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Wymieszaj 50 ng DNA z 2 μl MspI (100 000 jednostek/mililitr), 10 μl odpowiedniego 10-krotnego buforu reakcyjnego i wodą wolną od DNaz, aby doprowadzić reakcję do całkowitej objętości 100 μl.
  3. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C w termocyklerze lub łaźni wodnej przez co najmniej 18 godzin.
  4. Ekstrakcja i wytrącanie DNA
    1. Oczyść strawione DNA za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej.
      1. Dodać 200 μl 10-milimolowego (mM) buforu tris(hydroksymetylo)aminometanowego (Tris-Cl) o pH 8,0 do każdej reakcji z kroku 1.3, aby doprowadzić objętość do 300 μl.
      2. Dodać 150 μl fenolu nasyconego kwasem tris-etylenodiaminotetraoctowym (TE) i 150 μl mieszaniny chloroformu (1:1; UWAGA) do DNA w kapturze chemicznym i krótko wirować.
      3. Wirować przy 20 800 x g w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      4. Przenieść górną fazę wodną (około 300 μl) z ostatniego etapu do nowej probówki.
    2. Wytrącić strawione DNA za pomocą wytrącania etanolu.
      1. Dodać 1 μl glikogenu (20 miligramów/mililitr), 1/10 objętości (30 μl) 3 M pH 5,2 octanu sodu i 2,5 objętości (750 μl) 100% etanolu o temperaturze pokojowej. Mieszaj przez wirowanie z dużą prędkością.
      2. Wirować w temperaturze 4 °C przez 45-60 minut przy 20 800 x g w mikrowirówce.
      3. Szybko usuń etanol, odwracając i przeciągając każdą tubkę po ręczniku papierowym szybkim ruchem nadgarstka. Upewnij się, że osadek DNA pozostaje na bocznej ściance probówki.
      4. Do każdej probówki dodać 600 μl 70% etanolu o temperaturze pokojowej. Wizualizuj granulkę, gdy wypiera się od strony rury. Delikatnie wymieszaj, obracając tubkę pięć razy.
      5. Wirować w temperaturze 4 °C przez 45-60 minut przy 20 800 x g w mikrowirówce.
      6. Usuń etanol, szybko odwracając i przeciągając każdą tubkę po ręczniku papierowym szybkim ruchem nadgarstka.
      7. Usuń jak najwięcej etanolu, ostrożnie usuwając resztki objętości. Użyj aparatu próżniowego z końcówką pipety 10 μl bez DNaz na końcu i w razie potrzeby pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu, aby całkowicie wyeliminować wszelkie dalsze pozostałości etanolu.
        UWAGA: Należy unikać nadmiernego suszenia granulek, ponieważ zmniejszy to rozpuszczalność po ponownym zawieszeniu w następnym kroku.
      8. Zawiesić osad DNA w 30 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (bufor EB).
        UWAGA: Aby uniknąć ponownego wyżarzania "lepkich" nawisów CG powstałych w wyniku mineralizacji MspI, konieczne jest wypełnienie protokołu przez etap podwiązania tego samego dnia (krok protokołu 4).

2. Naprawa końcowa

  1. Przenieść 30 μl DNA strawionego przez MspI (z protokołu etapowego 1.4.2.8) do probówki PCR na lodzie (4 °C) i dodać odczynniki z tabeli 1.
  2. Inkubować reakcję naprawy końcowej przez 30 minut w temperaturze 20 °C w termocyklerze z założoną pokrywą grzewczą.
  3. Oczyść produkty DNA, aby usunąć nieinkorporowane dNTP i inne odczynniki reakcyjne za pomocą komercyjnego zestawu opartego na kolumnie, który wiąże DNA w buforze o wysokiej zawartości soli i eluuje DNA w warunkach buforu o niskiej zawartości soli zgodnie z zaleceniami producenta. Eluować produkty DNA w 32 μl buforu EB.

3. Ogon A

  1. Przenieść 32 μl roztworu DNA z kroku 2.3 do probówki PCR na lodzie (4 °C) i dodać odczynniki wymienione w tabeli 2.
  2. Inkubować reakcję ogonowania A przez 30 minut w temperaturze 37 °C w termocyklerze z założoną pokrywą termiczną.
  3. Oczyść produkty DNA w celu usunięcia nieinkorporowanych dATP i innych odczynników reakcyjnych za pomocą komercyjnego zestawu opartego na kolumnie, który wiąże DNA w buforze o wysokiej zawartości soli i eluuje DNA w warunkach buforu o niskiej zawartości soli zgodnie z zaleceniami producenta. Eluować w 10 μl buforu EB.

4. Podwiązanie adaptera

  1. Przenieść 10 μl DNA z ogonem A do probówki PCR na lodzie (4 °C)
  2. Dodać odczynniki do reakcji ligacji do DNA, jak wyszczególniono w tabeli 3, i adaptery, jak wyszczególniono w tabeli 4.
  3. Inkubować reakcję ligacji przez noc w temperaturze 16 °C w termocyklerze z założoną pokrywą termiczną
    4. .
  4. Produkty ligacji należy oczyścić za pomocą protokołu izolacji kulek odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI) zgodnie z zaleceniami producenta. Na przykład w przypadku kulek Agencourt AMPure XP należy zastosować 1,8-krotny stosunek objętości kulki do objętości próbki (90 μl kulek na reakcję ligacji 50 μl). Eluować do 30 μl wody wolnej od DNaz.
    1. Ligowane DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przed przystąpieniem do wyboru wielkości.

5. Wybór rozmiaru

UWAGA: Postępuj zgodnie z sekcją 5.1 dla protokołu automatycznego wyboru rozmiaru lub sekcją 5.2 dla protokołu ręcznego wyboru rozmiaru ekstrakcji żelu. W przypadku próbek zawierających 25 ng lub więcej wejściowego DNA można zastosować automatyczny protokół wyboru wielkości (przy użyciu przyrządu takiego jak Pippin Prep). Ręczna ekstrakcja żelu jest konieczna w przypadku niskich ilości wejściowych DNA wynoszących 5-10 ng.

  1. Wybór rozmiaru za pomocą Pippin Prep dla próbek o masie wejściowego DNA 25 ng lub większej (ryc. 2A).
    1. Utwórz nowy protokół w Pippin Prep w celu wyboru rozmiaru.
    2. Wybierz "2% DF Marker L" jako kasetę. Kliknij przycisk "Użyj standardów wewnętrznych". Sprawdź, czy numery "Pasa referencyjnego" są zgodne z numerami pasów.
    3. Wybierz "Zasięg" jako tryb zbierania dla każdej linii. Wprowadź 135 w polu "Początek BP", 410 w polu "Koniec BP" i 240 w polu "Pauza BP" dla każdej linii.
    4. Zapisz protokół.
    5. Dodać 10 μl markera L do każdej próbki o objętości 30 μl z reakcji ligacji (etap 4.3), zwiększając całkowitą objętość do 40 μl. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem Pippin Prep, aby przygotować kasetę z żelem i instrument.
    6. Usunąć 40 μl buforu do elektroforezy z dołków na próbkę i załadować próbkę o objętości 40 μl z kroku 5.1.5 do każdej z 5 studzienek kasety z żelem bezbarwnym.
      UWAGA: Bezbarwne kasety z żelem agarozowym mają kluczowe znaczenie dla selekcji wielkości fragmentów DNA podwiązanych przez adapter, ponieważ obecność bromku etydyny może zmienić właściwości migracji fragmentów związanych z rozwidlonym adapterem.
    7. Wybierz protokół utworzony w kroku 5.1.1 i rozpocznij uruchamianie.
    8. Dla każdego używanego ciągu należy pobrać 40 μl z modułu elucyjnego, gdy przebieg zatrzymuje się w punkcie 240 par zasad (pz) (dolna frakcja biblioteki: 135-240 pz). Przyrząd zatrzyma się indywidualnie dla każdego pasa. Powtórz kroki 5.1.5-5.1.7 dla każdego pasa ruchu, gdy zatrzymuje się przy 240 pz.
    9. Przemyć moduł elucyjny 40 μl świeżego buforu do elektroforezy, pipetując trzykrotnie w górę i w dół. Wyrzucić 40 μl buforu do płukania. Powtórz etap płukania jeszcze dwa razy i usuń całą pozostałą ciecz z modułu elucyjnego. Mycie modułu elucji zmniejszy ilość DNA o niższej frakcji przenoszonego do zbioru o wyższej frakcji.
    10. Dodać 40 μl świeżego buforu do elektroforezy, ponownie uszczelnić moduł elucyjny i wznowić przebieg.
    11. Zebrać 40 μl z każdego modułu elucyjnego do nowej probówki, gdy przyrząd wskaże, że elucja została zakończona. Ta elucja zawiera wyższą frakcję biblioteczną (240-410 pz). W przypadku korzystania z wielu kaset z żelem, przed przystąpieniem do konwersji wodorosiarczynów należy przechowywać próbki o wybranej wielkości w temperaturze 4 °C.
  2. Wybór rozmiaru za pomocą ręcznej ekstrakcji żelu (rysunek 2B)
    1. Przygotuj 1,5% żel agarozowy z 0,2 μg/ml bromku etydyny (UWAGA).
    2. Załadować drabinki 50 pz i 100 pz przygotowane z buforem załadowczym w sąsiednich studzienkach po obu stronach żelu.
    3. Dodaj 2 μl barwnika ładującego 6X Orange G do oczyszczonych produktów do podwiązywania. Załaduj całą objętość każdej próbki do poszczególnych studzienek, pomijając co najmniej jeden studzienkę między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    4. Uruchom żel pod napięciem 3,5 V na centymetr, aż drabina zostanie całkowicie oddzielona, a pomarańczowy barwnik G spłynie na dno żelu (minimum jedna godzina)
    5. Odetnij drabiny za pomocą czystej żyletki i zwizualizuj je na transiluminatorze UV (UWAGA). Nie wystawiaj próbek na działanie światła UV. Zaznacz pasma 150 pz, 250 pz i 400 pz drabin za pomocą żyletki lub końcówek do pipet. Oznaczenie taśm drabinkowych pozwoli na wycięcie próbek bez wystawiania ich na działanie światła UV.
    6. Wyrównaj plastry drabiny z resztą żelu. Używając oznaczonych prążków jako odniesienia, wyciąć jeden wycinek zawierający frakcję biblioteczną 150-250 pz (dolny) i drugi wycinek zawierający frakcję biblioteczną 250-400 pz (wyższą). Umieść każdy z dwóch plasterków w różnych probówkach.
    7. Powtórzyć wycięcie dla wszystkich próbek przygotowanych przy użyciu czystej żyletki dla każdego użytego pasa żelu.
    8. Oczyść dolną i wyższą frakcję biblioteki za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołami producenta. Każdą ekstrahowaną próbkę eluować do 40 μl EB. Aby zapewnić wydajną amplifikację PCR zarówno dolnej, jak i wyższej frakcji bibliotecznej w kroku 7, należy zachować dwie frakcje jako niezależne próbki do etapu konwersji wodorosiarczynu.

6. Konwersja wodorosiarczynu

  1. Skonfiguruj kontrolę konwersji wodorosiarczynu zgodnie z zaleceniami producenta (np. zestaw Universal Methylated Human DNA Standard). Kontrolę należy traktować w taki sam sposób, jak próbki w całym protokole konwersji wodorosiarczynu.
  2. Wykonaj konwersję wodorosiarczynu przy użyciu komercyjnego protokołu zestawu zgodnie z zaleceniami producenta. Użyj komercyjnego zestawu, który ma ograniczoną degradację matrycy i utratę DNA podczas leczenia i czyszczenia, a jednocześnie skutkuje wysokimi współczynnikami konwersji wodorosiarczynu DNA. W przypadku korzystania z zestawu do metylacji DNA EZ należy postępować zgodnie z zaleceniami producenta, z następującym wyjątkiem: inkubować próbki w termocyklerze przy użyciu następującego protokołu: 55 cykli: 95 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 15 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Eluować próbki w 40 μl wody wolnej od DNazy. Kontynuuj wzbogacanie PCR (krok 7) w tym samym dniu, w którym zakończono konwersję wodorosiarczynu. DNA poddane działaniu wodorosiczynu jest bogate w AU i jednoniciowe, co zmniejsza jego stabilność.
  4. Potwierdź efektywną konwersję wodorosiarczynu w kontroli użytej za pomocą sekwencjonowania Sangera z niemetylowanymi cytozynami przekształconymi w ponad 99%.

7. Wzbogacenie PCR

  1. Przygotować wzorcową mieszaninę PCR, używając odczynników z tabeli 5 dla każdej frakcji bibliotecznej (zoptymalizowanej pod kątem użycia polimerazy DNA FastStart Taq).
  2. Dodaj główną mieszankę PCR do każdej 40 μl frakcji bibliotecznej przekształconej w wodorosiarczyn. Wymieszać pipetując. Podzielić reakcję o objętości 200 μl na cztery probówki PCR po 50 μl każda.
  3. Wzmocnij reakcje w termocyklerze za pomocą następującego protokołu: Ustaw pokrywę grzewczą na 100 oC. Zainicjuj krokiem 94 °C przez 5 minut. Uruchom 18 cykli denaturacji, wyżarzania i wydłużania/wydłużania: 94 °C przez 20 sekund, następnie 65 °C przez 30 sekund, a następnie 72 °C przez 1 min. Uruchom końcowy krok wydłużania/wydłużania o temperaturze 72 °C przez 3 minuty i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: 18 cykli PCR jest zalecane dla małych ilości materiału wejściowego (mniej niż 10 ng) oraz dla osób po raz pierwszy korzystających z protokołu. Protokół można dostosować do mniejszej liczby cykli PCR (zaledwie 14 cykli dla 50 ng wejściowego DNA; patrz Tabela 6).

8. Oczyszczanie reakcji PCR

  1. Połącz każdy zestaw 4-reakcyjny (cztery reakcje PCR po 50 μl na frakcję biblioteczną).
  2. Oczyść produkty PCR przy użyciu podejścia perełkowego SPRI (lub innego podejścia, które może usunąć niewbudowane startery i inne odczynniki reakcji PCR) zgodnie z zaleceniami producenta. Poniższe kroki zostały zoptymalizowane pod kątem Agencourt AMPure XP.
    1. Dodaj 1,7 razy większą objętość kulek SPRI (340 μl na 200 μl produktu PCR) do produktów amplifikacji niższej frakcji.
    2. Dodaj 1,1 razy większą objętość kulek SPRI (220 μl na 200 μl produktu PCR) do produktów amplifikacji o wyższej frakcji.
    3. Oczyść produkty PCR zgodnie z zaleceniami producenta, używając 800 μl 70% etanolu do etapów mycia.
    4. Eluować do 50 μl wody wolnej od DNaz i dodać 1M bufor Tris, aby doprowadzić każdą bibliotekę do 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. Przechowuj biblioteki w temperaturze -20 °C.

9. Kontrola jakości biblioteki

  1. Określ ilościowo biblioteki za pomocą testu ilościowego opartego na fluorescencji, selektywnego dla dwuniciowego DNA zgodnie z zaleceniami producenta. Pomiary oparte na spektrofotometrii nie są wiarygodne. Oczekiwane stężenia wynoszą 10 - 50 ng/μl dla dolnej frakcji bibliotecznej i 3 - 15 ng/μl dla wyższej frakcji bibliotecznej.
  2. Oceń wielkość i jakość biblioteki za pomocą bioanalizatora i zestawu DNA o wysokiej czułości. Wizualizuj produkty biblioteczne i określ średnią wielkość każdej frakcji bibliotecznej. Dolna frakcja biblioteczna ma zazwyczaj średnią wielkość od 180 do 210 pz. Wyższa frakcja ma zazwyczaj średnią wielkość od 280 do 310 pz.

10. Przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania

  1. Oblicz molarność każdej frakcji bibliotecznej w następujący sposób:
    1. Określ rozmiar każdej frakcji bibliotecznej, korzystając ze śladu uzyskanego w kroku 9.2. Na przykład, jeśli korzystasz z bioanalizatora, użyj funkcji "region" i zakryj początek i koniec ocenianej frakcji bibliotecznej.
    2. Zapisz średni rozmiar każdej frakcji bibliotecznej w bp.
    3. Oblicz molowość każdej frakcji bibliotecznej (stężenie nanomolowe DNA) za pomocą następującego wzoru: Stężenie nanomolowe DNA = [(ng/1000)/(bp*660)]*10^9 gdzie ng to stężenie wyrażone w ng/μl (mierzone w kroku 9.1) , bp to średnia wielkość frakcji bibliotecznej, a 660 to masa standardowej dwuniciowej pary zasad DNA. Na przykład: przy bibliotece o wielkości 326 pz, przy stężeniu 14,2 ng/μl, stężenie nanomolowe DNA wynosi 66 nM.
  2. Przygotować 10 μl roztworu o stężeniu 2 nM z każdej frakcji bibliotecznej. Rozcieńczyć bibliotekę wodą wolną od DNaz.
  3. Połączyć frakcje biblioteczne, łącząc 10 μl frakcji niższej o 2 nM z 10 μl frakcji wyższej o 2 nM dla każdej przygotowanej biblioteki próbek. Ta pula jest końcową biblioteką ERRBS do sekwencjonowania.
  4. Sekwencjonowanie biblioteki ERRBS
    1. Załaduj biblioteki tak, aby uzyskać optymalną gęstość 600 000 – 650 000 klastrów na milimetr kwadratowy (sugerowane stężenie ładowania 7-8 picomolar).
    2. Sekwencjonuj biblioteki przy użyciu co najmniej 51 cykli pojedynczego odczytu, sekwencjonując na sekwencerze HiSeq 2500 w trybie wysokiej wydajności.
    3. Korzystaj z wyznaczonego pasa kontrolnego (patrz dyskusja, aby zapoznać się z uzasadnieniem).

11. Analiza danych

UWAGA: Proszę zapoznać się z plikami kodu uzupełniającego 1 i 2, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat poleceń i skryptów zalecanych do użycia.

  1. Przekonwertuj podstawowe pliki wywołań (pliki .bcl) na indywidualne pliki FASTQ dla każdej próbki za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta sekwencera (przykład: CASAVA v1.8.2 dla Illumina). Jeżeli wykorzystywane jest podstawowe urządzenie do sekwencjonowania, etap ten może być dostarczony i/lub wykonany jako zautomatyzowany krok na pokładzie komputera sekwencjonującego.
  2. Filtruj odczyty sekwencjonowania pod kątem odczytów, które przechodzą filtrowanie jakości (zobacz Plik kodu uzupełniającego 1, aby uzyskać szczegółowe informacje). Plik CASAVA FASTQ zawiera zarówno odczyty, które przechodzą filtrowanie jakości, jak i odczyty, które nie przechodzą filtrowania jakości. Użyj niestandardowego skryptu, który wykorzystuje element identyfikatora sekwencji i przechowuje odczyty, które przeszły filtrowanie jakości.
  3. Przycinanie sekwencji adaptera od końca sekwencji 3' wczytuje się w filtrowane pliki FASTQ za pomocą narzędzia programowego, które może usunąć sekwencje adaptera, takiego jak Flexbar 37. Minimalna długość nakładania się (-ao) ustawiona na 6, minimalna długość odczytu do zachowania po usunięciu adaptera (--m) ustawiona na 21, wartość odcięcia dla liczby dozwolonych niezgodności (-at) ustawiona na 2 i wartości domyślne dla wszystkich innych parametrów. Jako alternatywę dla Flexbar, w kroku 11.3 można użyć dowolnego oprogramowania, które może usunąć adaptery (przykłady: cutadapt38, trimmomatic39).
  4. Użyj Bismark41, aby wyrównać przefiltrowane, przycięte adapterem odczyty sekwencji do przetworzonego wodorosiarczynu referencyjnego genomu ludzkiego hg19 (podejście do wyrównania całego genomu) i określić kontekst metylacji dla każdej cytozyny. Bismark to dostosowane narzędzie do mapowania krótkich odczytów, które wyrównuje odczyty traktowane wodorosiarczynem do genomu przekształconego w wodorosiarczyn (gdzie wszystkie "C" są przekształcane w "T") i zwraca wywołania metylacji dla cytozyn w kontekście CpG, CHG i CHH. Zazwyczaj ustawia długość inicjatora (-l) na długość odczytu dla dokładności wyrównania i używa wartości domyślnych dla wszystkich innych parametrów.
  5. Sortuj wyrównane odczyty najpierw według chromosomu, następnie pozycji początkowej, a na końcu pasma, po zakończeniu wyrównania.
  6. Użyj niestandardowych skryptów (zobacz Plik kodu uzupełniającego 2 dla poleceń skryptowych), aby iterować po posortowanych wywołaniach metylacji wyprowadzanych przez Bismarka w celu obliczenia procentowych wyników metylacji cytozyn przekształconych w wodorosiarczyn (T; reprezentujących niemetylowane C) i nieprzekształcone C (reprezentujące metylowane C) dla każdego kontekstu metylacji cytozyny (CpG, CHG, CHH), zachowując tylko cytozyny, które mają co najmniej 20-krotny wynik jakości phred i mają co najmniej 10-krotne pokrycie.
    UWAGA: Dane wyjściowe są plikiem wyników metylacji dla każdego kontekstu cytozyny z kolumnami odpowiadającymi: pozycji, nici, pokryciu, procentowi cytozyny i procentowi tyminy, a dla kontekstu CHG i CHH kolumnie dla następnej zasady (H).
  7. Użyj niestandardowego skryptu (zobacz Plik kodu uzupełniającego 2 dla poleceń skryptu), aby obliczyć współczynniki konwersji na podstawie wyników metylacji i wyprowadzić sumę innych rozważanych C (kontekst CHG i CHH), średni współczynnik konwersji i medianę współczynnika konwersji. Obliczaj współczynniki konwersji dla obu pasm niezależnie, a także podsumowując je w całej bibliotece. Średni współczynnik konwersji to ułamek C (przekonwertowanych i nieprzekonwertowanych) w kontekście innym niż CpG całkowitej liczby C. Cytozyny w kontekście CHG lub CHH są zazwyczaj niemetylowane i dlatego są obecne jako tymina w danych sekwencjonowania.
  8. Wygeneruj plik BAM z wyrównanymi odczytami przy użyciu bismark2SAM_v5_xm.pl41 i SAMTOOLS42 firmy Bismark, a następnie wygeneruj plik w formacie wiggle za pomocą niestandardowego skryptu do konwersji wywołań metylacji CpG. Przetworzone dane wyjściowe można przekonwertować na inne formaty, takie jak wykres podstawowy, i wyświetlić w przeglądarce genomu, takiej jak UCSC Genome Browser43 lub IGV44.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat ERRBS, wyróżniając kluczowe etapy, które są wyjaśnione w opisanym protokole. Biblioteki ERRBS zostały przygotowane z wykorzystaniem 50 ng DNA wejściowego.

Należy ocenić jakość przygotowanych bibliotek. Produkcja bibliotek rutynowo daje frakcje o rozmiarach 150-250 bp oraz 250-400 bp (Rysunek 3A-C). Przewiduje się niewielkie różnice w rozkładzie rozmiarów bibliotek pomiędzy próbkami. Należy zauważyć, że zarówno w niższych, jak i wyższych frakcjach bibliotek występują bardzo intensywne pasma DNA, co wskazuje na wzbogacenie w konkretną sekwencję. Trawienie enzymem MspI prowadzi do wzbogacenia w rodzinę powtarzalnych sekwencji DNA obecnych w ludzkim genomie o długości 190 bp, 250 bp i 310 bp w bibliotekach ERRBS. Te trzy powtórzenia stanowią charakterystyczną sygnaturę biblioteki ERRBS20 (patrz Rysunki 3A-C oraz 3G). Reprezentatywne biblioteki zsekwencjonowano na sekwenatorze nowej generacji z użyciem odczytów jednokierunkowych (single-end). Przy ładowaniu zalecanego stężenia biblioteki na sekwenator Illumina HiSeq 2500 oczekiwana gęstość klastrów wynosi 500 000-700 000 na mm2. Przy tej gęstości klastrowania 81,6% ± 3,14% (n = 81) klastrów przechodzi przez filtr (Rysunek 4A). Ze względu na niską złożoność końców wstawek bibliotecznych (miejsce rozpoznawania MspI: C^CGG), wartości intensywności i wyniki jakości rejestrowane podczas sekwencjonowania są bardzo zmienne dla pierwszych trzech zasad (Rysunek 4B-C), jednak w przypadku dołączenia niezależnego toru kontrolnego (patrz dyskusja), 85% zasad będzie miało wyniki jakości 30 lub wyższe (wartości Q30; Rysunek 4D).

Wyrównanie danych i wyznaczenie metylacji cytozyny zgodnie z opisanym protokołem pozwala na uzyskanie danych w rozdzielczości pojedynczych par zasad (Tabela 7). Dla genomu ludzkiego 51-cyklowe sekwencjonowanie pojedynczego odczytu biblioteki ERRBS w jednym kanale urządzenia HiSeq 2500 w trybie wysokiej wydajności (high output mode) regularnie generuje 153 194 882 ± 12 918 302 całkowitych odczytów, z których po filtrowaniu jakościowym i przycinaniu adapterów 152 231 183 ± 13 189 678 odczytów trafia do potoku analizy. Średnia wydajność mapowania dla biblioteki ERRBS wynosi zazwyczaj 62,95% ± 5,92% przy reprezentacji 3 183 594 ± 713 547 miejsc CpG z minimalnym pokryciem na CpG wynoszącym 10x oraz średnim pokryciem na CpG wynoszącym 84,94 ± 16,29 (n = 100).

Protokół ERRBS nadaje się do multipleksowania (patrz Plik uzupełniający 1: Adaptacja protokołu do sekwencjonowania multipleksowanego). Dane z reprezentatywnych serii sekwencjonowania podsumowano na Ryc. 5. Dane z serii sekwencjonowania multipleksowanego (seria sekwencjonowania z pojedynczym odczytem 51 cykli; n = 128 dla dwóch bibliotek na ścieżkę; n = 11 dla trzech bibliotek na ścieżkę; n = 11 dla czterech bibliotek na ścieżkę) porównano z sekwencjonowaniem pełnej ścieżki biblioteki ERRBS (serie sekwencjonowania z pojedynczym odczytem 51 cykli; n = 100), a także z undersamplingiem pojedynczej ścieżki w celu symulacji 50%, 33% i 25% odczytów na ścieżkę (odpowiednio multipleksowanie 2, 3 i 4 próbek na ścieżkę; n = 3). Wraz ze spadkiem liczby odczytów na próbkę wynikającym z czynnika multipleksowania, liczba CpG objętych minimalnym pokryciem 10x oraz pokrycie na CpG również maleje (Ryc. 5 i Tabela 8). Średnie oczekiwane wskaźniki konwersji miejsc nie-CpG wynoszą 99,85% ± 0,04% (n = 400). Wskaźniki konwersji niższe niż 99% mogą wskazywać na nieoptymalną konwersję pirosiarczynową, co może prowadzić do wysokich wskaźników fałszywych poziomów metylacji.

Dane z biblioteki ERRBS przygotowanej z reprezentatywnego ludzkiego genomowego DNA przeanalizowano w programie R 2.15.245 przy użyciu pakietu methylKit26 (szczegóły poleceń znajdują się w pliku z kodem uzupełniającym 1). Dane można zwizualizować w powszechnie używanych przeglądarkach genomu (Rysunek 6A). Dane dotyczące metylacji cytozyny pochodzą w równym stopniu z obu nici (Rysunek 6B) i obejmują całe spektrum potencjalnych poziomów metylacji cytozyny (Rysunek 6C). Analiza replikatów technicznych z reprezentatywnej próbki ludzkiego DNA wykazuje wysoką zgodność między wynikami danych (Rysunek 6D) i obejmuje CpGs w szerokim spektrum loci genomowych (Rysunek 6E i F oraz zgodnie z wcześniejszym opisem26). Podczas gdy replikaty techniczne wykazują wysokie wartości R2 (powyżej 97%), replikaty biologiczne wykazują wartości R2 w zakresie od 0,92 do 0,9626, a porównanie różnych ludzkich typów komórek daje wartości R2 niższe niż 0,86 (dane nie przedstawiono).

Schemat przygotowania biblioteki DNA; diagram procesu; etapy trawienia MspI, PCR i konwersji w obecności pirosiarczynu.
Rycina 1: Schemat blokowy kroków protokołu ERRBS. Schemat przedstawia etapy, które można zrealizować w ciągu jednego tradycyjnego dnia pracy. * oznacza potencjalny punkt przerwy (bezpośrednio po oczyszczaniu po ligacji i przed selekcją rozmiaru, krok protokołu 5), w którym próbki można zamrozić w temperaturze -20 °C przed kontynuowaniem dalszych etapów protokołu.

Schemat elektroforezy DNA i interfejsu oprogramowania do analizy prążków i wyznaczania masy cząsteczkowej.
Rysunek 2: Protokół selekcji wielkości. (A) Zrzut ekranu ustawień użytych w protokole ERRBS Pippin Prep (patrz sekcja protokołu 5.1.2 – 5.1.6): (1) Wybór typu kasety. (2) Wybór zastosowanego standardu. (3) Wybór trybu zbierania dla każdej ścieżki. (4) Wprowadzenie zakresów bp dla zbierania. (5) Zapisanie protokołu. (B) Etapy ręcznej ekstrakcji z żelu zastosowanej w sekcji protokołu 5.2: (1) Wizualizacja markerów wielkości. (2) Wyznaczone zakresy wielkości do selekcji przy użyciu żyletki. (3) Obraz wyciętych próbek (frakcja dolna: 150-250 bp i frakcja górna: 250-400 bp). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza żelu elektroforetycznego i wykresy fluorescencji; rozdział par zasad DNA, wyniki intensywności ścieżek.
Rysunek 3: Wyniki kontroli jakości reprezentatywnych bibliotek ERRBS przygotowanych z próbek ludzkiego DNA przy użyciu bioanalizatora. (A) Obraz przypominający żel, przedstawiający marker standardowy (1), dolną frakcję biblioteki (frakcja 135-240 bp z Pippin Prep; 2) oraz górną frakcję biblioteki (frakcja 240-410 bp z Pippin Prep; 3). (B) Elektroferogram z bioanalizatora dla oczekiwanej dolnej frakcji biblioteki. (C) Elektroferogram z bioanalizatora dla oczekiwanej górnej frakcji biblioteki. D-F) Reprezentatywne dane z przygotowania biblioteki o niskiej jakości. Obraz przypominający żel (D) markera standardowego (1), dolnej frakcji biblioteki (2) i górnej frakcji biblioteki (3). Prążek przy 150 bp zaznaczony strzałką wskazuje na nadmiar adapterów. Elektroferogram dolnej (E) i górnej (F) frakcji biblioteki z pikami nadmiaru adapterów przy 150 bp (zaznaczonymi strzałkami). (G) Elektroferogram z bioanalizatora dla połączonej biblioteki ERRBS do sekwencjonowania. Czerwona linia reprezentuje wysokiej jakości połączoną bibliotekę z równą reprezentacją frakcji górnej i dolnej. Niebieska linia reprezentuje połączoną bibliotekę nieodpowiednią do sekwencjonowania z powodu braku równej reprezentacji frakcji górnej i dolnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza sekwencjonowania DNA; wykresy przedstawiające gęstość klastrów, intensywność, trendy wyników jakości, cykle danych.
Rycina 4: Wykresy sekwencjonowania dla reprezentatywnego 51-cyklowego przebiegu sekwencjonowania pojedynczego odczytu ERRBS na sekwenatorze HiSeq 2500 w trybie wysokiej wydajności. (A) Gęstości klastrów (K/mm2 = 1 000 klastrów na milimetr kwadratowy; kolor niebieski) oraz gęstości klastrów przechodzące przez filtr (kolor zielony) w dwóch kanałach z bibliotekami ERRBS. (B) Typowe intensywności obserwowane w pierwszych 30 cyklach w kanale z biblioteką ERRBS. Zwróć uwagę na sygnaturę CGG wynikającą z trawienia MspI w intensywnościach pierwszych trzech cykli. (C) Procent zasad z wynikiem jakości 30 lub wyższym (%>Q30) dla każdego cyklu w jednym kanale ERRBS. (D) Rozkład wyników jakości dla wszystkich cykli w jednym kanale ERRBS. Kolor niebieski = poniżej Q30, kolor zielony = powyżej lub równy Q30. W tym kanale 84,7% zasad miało wyniki jakości 30 lub wyższe.

Wykresy pudełkowe czynnika multipleksowania przedstawiające liczbę odczytów, liczbę CpG oraz pokrycie na CpG w sekwencjonowaniu.
Rycina 5: Wyniki sekwencjonowania. Wykresy pudełkowe danych eksperymentalnych z sekwencjonowania multipleksowanego oraz z sekwencjonowania pojedynczej próbki na ścieżkę (wyświetlone jako zielone pola) oraz danych uzyskanych poprzez symulowany downsampling z przebiegów sekwencjonowania trzech bibliotek ERRBS (wyświetlone jako niebieskie pola; pobrano próbki pięciokrotnie dla każdego przebiegu sekwencjonowania) z 51-cyklowego sekwencjonowania typu single-read. Czynnik multipleksowania odpowiada liczbie bibliotek ERRBS sekwencjonowanych na ścieżkę. 1 = cała ścieżka lub 100% odczytów i reprezentuje dane z jednej biblioteki ERRBS na ścieżkę; 2 = 50% ścieżki i reprezentuje dane z dwóch bibliotek ERRBS na ścieżkę; 3 = 33% ścieżki i reprezentuje dane z trzech bibliotek ERRBS na ścieżkę; a 4 = 25% ścieżki i reprezentuje dane z czterech bibliotek ERRBS na ścieżkę. (A) Liczba odczytów, czyli liczba analizowanych sekwencji, w zależności od czynnika multipleksowania. (B) Liczba CpG pokrytych danymi sekwencjonowania w zależności od czynnika multipleksowania. (C) Średnie pokrycie na CpG w zależności od czynnika multipleksowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy danych genomicznych przedstawiające wzory metylacji, pokrycie odczytów i rozkład CpG.
Rysunek 6: Reprezentatywne dane z biblioteki ERRBS przygotowanej z ludzkiego DNA genomicznego. (A) Obraz z przeglądarki genomu University of California, Santa Cruz (UCSC)43 przedstawiający reprezentatywne dane z jednego pasa sekwencjonowania ERRBS. Pasek skali na osi y reprezentuje metylację 0-100% dla każdej cytozyny pokrytej minimum 10x. Górna ścieżka niestandardowa reprezentuje nić bezpośrednią, a dolna ścieżka niestandardowa reprezentuje nić odwrotną. Przedstawiono obszar chr12:6,489,523-6,802,422 (hg19), obejmujący geny refseq i wyspy CpG w tym regionie genomicznym. (B) Histogramy rozkładu pokrycia CpG wzdłuż nici bezpośredniej i odwrotnej w reprezentatywnej próbce ludzkiego szpiku kostnego CD34+. (C) Histogram rozkładu poziomów metylacji CpG wzdłuż obu nici w reprezentatywnej próbce ludzkiego szpiku kostnego CD34+. (D) Wykres korelacji poziomów metylacji CpG z reprezentatywnej repliki technicznej próbki ludzkiego DNA. (E) Wykres kołowy ilustrujący proporcje CpG objętych ERRBS, które zostały przypisane do wysp CpG (jasnozielony), brzegów wysp CpG (szary) i innych regionów (biały) w reprezentatywnej próbce przygotowanej z ludzkiego DNA genomicznego. (F) Wykres kołowy ilustrujący proporcje CpG objętych ERRBS, które zostały przypisane do promotorów genów (czerwony), eksonów (zielony), intronów (niebieski) i regionów międzygenowych (fioletowy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

OdczynnikObjętośćKomentarz
10x bufor do reakcji z ligazą DNA T410 µl
Mieszanina roztworów dideoksynukleotydów trifosforanowych (dNTP)4 µlmieszanina każdego nukleotydu w stężeniu 10 mM
Polimeraza DNA T45 µl3 000 j/ml
Duży fragment (Klenowa) polimerazy DNA I1 µl5 000 j/ml
T4 polinukleotydowa kinaza5 µl10 000 j/ml
woda wolna od DNazy45 µl

Tabela 1: Odczynniki do reakcji naprawy końców.Nazwy i ilości odczynników wykorzystanych w reakcji naprawy końców (krok protokołu 2.1).

OdczynnikObjętośćKomentarz
bufor reakcyjny 10x5 µlna przykład NEBuffer 2
1 mM 2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforanu (dATP)10 µl
Fragment Klenowa (3’→5’ exo-)3 µl5 000 j/ml

Tabela 2: Odczynniki do reakcji A-tailingu. Nazwy odczynników i ilości użyte w reakcji A-tailingu (krok protokołu 3.1).

OdczynnikObjętośćKomentarz
15 µM wyżarzone adaptery w wodzie wolnej od DNazy3 µladapter PE 1.0 i adapter PE 2.0; patrz Tabela 4 do sekwencji i referencji  
10x bufor do reakcji z ligazą DNA T45 µl
Ligaza DNA T41 µl2 000 000 j./ml
woda wolna od DNazy31 µl

Tabela 3: Odczynniki do reakcji ligacji adapterów. Nazwy i ilości odczynników użytych w reakcji ligacji adapterów (krok protokołu 4.2).

Tabela sekwencji starterów z referencjami; metodologia metylacji DNA i fosforotioatowa.
Tabela 4: Oligonukleotydy użyte w protokole ERRBS. Lista oligonukleotydów używanych w całym protokole ERRBS podczas reakcji ligacji (krok 4 protokołu) oraz w etapach amplifikacji PCR (krok 7 protokołu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.

OdczynnikObjętośćKomentarz
10x bufor do reakcji FastStart High Fidelity z 18 mM chlorkiem magnezu20 µl
Mieszanina roztworów dNTP 10 mM5 µl
25 µM Starter PCR PE 1.04 µlZobacz Tabela 4
25 µM startery PCR PE 2.04 µlZobacz Tabela 4
Enzym FastStart High Fidelity2 µl5 jednostek/µl Polimeraza DNA Taq FastStart
woda wolna od DNazy125 µl

Tabela 4: Oligonukleotydy użyte w protokole ERRBS. Lista oligonukleotydów wykorzystywanych w protokole ERRBS podczas reakcji ligacji (krok 4 protokołu) oraz etapów amplifikacji PCR (krok 7 protokołu).

OdczynnikObjętośćUwagi
10x FastStart High Fidelity Reaction Buffer z 18 mM magnesium chloride20 µl
10 mM dNTP Solution Mix5 µl
25 µM PCR PE primer 1.04 µlPatrz Tabela 4
25 µM PCR PE primer 2.04 µlPatrz Tabela 4
FastStart High Fidelity Enzyme2 µl5 units/µl FastStart Taq DNA Polymerase
Woda wolna od DNaz125 µl

Tabela 5: Odczynniki do reakcji PCR. Nazwy i ilości odczynników użytych w reakcji amplifikacji PCR (krok protokołu 7.1).

Krok protokołuOdczynnik/szczegóły protokołuIlość wejściowego DNA
5-10 ng25 ng50 ng
1Enzym MspI1 µl2 µl2 µl
Objętość reakcji trawienia MspI50100100
4Adaptery w reakcji ligacji1 µl2 µl3 µl
Objętość reakcji ligacji20 µl25 µl50 µl
5Protokół selekcji rozmiaruTylko ręczny żelPippin Prep lub ręczny żelPippin Prep lub ręczny żel
7Stężenie starterów PCR25 µM25 µM10 µM dla 14 cykli; 25 µM dla 18 cykli
Liczba cykli PCR181814-18

Tabela 6: Modyfikacje kroków protokołu dla ilości materiału wejściowego w zakresie od 5-50 ng. Kilka kroków w całym protokole wymaga modyfikacji ilości odczynników użytych do generowania wysokiej jakości bibliotek z różnych ilości materiałów wyjściowych. Zmiany ilości kluczowych odczynników zostały ujęte w poniższej tabeli. Odpowiednio dostosuj objętości buforów i wody w reakcjach.

ChrZasadaNićZakres opracowaniafreqCczęst T
chr110564R36685.5214.48
chr110571F42391.258.75
chr110542F43291.28.8
chr110563F42994.645.36
chr110572R36696.993.01
chr110590R37088.1111.89
chr110526R350928
chr110543R36892.937.07
chr110525F43391.928.08
chr110497F43588.7411.26

Tabela 7: Reprezentatywne dane ERRBS. Po wyrównaniu danych i oznaczeniu metylacji cytozyny uzyskuje się dane dotyczące par zasad. Dla każdego objętego analizą miejsca CpG opisany protokół wyrównania określi współrzędne genomiczne (kolumny: chr = chromosom, Base i Strand), stopień pokrycia konkretnego locus (Coverage) oraz odsetek wykrytej cytozyny w stosunku do tymidyny wyrażony w procentach (odpowiednio freqC i freqT).

Liczba bibliotek ERRBS na jedną ścieżkęŚrednia liczba unikalnie zmapowanych odczytówŚrednia liczba pokrytych miejsc CpGŚrednie pokrycie na CpG
1152,231,184 ± 13,189,6783,183,594 ± 713,54785 ± 16
277,680,837 ± 7,657,0582,674,823 ± 153,494 49 ± 9
349,938,156 ± 2,436,8652,552,186 ±- 76,62439 ± 2
434,457,208 ± 4,441,6861,814,461 ± 144,33928 ± 4

Tabela 8: Reprezentatywne parametry z sekwencjonowania pojedynczych i multipleksowanych bibliotek ERRBS. Przedstawione są dane na tor z przebiegów sekwencjonowania z pojedynczym odczytem (single-read) o długości 51 cykli: średnie i odchylenia standardowe dla unikalnie dopasowanych odczytów, liczby objętych CpGs oraz pokrycia na miejsce CpG uzyskane z sekwencjonowania pojedynczych bibliotek ERRBS na tor (n = 100), dwóch bibliotek ERRBS na tor (n = 128), trzech bibliotek ERRBS na tor (n = 11) oraz czterech bibliotek ERRBS na tor (n = 11).

Dyskusja

Przedstawiony protokół dostarcza danych o rozdzielczości par zasad metylacji cytozyny w biologicznie istotnych regionach genomu. Protokół w takiej formie, w jakiej został napisany, jest zoptymalizowany pod kątem 50 ng materiału wyjściowego, jednak można go dostosować do obsługi różnych materiałów wejściowych (5 ng lub więcej)26. Będzie to wymagało dostosowania niektórych etapów protokołu, jak pokazano w tabeli 6. Biblioteki ERRBS są podatne na sekwencjonowanie sparowanych końców, a dalsze pokrycie genomu można również osiągnąć poprzez sekwencjonowanie odczytów dłuższych niż 51 cykli. Sekwencjonowanie multipleksowe zapewni niższy koszt protokołu na próbkę, jednak spowoduje to zmniejszenie pokrycia na miejsce CpG reprezentowane w danych (Rysunek 5 i Tabela 8) i nie zapewni wystarczającej głębokości pokrycia do przeprowadzenia analiz, które wymagają wysokiego pokrycia na miejsce CpG (np. zgodnie z opisem Landana i wsp.33). Wreszcie, ten protokół (lub jakikolwiek protokół oparty na wodorosiarczynach) nie może rozróżnić między metylo-cytozyną a hydroksymetylo-cytozyną46,47. Jednak wygenerowane dane można zintegrować z innymi wynikami protokołu48,49 w celu nakreślenia różnych modyfikacji i innych modyfikacji cytozyny zgłoszonych ostatnio50, jeśli są one interesujące.

Biblioteki wysokiej jakości pojawią się, jak pokazano na rysunku 3A-C, a po połączeniu w celu sekwencjonowania uzyskają ślad, jak pokazano na rysunku 3G (czerwony ślad) reprezentujący równy wkład molowy z obu frakcji bibliotecznych. Niepowodzenie przygotowania biblioteki może wynikać z dowolnego kroku podczas procedury. Jeśli zdegradowane DNA zostanie przetworzone, spowoduje to powstanie bibliotek, które nie są wzbogacone we fragmenty MspI, a tym samym niskie pokrycie CpG przy użyciu parametrów sekwencjonowania opisanych w tym protokole. Jeśli enzym jest niefunkcjonalny lub przypadkowo wykluczony z jednej z reakcji, protokół nie zapewni oczekiwanej biblioteki. Jeśli reakcja ligacji jest nieefektywna, adaptery mają wyższe stężenie niż oczekiwano i/lub stężenie użytych starterów jest odczynnikiem ograniczającym dla końcowych etapów amplifikacji, może wystąpić awaria biblioteki. Nadmiar adapterów (widziany jako szczyty przy ~150 pz w wynikach bioanalizatora; Rysunek 3D-F) w bibliotece będzie również zakłócać sekwencjonowanie ze względu na bezkrytyczne grupowanie zarówno biblioteki, jak i nadmiaru adapterów. Podczas gdy taka biblioteka może sekwencjonować pozornie normalnie, znaczna część odczytów będzie tylko sekwencjami adaptera. Jeśli w bibliotece zaobserwowano nadmiar adapterów, najlepiej jest powtórzyć przygotowanie biblioteki, jeśli materiał jest dostępny przy użyciu optymalnych proporcji materiału wejściowego do ilości adaptera. Wreszcie, aby zapewnić wydajną amplifikację bibliotek metodą PCR, dolna i wyższa frakcja biblioteki są utrzymywane jako oddzielne próbki na wszystkich etapach konwersji wodorosiarczynu i wzbogacania PCR. Niezastosowanie się do tego powoduje różnicową wydajność amplifikacji podczas reakcji PCR wyższych i niższych frakcji (jak widać na niebieskim śladzie na rysunku 3G ) oraz możliwość nierównej reprezentacji odpowiednich loci genomowych pokrytych w każdej frakcji biblioteki podczas sekwencjonowania. Użytkownik może zdecydować się na włączenie ilościowego etapu PCR bezpośrednio po konwersji wodorosiarczynu w celu dalszego miareczkowania optymalnych cykli PCR potrzebnych do amplifikacji generowanych bibliotek.

Protokół przygotowania biblioteki ERRBS składa się z kilku kluczowych kroków, w których zalecane są konkretne odczynniki. Na etapie naprawy końcowej zastosowanie czteronukleotydowej mieszaniny dNTP pozwala na naprawę końcową wszelkich produktów niezawierających zwisu CG, takich jak te wynikające z enzymatycznej aktywności gwiazdy MspI i ściętych fragmentów DNA obecnych w oryginalnej próbce DNA. Skutkuje to lepszą reprezentacją CpG w wynikach. Na etapie ligacji bardzo ważne jest użycie ligazy o wysokim stężeniu (2 000 000 jednostek/ml) i metylowanych adapterów, aby zapewnić wydajność reakcji ligacji i że konwersja wodorosiarczynu nie wpływa na sekwencje adapterów niezbędne do dokładnego wyrównania danych. Na etapie PCR konieczne jest użycie polimerazy zdolnej do amplifikacji fragmentów DNA bogatych w GC poddanych działaniu wodorosiarczynu w celu uzyskania wysokiej swoistości. Wreszcie, aby zapewnić eliminację nadmiaru adapterów i starterów, zaleca się oczyszczanie kulek SPRI (na przykład: Agencourt AMPure XP) zamiast testów kolumnowych do ligacji i izolacji produktów PCR.

W celu wygenerowania wysokiej jakości danych ważne jest zapewnienie wydajnej konwersji wodorosiarczynu. Prezentowany element sterujący daje użytkownikowi możliwość określenia wydajności konwersji przed sekwencjonowaniem. Alternatywnie, DNA inne niż ludzkie, takie jak DNA lambda, może być użyte jako kontrola wewnętrzna (spike-in). Ze względu na różnice gatunkowe ten rodzaj kontroli może być bezpośrednio włączony do sekwencjonowania na dalszych etapach (np. jak to zostało zastosowane przez Yu i wsp.34). Jednakże, jeśli wykorzystany jest skok, nie można go użyć do określenia wydajności konwersji przed sekwencjonowaniem biblioteki, chyba że zostanie jednoznacznie wzmocniony i niezależnie zsekwencjonowany przed sekwencjonowaniem biblioteki. Określone współczynniki konwersji są oparte na stanie metylacji w miejscach innych niż CpG. Może to nie być odpowiednie do stosowania w kontekście wysokiej metylacji cytozyny w kontekście innym niż CpG (na przykład embrionalne komórki macierzyste) i w tym celu można wykorzystać próbki równoległe lub inne sposoby oceny wydajności konwersji.

Istnieje kilka zastrzeżeń, które należy rozwiązać, a które są unikatowe dla sekwencjonowania bibliotek ERRBS. Pierwsze trzy zasady sekwencjonowanych frakcji bibliotecznych są prawie jednolicie nielosowe ze względu na miejsce cięcia rozpoznawania MspI (C^CGG; patrz rysunek 4B, C). Powoduje to możliwość znacznej utraty danych z powodu niskiej jakości odczytów wynikającej ze złej lokalizacji klastrów pomimo pozornej dużej gęstości klastrów podczas sekwencjonowania. Aby pokonać tę barierę, należy dołączyć bibliotekę o wysokim stopniu złożoności do niezależnego toru (kontrolka PhiX lub inny typ biblioteki) jako dedykowany pas sterowania. Biblioteki o wysokiej złożoności mają końce zawierające zrównoważoną reprezentację A, C, T i G w pierwszych czterech sekwencjonowanych zasadach. Odpowiednie tory kontrolne obejmują biblioteki, takie jak sekwencjonowanie RNA, sekwencjonowanie ChIP, sekwencjonowanie całego genomu lub kontrolę oferowaną przez producenta maszyny do sekwencjonowania (np. PhiX Control v3). Po wyznaczeniu jako pas kontrolny dla odpowiedniego przebiegu sekwencjonowania, może służyć jako podstawa do generowania matrycy, która jest wykorzystywana podczas pierwszych czterech baz sekwencjonowania do wykrywania pozycji klastrów. Wyższa jakość przechwyconych odczytów podniesie średni zasięg na witrynę CpG o 5,2 (n = 4). Alternatywnie, tę trudność techniczną można również przezwyciężyć za pomocą podejścia opartego na ciemnym sekwencjonowaniu, jak opisano wcześniej23. Inne kryteria sekwencjonowania są zgodne ze standardowymi procedurami operacyjnymi zgodnie z protokołami producenta. Wreszcie, zakres na CpG wybrany do analizy danych będzie kierowany przez użytkownika i częściowo przez interesujące go pytania biologiczne. 10-krotny próg pokrycia zapewnia podejście do analizy wysokiego pokrycia, jednak próg ten może zostać obniżony, jeśli jest to interesujące.

Pełne omówienie analizy danych ERRBS wykracza poza zakres tego artykułu, jednak różnicowo metylowane cytozyny i regiony można określić za pomocą narzędzi open source 31,51-53. Dodatkowe zagadnienia i podejścia analityczne zostały dobrze opisane54,55 i zachęca się czytelnika do przeszukania literatury w poszukiwaniu narzędzi najbardziej odpowiednich dla planowanej analizy.

W porównaniu z innymi opublikowanymi metodami, ERRBS oferuje czterodniowy protokół, który, gdy jest wykonywany zgodnie z opisem, zapewnia wysokie wskaźniki odtwarzalności. Został on zwalidowany w porównaniu ze złotym standardem MassARRAY EpiTYPER26, jest opłacalny w przypadku danych o dużym pokryciu i można go dostosować do różnych ilości materiału wejściowego (korzystne dla przetwarzania próbek klinicznych i innych typów komórek o niskiej częstotliwości) oraz podejść do sekwencjonowania. Oferuje rozdzielczość par zasad w biologicznie istotnych loci i może być stosowany w analizach integracyjnych z innymi technikami profilowania wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie, przebudowy chromatyny, znaczników epigenetycznych i innych modyfikacji cytozyny. Wykorzystanie danych ERRBS w takich badaniach może przyczynić się do kompleksowego podejścia molekularnego i umożliwić wielowymiarowe analizy w badaniu modeli biologicznych i chorób ludzkich.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim autorom oryginalnego raportu ERRBS. Dziękujemy Mame Fall za pomoc techniczną. Dziękujemy Weill Cornell Medical College Epigenomics Core za usługi techniczne i pomoc. Prace były wspierane przez Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, NCI K08CA169055 i ASH-AMFDP12005 dla FGB, NIH R01HG006798 i R01NS076465, finansowanie z Irma T. Hirschl i Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) dla CEM oraz grant LLS SCORE (7006-13) dla AMM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MspINew England BiolabsR0106M100 000 jednostek/ml
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SBufor reakcyjny dla enzymu MspI; Krok protokołu 1.2
Roztwór fenoluSigma-AldrichP4557Zrównoważony z 10  mM Tris HCl, pH  8.0; patrz instrukcje dotyczące bezpieczeństwa i obsługi pod adresem http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557
ChloroformSigma-AldrichC2432Zobacz instrukcje dotyczące bezpieczeństwa i obsługi pod adresem http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432
GlikogenSigma-AldrichG176719-22 mg/ml
NaOAcSigma-AldrichS78993 M, pH 5,2
EtanolSigma-AldrichE7023200 proof, do biologii molekularnej
Bufor EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5
tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)Sigma-AldrichT1503przygotować 1 M, pH 8,5
roztwór Tris-etylenodiaminotetraoctowy (TE)Sigma-AldrichT9285Rozcieńczyć do 1x roztworu buforowego zgodnie z zaleceniami producenta
Bufor reakcyjny ligazy DNA T4New England BiolabsB0202S10-krotne stężenie
Trifosforan deoksynukleotydu (dNTP) Mieszanina roztworuNew England BiolabsN0447L10 mM każdy nukleotyd
Polimeraza DNA T4New England BiolabsM0203L3,000 jednostek/ml
Polimeraza DNA I, duży (Klenow) FragmentNew England BiolabsM0210L5,000 jednostek/ml
Kinaza polinukleotydowa T4 NewEngland BiolabsM0201L10 000 jednostek / ml
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104Używany do oczyszczania produktu DNA w kroku protokołu 2.3
2'-deoksyadenozyno5'-trifosforan (dATP)PromegaU1201100 mM
Fragment Klenowa (3'&rzadko; 5' egzo-)New England BiolabsM0212L5,000 jednostek/ml
MinElute PCR Purification KitQiagen28004Używany do oczyszczania produktu DNA w kroku protokołu 3.3
T4 DNA Ligaza NewEngland BiolabsM0202M2,000,000 jednostek/ml
Adapter metylacji Zestaw Oligo IlluminaME-100-0010
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881Używany w sekcjach protokołu, które implementują etapy oczyszczania kulek magnetycznych (kroki 4.3 i 8.2). Przed użyciem wyrównać do temperatury pokojowej.
Kasety żelowe Pippin Prep, 2% agarozy, bez barwnikówSage ScienceCDF2010z wewnętrznymi standardami
Certyfikowany niskozakresowy bufor Ultra AgaroseBio-Rad161-3106
Tris-Borate-EDTA (TBE)Sigma-AldrichT4415
Roztwór bromku etydynySigma-AldrichE151010 mg/ml
50 pz Drabinka DNANEBN3236S
100 pz Drabinka DNANEBN3231S Żel ładujący barwnik,
pomarańczowy (6x)NEBB7022S
nbsp; Nóż  Nie.  11Zestaw3120030
QIAquickQiagen28704
Zestaw do metylacji DNA EZZymo ResearchD5001Używany w kroku protokołu 6.2
Zestaw do metylacji i błyskawicy EZ DNAZymo ResearchD5030Alternatywa dla kroku 6.2
Uniwersalny standard metylowanego ludzkiego DNAZymo ResearchD5011Używany jako kontrola konwersji wodorosiarczynu
System FastStart High Fidelity PCRRoche03553426001
Zestaw do testów wysokiej czułości dsDNATechnologie życiaQ32854Test ilościowy DNA oparty na fluorescencji; używany w krokach protokołu 1.1, 9.1 i 10.1
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-4626
2100 BioanalizatorAgilent Technologies
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
HiSeq 2500Illumina
Pippin PrepSage Science
Qubit 2.0 FluorometrLife TechnologiesQ32872
Zestaw klastrów TruSeq SR v3-cBot-HSIlluminaGD-401-3001
TruSeq SBS Kit v3-HSIlluminaFC-401-3002
TruSeq RNA Przygotowanie próbekIlluminaRS-122-2001Adaptery z kodami kreskowymi używane do multipleksowania bibliotek; Zobacz Plik uzupełniający dla protokołu multipleksowania.
Mikrowirówka
Mieszalnik
Grzałka
Termocykler
Kąpiel
Żel system
elektroforezy
Żel doc
UV lub światła niebieskiego
Skalpel& do ekstrakcji żelu Fisher Scientific wirowysuchego blokuwodnaelektroforezyZasilacz doNadajnik

Bibliografia

  1. Jones, P. A. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nat Rev Genet. 13 (7), 484-492 (2012).
  2. Barlow, D. P. Genomic imprinting: a mammalian epigenetic discovery model. Annual Review Of Genetics. 45, 379-403 (2011).
  3. Thiagarajan, R. D., Morey, R., Laurent, L. C. The epigenome in pluripotency and differentiation. Epigenomics. 6 (1), 121-137 (2014).
  4. Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447 (7143), 425-432 (2007).
  5. Hartnett, L., Egan, L. J. Inflammation, DNA methylation and colitis-associated cancer. Carcinogenesis. 33 (4), 723-731 (2012).
  6. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet. 14 (3), 204-220 (2013).
  7. Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  9. Feinberg, A. P. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature. 447 (7143), 433-440 (2007).
  10. Bock, C. Epigenetic biomarker development. Epigenomics. 1 (1), 99-110 (2009).
  11. Laird, P. W. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer. 3 (4), 253-266 (2003).
  12. How Kit, A., Nielsen, H. M., Tost, J. DNA methylation based biomarkers: practical considerations and applications. Biochimie. 94 (11), 2314-2337 (2012).
  13. Mikeska, T., Bock, C., Do, H., Dobrovic, A. DNA methylation biomarkers in cancer: progress towards clinical implementation. Expert Review Of Molecular Diagnostics. 12 (5), 473-487 (2012).
  14. Gyparaki, M. T., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer. Journal of Molecular Medicine. 91 (11), 1249-1256 (2013).
  15. Figueroa, M. E., et al. DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 17 (1), 13-27 (2010).
  16. Heyn, H., Mendez-Gonzalez, J., Esteller, M. Epigenetic profiling joins personalized cancer medicine. Expert review of Molecular Diagnostics. 13 (5), 473-479 (2013).
  17. Kulis, M., Esteller, M. DNA methylation and cancer. Advances in Genetics. 70, 27-56 (2010).
  18. Xiong, Z., Laird, P. W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 25 (12), 2532-2534 (1997).
  19. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 33 (18), 5868-5877 (2005).
  20. Gu, H., et al. Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling. Nat Protoc. 6 (4), 468-481 (2011).
  21. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nat Biotechnol. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  22. Harris, R. A., et al. Comparison of sequencing-based methods to profile DNA methylation and identification of monoallelic epigenetic modifications. Nat Biotechnol. 28 (10), 1097-1105 (2010).
  23. Boyle, P., et al. Gel-free multiplexed reduced representation bisulfite sequencing for large-scale DNA methylation profiling. Genome Biol. 13 (10), R92(2012).
  24. Chatterjee, A., Rodger, E. J., Stockwell, P. A., Weeks, R. J., Morison, I. M. Technical considerations for reduced representation bisulfite sequencing with multiplexed libraries. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 741542(2012).
  25. Lee, Y. K., et al. Improved reduced representation bisulfite sequencing for epigenomic profiling of clinical samples. Biological Procedures Online. 16 (1), 1(2014).
  26. Akalin, A., et al. Base-pair resolution DNA methylation sequencing reveals profoundly divergent epigenetic landscapes in acute myeloid leukemia. PLoS Genet. 8 (6), e1002781(2012).
  27. Hatzi, K., et al. A Hybrid Mechanism of Action for BCL6 in B Cells Defined by Formation of Functionally Distinct Complexes at Enhancers and Promoters. Cell Reports. 4 (3), 578-588 (2013).
  28. Will, B., et al. Satb1 regulates the self-renewal of hematopoietic stem cells by promoting quiescence and repressing differentiation commitment. Nature Immunology. 14 (5), 437-445 (2013).
  29. Lu, C., et al. Induction of sarcomas by mutant IDH2. Genes Dev. 27 (18), 1986-1998 (2013).
  30. Kumar, R., et al. AID stabilizes stem-cell phenotype by removing epigenetic memory of pluripotency genes. Nature. 500 (7460), 89-92 (2013).
  31. Li, S., et al. An optimized algorithm for detecting and annotating regional differential methylation. BMC Bioinformatics. 14, Suppl 5. S10(2013).
  32. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. Journal of Visualized Experiments. (56), 3170(2011).
  33. Landan, G., et al. Epigenetic polymorphism and the stochastic formation of differentially methylated regions in normal and cancerous tissues. Nat Genet. 44 (11), 1207-1214 (2012).
  34. Yu, M., et al. Tet-assisted bisulfite sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (12), 2159-2170 (2012).
  35. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86(2010).
  36. Dorff, K. C., et al. GobyWeb: simplified management and analysis of gene expression and DNA methylation sequencing data. PLoS One. 8 (7), e69666(2013).
  37. Roehr, J. T., Dodt, M., Ahmed, R., Dieterich, C. Flexbar − flexible barcode and adapter processing for next-generation sequencing platforms. MDPI Biology. 1 (3), 895-905 (2012).
  38. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal, North America. 17 (1), 10-12 (2011).
  39. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  40. Needleman, S. B., Wunsch, C. D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 48 (3), 443-453 (1970).
  41. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  42. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).
  44. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  45. Team, R. C. R. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, http://www.R-project.org (2012).
  46. Nestor, C., Ruzov, A., Meehan, R., Dunican, D. Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in DNA. BioTechniques. 48 (4), 317-319 (2010).
  47. Huang, Y., et al. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5 (1), e8888(2010).
  48. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
  49. Song, C. X., et al. Genome-wide profiling of 5-formylcytosine reveals its roles in epigenetic priming. Cell. 153 (3), 678-691 (2013).
  50. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  51. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biol. 13 (10), R87-1186 (2012).
  52. Stockwell, P. A., Chatterjee, A., Rodger, E. J., Morison, I. M. DMAP: Differential Methylation Analysis Package for RRBS and WGBS data. Bioinformatics. 30 (13), 1814-1822 (2014).
  53. Sun, D., et al. MOABS: model based analysis of bisulfite sequencing data. Genome Biol. 15 (2), R38(2014).
  54. Bock, C. Analysing and interpreting DNA methylation data. Nat Rev Genet. 13 (10), 705-719 (2012).
  55. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza metylacji DNAtrawienie enzymami restrykcyjnymikonwersja pirosiarczynowaprzygotowanie bibliotekisekwencjonowanie nowej generacjiloci genomowe bogate w pary CGzautomatyzowana ekstrakcja z eluanaliza wizualizacji danych
Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.