Artykuł metodologiczny

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

DOI:

10.3791/52298

⸱

28 stycznia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultury neuronalne specyficzne dla chorób człowieka są niezbędne do generowania modeli in vitro dla ludzkich chorób neurologicznych. Jednak brak dostępu do pierwotnych kultur neuronalnych dorosłych ludzi rodzi wyjątkowe wyzwania. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zapewniają alternatywne podejście do uzyskiwania kultur nerwowych z fibroblastów skóry za pomocą iPSC specyficznych dla pacjenta, ale proces ten jest pracochłonny, wymaga specjalnej wiedzy specjalistycznej i dużych zasobów oraz może trwać kilka miesięcy. Uniemożliwia to szerokie zastosowanie tej technologii do badania chorób neurologicznych. Aby przezwyciężyć niektóre z tych problemów, opracowaliśmy metodę pozyskiwania nerwowych komórek macierzystych bezpośrednio z ludzkiej dorosłej krwi obwodowej, z pominięciem procesu wyprowadzania iPSC. Hematopoetyczne komórki progenitorowe wzbogacone z ludzkiej dorosłej krwi obwodowej hodowano in vitro i transfekowano wektorami wirusa Sendai zawierającymi czynniki transkrypcyjne Sox2, Oct3/4, Klf4 i c-Myc. Transfekcja powoduje zmiany morfologiczne w komórkach, które są dalej selekcjonowane przy użyciu ludzkiej pożywki progenitorowej zawierającej podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF). Powstałe komórki charakteryzują się ekspresją markerów nerwowych komórek macierzystych, takich jak gniazdyna i SOX2. Te nerwowe komórki macierzyste mogą być dalej różnicowane do neuronów, astrogleju i oligodendrocytów w określonych pożywkach różnicujących. Wykorzystując łatwo dostępne próbki ludzkiej krwi obwodowej, metoda ta może być wykorzystana do uzyskania nerwowych komórek macierzystych w celu dalszego różnicowania się z komórkami nerwowymi w celu modelowania in vitro zaburzeń neurologicznych i może przyczynić się do postępu w badaniach związanych z patogenezą i leczeniem tych chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowle neuronów in vitro były używane jako podstawowe narzędzie do badań nad chorobami neurologicznymi. W takich badaniach najczęściej wykorzystuje się pierwotne hodowle neuronalne zwierząt (głównie gryzoni) 1,2 oraz ludzkie linie komórek nerwowych pochodzące z glejaków lub innych nowotworów. Uznano jednak, że istnieją znaczne różnice między komórkami gryzoni i ludzkimi. Wielu ustaleń opartych na gryzoniach nie można przełożyć na ludzi. Co więcej, wraz z szybkim rozwojem analizy masowych informacji genomicznych oraz stosunkowo łatwą edycją genów i sekwencjonowaniem całego genomu, trend jest coraz bardziej nastawiony na odkrywanie genów podatnych na choroby i określanie ich funkcji i ról w określonych chorobach, co sprawia, że nieliczne ludzkie linie komórek neuronalnych mają tylko ograniczone zastosowanie. Teoretycznie najlepszym wyborem są pierwotne kultury neuronalne człowieka pochodzące z próbek układu nerwowego pacjenta, ale są one niemożliwe do uzyskania; W związku z tym konieczne są alternatywne metody. W ostatnich latach podjęto pewne działania, z których dwa są najbardziej charakterystyczne. Po opracowaniu techniki generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu mysich i ludzkich komórek somatycznych 3,4, komórki nerwowe mogą być od nich dalej różnicowane5-7. Jednak generowanie i charakteryzowanie iPSC wymaga intensywnego nakładu pracy, technik i czasu, czasami nawet zaporowego. Wkrótce potem opracowano inne podejście do bezpośredniej transformacji komórek neuronalnych z komórek somatycznych 8,9. Ponieważ powstałe neurony są nieproliferacyjne, ogranicza to jego zastosowanie w intensywnych badaniach i badaniach przesiewowych leków, które wymagają dużej ilości komórek. Aby skorzystać z obu technik, kilka grup10-12 badało bezpośrednie pochodzenie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z komórek somatycznych, co omija żmudny proces generowania i charakteryzowania iPSC, ale nadal zapewnia przyzwoitą liczbę nerwowych komórek macierzystych do późniejszego różnicowania neuronów. Wcześniej wykazaliśmy, że po wprowadzeniu czynników transkrypcyjnych Yamanaka do hematopoetycznych komórek progenitorowych, nerwowe komórki macierzyste mogą być bezpośrednio generowane przy użyciu pożywki selekcyjnej nerwowych komórek progenitorowych13. Tutaj szczegółowo opisujemy tę metodę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzbogacanie hematopoetycznych komórek progenitorowych z dorosłej krwi pełnej

UWAGA: Krwiotwórcze komórki progenitorowe lub komórki CD34+ mogą być oczyszczane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) pochodzących z różnych źródeł, w tym krwi pępowinowej, materiału leukaferezy i krwi pełnej, przy użyciu metod opartych na wirowaniu w gradionym gradimencie gęstości. Wymieniona tutaj metoda wykorzystuje jako przykład krew pełną.

  1. Izolacja PBMC z krwi pełnej:
    1. Dodać 4,5 ml pożywki do separacji limfocytów do probówki SepMate, pipetując ją przez centralny otwór wkładki.
    2. Rozcieńczyć próbkę krwi równą objętością sterylnego DPBS zawierającego 2% surowicy ludzkiej (v/v). Na przykład rozcieńczyć 5 ml próbki 5 ml DPBS + 2% surowicy ludzkiej.
    3. Dodać rozcieńczoną próbkę, pipetując ją wzdłuż boku probówki. Należy uważać, aby nie przelać próbki bezpośrednio przez centralny otwór.
    4. Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Ostrożnie usunąć supernatant znajdujący się powyżej warstwy PMBC.
    6. Zbierz warstwę PBMC (mętną) do nowej probówki.
    7. Dodać 15 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierającego 2% surowicy ludzkiej do probówki i wirować przy sile 150 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml DPBS zawierającym 2% surowicy ludzkiej. Policz liczbę komórek.
    9. Wirować przy 690 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć cały supernatant z probówki.
    10. Zawiesić komórki w 1 x 107 komórek na 15 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco (IMDM) firmy Iscove zawierającego 1% antybiotyków (v/v) i 10% surowicy ludzkiej (v/v).
    11. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 przed wyizolowaniem komórek CD34+.
  2. Pozytywna selekcja komórek CD34+ z PBMC przy użyciu zestawu CD34 MultiSort:
    UWAGA: Pracuj szybko i używaj wstępnie schłodzonych roztworów, aby schłodzić komórki i zapobiec zamykaniu przeciwciał na powierzchni komórki oraz niespecyficznemu znakowaniu komórek zgodnie z instrukcją zestawu.
    1. Zebrać wszystkie PMBC w probówce o pojemności 50 ml i policzyć całkowitą liczbę komórek w pożywce.
    2. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut. Całkowicie usunąć cały supernatant.
    3. Zawiesić do 108 komórek na 300 μl w buforze perełkowym (DPBS zawierającym 0,5% ludzkiej surowicy (v/v) i 2 mM EDTA).
    4. Dodać 100 μl odczynnika blokującego FcR i dodać 100 μl CD34 MultiSortMicroBeads.
    5. Dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w lodówce (2 - 8 °C).
    6. Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu perełkowego na10-8 komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w suchej temperaturze pokojowej. Całkowicie usunąć supernatant.
    7. Zawiesić do 108 komórek w 500 μl buforu.
    8. Umieścić kolumnę MACS LS w polu magnetycznym separatora MACS i przygotować kolumnę, przepłukując ją 3 ml buforu perełkowego.
    9. Zastosuj zawieszenie komórki na środku kolumny. Przepłyną nieoznakowane komórki, przez które można je zebrać, jeśli jest to preferowane.
    10. Przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml buforu do kulek.
    11. Wyjąć kolumnę z separatora i umieścić ją w probówce o pojemności 15 ml.
    12. Dodać 5 ml buforu perełkowego do kolumny i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, wciskając tłok do kolumny.
    13. Dodać 20 μl odczynnika MultiSort Release na 1 ml zawiesiny komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w lodówce (2 - 8 °C).
    14. Dodać 1 - 2 ml buforu perełkowego na 107 komórek i odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w suchej temperaturze miejsca. Całkowicie usunąć supernatant.
    15. Zawieś komórki w 50 μl buforu kulkowego na 10-7 komórek.
    16. Dodać 30 μl odczynnika MultiSort Stop na 10-7 komórek i inkubować przez 15 minut w lodówce.
    17. Dodać 5 ml buforu perełkowego i odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.

2. Wyprowadzenie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z komórek CD34+

  1. Hodowla komórek CD34 +:
    UWAGA: Świeżo przygotowane podłoże należy zużyć w ciągu 7 dni, jeśli jest przechowywane w lodówce. Znaczną utratę komórek CD34 można zaobserwować po 24 godzinach, ale znaczna proliferacja komórek powinna być zauważalna, zwłaszcza po 5 dniu. Jeśli liczba komórek stale spada lub nie ma proliferacji, oznacza to albo złą jakość pożywki, albo komórek CD34 i komórki nie powinny być używane do następnego kroku.
    1. Zawiesić i hodować komórki CD34 + w pożywce podtrzymującej CD34 (pożywka StemSpan SFEM zawierająca ludzką trombopoetynę (TPO, 100 ng / ml), ligand kinazy tyrozynowej 3 podobnej do fms (Flt-3) (100 ng / ml) i czynnik komórek macierzystych (SCF, 100 ng / ml), interleukinę-6 (IL-6, 20 ng / ml) i interleukinę-7 (IL-7, 20 ng / ml)) na płytce 24-dołkowej (do 3 x 105 / dołek w 1 ml pożywki na basenik) w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .
    2. Po 24 godzinach zbierz pływające komórki i odwiruj komórki przy 110 x g w temperaturze pokojowej, aby pozbyć się wszelkich przyczepionych komórek i resztek komórek. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki podtrzymującej CD34 i wysiewać nasiona na nowej 24-dołkowej płytce (do 1 x 105/dołek) w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez dodatkowe 5 dni.
    3. Wymieniaj połowę pożywki co drugi dzień, ostrożnie odsysając górną połowę supernatantu, podczas gdy komórki CD34+ unoszą się na dnie studzienek (ryc. 1A).
  2. Transfekcja wirusa Sendai:
    1. W 5 dniu zebrać komórki CD34 i odwirować komórki przy 170 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    2. Zawiesić komórki w świeżej pożywce w proporcjach 1 x 105/dołek na 24-dołkowej płytce w 1 ml pożywki.
    3. Rozmrozić zestaw do przeprogramowania cytotune-iPS Sendai, zanurzając najpierw dna probówek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 sekund, a następnie całkowicie rozmrozić w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować probówki i umieścić je na lodzie. Przygotować mieszaninę wirusów Sendai, mieszając zalecaną objętość każdego wirusa wymienioną w certyfikacie analizy (COA) dla odpowiedniej partii. Zalecany jest MOI 15.
    4. Dodaj mieszankę wirusa Sendai do każdej studzienki komórek CD34. Wymieszaj dołki, delikatnie potrząsając. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
    5. Obserwuj wydajność transfekcji po 24 godzinach. Zauważ, że agregaty komórek i tworzenie kul są wskaźnikami udanej transfekcji (Rysunek 1B).
    6. Zmień połowę podłoża, ostrożnie przenosząc górną połowę podłoża do innego dołka. Jeśli w nowej studzience znajdują się kule komórkowe, dodaj taką samą ilość świeżej pożywki.
    7. Zmieniaj podłoże co drugi dzień, powtarzając krok 2.2.6.
  3. Indukcja nerwowych komórek macierzystych:
    UWAGA: W zależności od warunków komórkowych, około 5 lub 7 dni po transfekcji, jednowarstwowe komórki przylegające osiągną 30-50% konfluencji (ryc. 1C).
    1. Usunąć supernatanty zawierające pływające komórki i kulki, a następnie dodać 1 ml neuronalnej pożywki progenitorowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12), zawierającej 1x suplement N2, 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% (v/v) antybiotyków, 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)) do przylegających komórek.
    2. Opcjonalnie należy rozdzielić kulki komórkowe poprzez delikatne pipetowanie i odwirować komórki przy stężeniu 170 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki progenitorowej układu nerwowego na nowej 24-dołkowej płytce pokrytej matrycą zgodnie z instrukcją jako kopię zapasową.
    3. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 60 - 80% zlewania się, zwykle po 1 tygodniu.
    4. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml pożywki z nerwowych komórek macierzystych (pożywka wolna od surowicy, NSC SFM). Oddziel komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie bardzo delikatnie pipetuj.
    5. Usuń komórki i wysiew je wszystkie w jednym dołku na 6-dołkowej płytce. Dodaj kolejny 1 ml pożywki z nerwowych komórek macierzystych, aby uzyskać 2 ml pożywki dla każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
    6. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
    7. Gdy komórki osiągną 60% konfluencji, zdysocjuj i ponownie plateruj komórki w stosunku 1:3, wykonując czynności opisane w 2.3.4 i 2.3.6.
  4. Zamrażanie nerwowych komórek macierzystych:
    1. Przygotuj pożywkę do zamrażania nerwowych komórek macierzystych, dodając 20% dimetylosulfotlenku (DMSO) do pożywki z nerwowych komórek macierzystych. Utrzymuj zamrażarkę na lodzie.
    2. Oddzielić komórki na płytce 6-dołkowej za pomocą skrobaka do komórek, a następnie delikatnie pipetować. Policz komórki. Odwirować komórki przy stężeniu 170 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    3. Ponownie zawiesić komórki w pożywce z nerwowymi komórkami macierzystymi w proporcjach 1 x 106/ml. Dodać taką samą objętość pożywki do zamrażania do komórek.
    4. Dodać 1 ml (5 x 10 łącznie5 komórek) komórek w kriowalu. Zamroź komórki za pomocą pojemnika do zamrażania Mr. Froster zgodnie z instrukcją.

3. Różnicowanie komórek nerwowych

  1. Różnicowanie komórek nerwowych:
    1. Gdy nerwowe komórki macierzyste osiągną 80% zbieżności, odłącz nerwowe komórki macierzyste za pomocą gumowego policjanta, a następnie rozdziel je przez delikatne pipetowanie.
    2. Policz komórki i dostosuj stężenie do 1 x 105/ml w pożywce z nerwowych komórek macierzystych.
    3. W celu różnicowania neuronów umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną/lamininą na 24-dołkowych płytkach o wymiarach 1 x 105 / dołek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
    4. Zastąp pożywkę pożywką do różnicowania neuronalnego (DMEM/F12 zawierającą 1x suplement N2, 1x suplement B27, 300 ng/ml cAMP, 0,2 mM witaminy C, 10 ng/ml czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) i 10 ng/ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z komórek glejowych (GDNF)) po 24 godzinach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .
    5. Zmieniaj pożywkę różnicowania neuronalnego dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie.
  2. Zróżnicowanie astroglejowe:
    1. Oddziel nerwowe komórki macierzyste przez pipetowanie.
    2. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 5 x 104 komórek/ml. Wysiewaj komórki na 24-dołkowych płytkach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
    3. Zastąp pożywkę DMEM/F12 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .
    4. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie. Jeśli komórki osiągną konfluencję przed 2 tygodniami, ponownie pokryj je płytkami, wykonując czynności 3.2.1 i 3.2.2.
  3. Różnicowanie oligodendrocytów:
    1. Oddziel nerwowe komórki macierzyste przez pipetowanie.
    2. Policz komórki i zasiew 1 x 105 komórek na 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-L-ornityną w 1 ml pożywki różnicującej oligodendrocyty składającej się z DMEM / F12 zawierającego suplement N2, 10 ng / ml płytkowego czynnika wzrostu AA (PDGF-AA), 2 ng / ml neurotrofiny-3 (NT-3), 2 ng / ml jeża sonicznego (Shh) i 3 nM trójjodotyroniny (T3). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
    3. Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu przez 2 tygodnie.
    4. Zastąp pożywkę DMEM/F12 suplementem 1xN2 i 3 nM T3 i hoduj komórki przez dodatkowy tydzień w celu produkcji podstawowego białka mieliny (MBP).

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Zastąp pożywkę 4% paraformaldehydem (PFA). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Wyrzuć PFA i przemyj PBS zawierającym 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3 razy po 5 minut za każdym razem.
  3. Przepuszczalność komórek za pomocą PBS zawierającego 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zablokuj komórki PBS-T zawierającym 4% surowicy koziej przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w PBS-T zawierającym 0,1% BSA przez 2 godziny w temperaturze RT lub O/N w chłodni.
  6. Myj komórki 3 razy PBS-T, za każdym razem 5 minut. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluorochromem, stosując rozcieńczenie 1:400 w PBS-T zawierającym 0,1% BSA przez 1 godzinę na wytrząsarce w ciemności.
  7. Przemyć komórki PBS-T zawierającym 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj komórki jeszcze dwa razy PBS-T przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Obserwuj oznaczone komórki za pomocą mikroskopu i zrób zdjęcia (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość komórek CD34 jest kluczowa dla powodzenia transdukcji nerwowych komórek macierzystych. Wysokiej jakości komórki CD34 namnażają się w ciągu pierwszych kilku dni hodowli i pojawiają się jako nieprzylegające, jednorodnie okrągłe komórki, unoszące się tuż nad dnem naczyń hodowlanych (ryc. 1A). Udana infekcja powoduje powstanie agregatów komórkowych, które rozszerzają się z czasem (ryc. 1B), podczas gdy podczas hodowli komórkowej mogą wystąpić niespecyficzne agregaty komórkowe, które r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podano szczegółowy protokół bezpośredniego generowania nerwowych komórek macierzystych z obwodowych hematopoetycznych komórek progenitorowych.

W porównaniu z komórkami fibroblastów ludzka krew obwodowa jest bardziej dostępna. Korzystając z przedstawionego protokołu, z 10 ml krwi pełnej można wzbogacić więcej niż 1 x10 5 hematopoetycznych komórek progenitorowych lub komórek CD34-dodatnich. Chociaż zanieczyszczeniu płytkami krwi zwykle nie można zapobiec, można je łatwo zmniejszyć, wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie jest finansowane ze środków krajowych NIH.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka do separacji limfocytówLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 ml
Surowica ludzkaInvitrogen34005-100
AntybiotykiGibco15240-0621%
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS kolumnaMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM mediumStemcell Technologies96501x
IMDMQuality Biologicals112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
IPS Sendai Zestaw do przeprogramowaniaTechnologiesA1378001
Skrobak do komórekSarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
FiolkiCryoTubePojemnik Thermo368632
Mr. FrostyThermo5100-0001
DMEM/F12Life Technologies12400-0241x
suplement N2Life Technologies17502-0481x
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA29340,1% (w/v)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFPeprotechAF-100-15
B27 suplementLife Technologies17504-0441x
NSC surowica bez surowicy pożywkaLife TechnologiesA10509011x
Szkiełka nakrywkowe powlekane poli-D-lizyną/lamininąBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
Witamina CSigmaA02780,2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
Poli-L-ornitynaSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
PFASigmaP61484%
PBSJakość Biologiczna119-069-1011x
Kozia surowicaSigmaG90234%
TritonX-100SigmaT9284
Mysi monoklonalny anty-NestinMilliporeAB59221:1,000 rozcieńczenie
anty-SOX2 przeciwciałoZastosowane komórki macierzysteASA0120Gotowe do użycia
Mysz anty-β Przeciwciało III-tubulinyPromegaG712A:1,000 rozcieńczenie
Królicze przeciwciało anty-GFAPSigmaG45461:100 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-O4R& Systemy DMAB1326IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-króliczeTechnologie życiaA110121:400 rozcieńczenie
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysieTechnologie życiaA110011:400 rozcieńczenie
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgMLife techniologiesA210421:250 rozcieńczenie
DAPISigmaD95421 μ g/ml
Life 1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193(2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801(2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720(2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transfekcja wirusa SendaiCD34 z krwi obwodowejpo ywka dla prekursor w neuronalnychmikroskopia immunofluorescencyjnaekspresja Nestiny i SOX2r nicowanie neuronalnegenerowanie astrocyt w i oligodendrocyt wmetoda bezpo redniej indukcji

Powiązane artykuły