Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Podsumowanie

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany ⁶⁴Cu.

Streszczenie

Ze względu na swoje wyjątkowe powinowactwo i specyficzność, przeciwciała stały się niezwykle obiecującymi wektorami do dostarczania radioizotopów do komórek nowotworowych do obrazowania PET. Jednak konieczność znakowania przeciwciał radionuklidami o długim fizycznym okresie półtrwania często skutkuje wysokimi dawkami promieniowania tła w tkankach niebędących przedmiotem zwalczania. Aby obejść ten problem, zastosowaliśmy wstępnie ukierunkowaną strategię obrazowania PET opartą na reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwrotnym zapotrzebowaniem elektronów. Metodologia ta oddziela przeciwciało od radioaktywności, a tym samym wykorzystuje pozytywne cechy przeciwciał, unikając jednocześnie ich wad farmakokinetycznych. System składa się z czterech etapów: (1) wstrzyknięcia koniugatu mAb-trans-cyklooctenu (TCO); (2) okres lokalizacji, w którym przeciwciało gromadzi się w guzie i usuwa się z krwi; (3) wstrzyknięcie znakowanej radioizotopowo tetrazyny; oraz (4) podwiązanie składników metodą click in vivo, po którym następuje usunięcie nadmiaru radioligandu. W przykładzie przedstawionym w niniejszej pracy, radioligand tetrazynowy znakowany ⁶⁴Cu-NOTA i humanizowane przeciwciało sprzężone z trans-cyklooktenem (huA33) zostały z powodzeniem wykorzystane do nakreślenia guzów raka jelita grubego SW1222 o wysokim kontraście guza do tła. Co więcej, metodologia celowania wstępnego pozwala uzyskać wysokiej jakości obrazy przy zaledwie ułamku dawki promieniowania do tkanki niedocelowej utworzonej przez radioimmunokoniugaty bezpośrednio znakowane ⁶⁴Cu lub ⁸⁹Zr. Ostatecznie modułowość tego protokołu jest jedną z jego największych zalet, ponieważ ugrupowanie transcyklooctenu może być dołączone do dowolnego przeciwciała nieinternalizującego, a tetrazyna może być przyłączona do szerokiej gamy izotopów promieniotwórczych.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich trzydziestu lat, pozytonowa tomografia emisyjna (PET) stała się niezastąpionym narzędziem klinicznym w diagnostyce i leczeniu raka. Przeciwciała od dawna uważane są za obiecujące wektory dostarczania izotopów promieniotwórczych emitujących pozytony do nowotworów ze względu na ich wyjątkowe powinowactwo i swoistość wobec biomarkerów nowotworowych. ^1,2 Jednak stosunkowo powolna farmakokinetyka przeciwciał in vivo wymaga stosowania izotopów promieniotwórczych o wielodniowym fizycznym okresie półtrwania. Ta kombinacja może powodować wysokie dawki promieniowania do narządów niedocelowych pacjentów, co jest ważnym powikłaniem, które ma szczególne znaczenie kliniczne, ponieważ radioimmunokoniugaty są wstrzykiwane dożylnie, a zatem – w przeciwieństwie do częściowej tomografii komputerowej ciała – skutkują pochłonięciem dawek w każdej części ciała, niezależnie od badanych tkanek.

Aby ominąć ten problem, wiele wysiłku poświęcono na rozwój strategii obrazowania PET, które rozdzielają radioizotop i grupę docelową, wykorzystując w ten sposób korzystne właściwości przeciwciał, jednocześnie omijając ich wewnętrzne ograniczenia farmakokinetyczne. Strategie te – najczęściej nazywane celowaniem wstępnym lub celowaniem wieloetapowym – zazwyczaj obejmują cztery etapy: (1) podanie przeciwciała zdolnego do wiązania zarówno antygenu, jak i radioligandu; (2) akumulacja przeciwciał w tkance docelowej i ich usunięcie z krwi; (3) podawanie małocząsteczkowego radioligandu; oraz (4) ligację in vivo radioligandu z przeciwciałem, po której następuje szybki klirens nadmiaru radioligandu. ^3-8 W niektórych przypadkach między etapami 2 i 3 wstrzykuje się dodatkowy środek czyszczący w celu przyspieszenia wydalania przeciwciał, które jeszcze nie związały guza i pozostają we krwi. ⁵

Ogólnie rzecz biorąc, dwa rodzaje strategii pretargetowania są najbardziej rozpowszechnione w literaturze. Chociaż oba okazały się skuteczne w modelach przedklinicznych, mają również kluczowe ograniczenia, które utrudniają ich zastosowanie kliniczne. Pierwsza strategia opiera się na wysokim powinowactwie między przeciwciałami sprzężonymi ze streptawidyną a radioznakami modyfikowanymi biotyną; Jednak immunogenność przeciwciał zmodyfikowanych streptawidyną okazała się niepokojącym problemem w odniesieniu do translacji. ^5,6,9,10 Druga strategia, w przeciwieństwie do tego, wykorzystuje bispecyficzne przeciwciała, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu wiązania zarówno antygenu biomarkera raka, jak i drobnocząsteczkowego haptenu znakowanego radioaktywnie. ^3,11-14 Chociaż ta ostatnia ścieżka jest z pewnością twórcza, jej szerokie zastosowanie jest ograniczone przez złożoność, koszty i brak modułowości systemu.

Ostatnio opracowaliśmy i opublikowaliśmy wstępnie ukierunkowaną metodologię obrazowania PET opartą na reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera (IEDDA) z odwrotnym zapotrzebowaniem elektronów między transcyklooctenem (TCO) a tetrazyną (Tz; Rysunek 1). ¹¹ Podczas gdy sama reakcja jest znana od dziesięcioleci, chemia IEDDA przeżywa w ostatnich latach renesans jako technika biokoniugacji chemii klikanej, co ilustrują fascynujące prace grup Ralpha Weissledera, Josepha Foxa i Petera Conti. ^12-15 Cykloaddycja IEDDA została zastosowana w szerokim zakresie zastosowań, w tym w obrazowaniu fluorescencyjnym za pomocą peptydów, przeciwciał i nanocząstek, a także w obrazowaniu jądrowym zarówno za pomocą radiohalogenów, jak i radiometali. ^16-26 Podwiązanie jest wysokowydajne, czyste, szybkie (k₁ > 30 000 ^{M-1 sec-1}), selektywne i – co najważniejsze – bioortogonalne. ²⁷ I chociaż wiele rodzajów chemii kliknięć – w tym katalizowane Cu cykloaddycje azydkowo-alkilonowe, cykloaddycje azydkowo-alkinowe promowane szczepem i ligacje Staudingera – są również bioortogonalne, to unikalne połączenie kinetyki szybkiej reakcji i bioortogonalności sprawia, że chemia IEDDA tak dobrze nadaje się do zastosowań pretargetowania w całych organizmach. ^28,29 Idąc tym tropem, ważne jest, aby zauważyć, że niedawny raport z naszych laboratoriów nie był pierwszym, w którym zastosowano chemię IEDDA do pretargetingu: pierwsze doniesienie o obrazowaniu pretargetowanym za pomocą IEDDA powstało z pracy Rossina i wsp. i zawierało metodologię SPECT wykorzystującą tetrazynę znakowaną intopem ¹¹¹. ^{Rozdział 30}

Jak omówiliśmy powyżej, metodologia pretargetingu składa się z czterech dość prostych kroków (Rysunek 2). W omawianym protokole opisana zostanie wstępnie ukierunkowana strategia obrazowania PET raka jelita grubego, która wykorzystuje radioligand tetrazynowy znakowany ⁶⁴Cu-NOTA i zmodyfikowany TCO koniugat przeciwciała huA33. Jednak ostatecznie modułowość tej metodologii jest jedną z jej największych zalet, ponieważ ugrupowanie transcyklooktenu może być dołączone do dowolnego przeciwciała nieinternalizującego, a tetrazyna może być przyłączona do szerokiej gamy radioaktywnych reporterów.

Protokół

OŚWIADCZENIE ETYCZNE: Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem i zgodnie z etycznymi wytycznymi Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Synteza Tz-Bn-NOTA

1. W małym naczyniu reakcyjnym rozpuścić 7 mg NH 2-Bn-NOTA (1,25 x ^10-2 mmol) w 600 μl buforu_NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Sprawdź pH roztworu. W razie potrzeby dostosować pH roztworu do 8,1 przy użyciu małych porcji 0,1 M Na₂CO₃ .
2. Dodać roztwór NH 2-Bn-NOTA do 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x ^10-3 mmol) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
   nuta: Tz-NHS można zważyć na sucho lub dodać z roztworu podstawowego suchego DMF lub DMSO (< 50 μl).
3. Pozostawić otrzymany roztwór reakcyjny do reakcji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
4. Po 30 minutach oczyścić produkt za pomocą chromatografii HPLC_C18 z odwróconymi fazami w celu usunięcia nieprzereagowanego NH 2-Bn-NOTA. NH 2-Bn-NOTA może być monitorowany na długości fali 254 nm, podczas gdy Tz-NHS i Tz-Bn-NOTA najlepiej monitorować na długości fali 525 nm.
   nuta: Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od konfiguracji sprzętu HPLC w każdym laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.). Jednakże, dla przykładu, jeśli gradient 0:100 MeCN/H₂O (oba z 0,1% TFA) do 100:0 MeCN/H₂O przez 25 minut i używana jest analityczna kolumna C₁₈ 4,6 x 250 mm, czasy retencji Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS i NH 2-Bn-NOTA wyniosą około 15 minut, 16,5 minut, i 10 minut, odpowiednio. Produkt może być oczyszczony z innych składników reakcji w jednym cyklu lub wielu przebiegach przy użyciu półpreparatywnej lub preparatywnej kolumny C₁₈ HPLC. ¹H-NMR, analityczna HPLC i ESI-MS to metody, które można wykorzystać do weryfikacji czystości gotowego prekursora Tz-Bn-NOTA. ¹¹
5. Zebrać eluent HPLC zamrozić za pomocą ciekłego azotu.
6. Owiń zamrożoną probówkę zbiorczą w nieprzezroczystą folię aluminiową.
7. Umieścić zamrożoną probówkę zbiorczą w naczyniu liofilizującym O/N w celu usunięcia ruchomej fazy HPLC.
8. Oczyszczony produkt (jasnoróżowe ciało stałe) należy przechowywać w ciemności w temperaturze -80 °C.
   nuta: Jest to akceptowalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy prekursor Tz-Bn-NOTA jest stabilny przez co najmniej 1 rok w tych warunkach.

2. Przygotowanie immunokoniugatu huA33-TCO

1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór TCO-NHS o stężeniu 1 mg/ml (2,7 mM) w suchym DMF.
2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór huA33 o stężeniu 2 mg/ml (13,3 μM) w 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,4 (0,01 M PO₄^3-_, 0,154 M NaCl).
3. Stosując małe podwielokrotności (< 5 μl) 0,1 M Na₂CO_{3 dostosować} pH roztworu przeciwciała do 8,8-9,0. Do monitorowania pH należy używać papieru do pomiaru pH lub pH-metru z mikroelektrodą i uważać, aby pH nie wzrosło powyżej pH 9,0.
4. Gdy roztwór przeciwciała osiągnie prawidłowe pH, dodaj objętość roztworu TCO-NHS odpowiadającą 8 molowym odpowiednikom aktywowanego estru. Na przykład dodać 7,9 μl roztworu TCO-NHS o stężeniu 1 mg/ml (1,07 x ^10-7 mol TCO-NHS) do 1 ml roztworu przeciwciał huA33 o stężeniu 2 mg/ml (1,33 x ^10-8 mol huA33). Nie przekraczać 5% objętości DMF w roztworze.
5. Delikatnie wymieszaj roztwór, kilkakrotnie odwracając probówkę mikrowirówki.
6. Owiń probówkę mikrowirówki w nieprzezroczystą folię aluminiową.
7. Pozostawić roztwór do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
8. Po 1 godzinie w temperaturze pokojowej należy oczyścić otrzymany immunokoniugat za pomocą wstępnie zapakowanej kolumny odsalającej wykluczającej jednorazowy rozmiar. Najpierw przepłucz kolumnę wykluczającą rozmiar zgodnie z opisem dostawcy, aby usunąć wszelkie konserwanty obecne na kolumnie podczas przechowywania. Następnie dodać mieszaninę reakcyjną do kolumny wykluczającej rozmiar, przepłukać kolumnę 1,5 ml 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej, a następnie zebrać produkt, używając 2 ml 0,9% sterylnego soli fizjologicznej jako eluentu.
   UWAGA: Na tym etapie otrzymasz kompletny huA33-TCO w postaci 2 ml roztworu.
9. Zmierz stężenie wynikowego huA33-TCO na spektrofotometrze UV-Vis.
10. Jeśli pożądane jest wyższe stężenie, stęż roztwór huA33-TCO za pomocą odśrodkowej jednostki filtrującej z odcięciem 50 000 mas cząsteczkowych.
    UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że podczas gdy huA33 i wiele innych dobrze znanych przeciwciał (np. bewacyzumab, trastuzumab, cetuksymab i J591) są bardzo tolerancyjne na koncentrację, agregacja i wytrącanie mogą wystąpić po stężeniu w innych przypadkach. Badacze próbujący przeprowadzić tę procedurę z nowym przeciwciałem powinni zaufać literaturze lub własnej wiedzy na temat danego przeciwciała w odniesieniu do tego, czy należy stężać przeciwciało, czy nie.
11. Gotowy immunokoniugat huA33-TCO należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
    UWAGA: Jest to dopuszczalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy koniugat mAb-TCO powinien być stabilny przez co najmniej 3 miesiące w tych warunkach przechowywania.

3. ⁶⁴Cu Radioznakowanie Tz-Bn-NOTA

UWAGA: Ten etap protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych kroków – lub wykonaniem jakichkolwiek innych prac związanych z radioaktywnością – naukowcy powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.

1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór Tz-Bn-NOTA o stężeniu 0,5 mg/ml (723 μM).
2. Do probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml dodać 10 μl roztworu Tz-Bn-NOTA (5 μg) do 400 μl 0,2 M buforu NH₄OAc o pH 5,5_.
3. W celu prawidłowego prowadzenia notatek radiochemicznych, należy zmierzyć i zapisać ilość promieniotwórczości w próbce za pomocą kalibratora dawki przed i po wykonaniu kolejnych etapów poniższego protokołu (ppkt 3.4-3.8). Pomoże to w dokładnym określeniu wydajności radiochemicznej.
4. Dodać 2 000 μCi (74 MBq) ⁶⁴Cu do roztworu Tz-Bn-NOTA.
   UWAGA: Zazwyczaj [⁶⁴Cu]CuCl₂ jest dostarczany w małej objętości (< 30 μl) 0,1 N HCl, a zatem do reakcji znakowania radioaktywnego potrzebne są tylko małe objętości (< 10 μl) tego roztworu podstawowego. Jeśli potrzebne są większe objętości [⁶⁴Cu]CuCl₂ zapasu, reakcja znakowania radioaktywnego jest tolerancyjna na zwiększenie całkowitej objętości reakcji. Należy jednak dokładnie monitorować pH roztworu reakcyjnego znakowanego radioizotopem, aby upewnić się, że nie spadnie ono poniżej pH 4,0.
5. Pozostawić roztwór do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
6. Po 10 minutach inkubacji oczyścić produkt za pomocą chromatografii HPLC_C18 z odwróconymi fazami. Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od konfiguracji sprzętu HPLC w każdym laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.). Jednak, aby przedstawić przykład, jeśli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H₂O (oba z 0,1% TFA) do 95:5 MeCN/H₂O w ciągu 15 minut, czas retencji ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA powinien wynosić około 9,8 minuty, podczas gdy wolny, nieskompleksowany ⁶⁴Cu będzie eluował się z czołem rozpuszczalnika po około 2-4 minutach.
7. Za pomocą wyparki obrotowej usunąć eluent HPLC.
8. Ponownie rozpuścić produkt ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA w 0,9% sterylnej soli fizjologicznej.
   UWAGA: Biorąc pod uwagę fizyczny okres półtrwania wynoszący 12,7 godziny wynoszący ⁶⁴Cu, nie jest to akceptowalny punkt zatrzymania procedury. Przeprowadzić syntezę ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA bezpośrednio przed wstrzyknięciem radioligandu i natychmiast postępować zgodnie z krokiem 3.7 zgodnie z krokiem 4.5.

4. Obrazowanie PET in vivo

UWAGA: Podobnie jak w Sekcji 3 Protokołu, ten etap protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych czynności badacze powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.

1. U samicy atymicznej nagiej myszy należy wszczepić podskórnie 1 x 10⁶ komórek raka jelita grubego SW1222 i pozwolić im wyrosnąć w ksenoprzeszczep o średnicy 100-150 mm³ (9-12 dni po zaszczepieniu). ¹¹
2. Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu huA33-TCO z sekcji 2 protokołu do stężenia 0,5 mg/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
3. Wstrzyknąć 200 μl roztworu huA33-TCO (100 μg) do żyły ogonowej myszy zawierającej ksenoprzeszczep.
4. Odczekaj 24 godziny na akumulację huA33-TCO w guzie myszy.
5. Rozcieńczyć ^{radioligand 64}Cu-Tz-Bn-NOTA do stężenia 1,5 mCi/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
6. Wstrzyknąć 200 μl ^{roztworu radioliganda 64}Cu-Tz-Bn-NOTA (300 μCi; 11,1 MBq; 1,6 nmol ⁶⁴Cu-Tz-Bn-NOTA, zakładając aktywność właściwą 6,7 MBq/nmol) do żyły ogonowej myszy z ksenograftem.
7. W pożądanym punkcie czasowym obrazowania (np. 2, 6, 12 lub 24 godziny po wstrzyknięciu) znieczulij mysz 2% mieszaniną izofluranu i tlenu.
8. Umieść mysz na łóżku skanera PET dla małych zwierząt. Utrzymuj znieczulenie podczas skanowania za pomocą 1% mieszaniny izofluranu i tlenu. Przed umieszczeniem zwierzęcia na łóżku skanera sprawdź znieczulenie metodą szczypania palców u nóg i nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
9. Pozyskaj dane PET dla myszy za pomocą skanowania statycznego z co najmniej 20 milionami zbiegających się zdarzeń przy użyciu okna energetycznego 350-700 keV i okna czasowego koincydencji wynoszącego 6 nsec. Po zakończeniu akwizycji obrazu nie pozostawiaj myszy bez opieki i nie umieszczaj jej w klatce z innymi myszami, dopóki nie odzyska przytomności.

Wyniki

Pierwsze trzy etapy eksperymentu — synteza Tz-Bn-NOTA, konjugacja TCO z huA33 oraz radiomarkowanie konstruktu Tz-Bn-NOTA (Rysunki 3 i 4) — są wysoce niezawodne. W opisanym powyżej przypadku konstrukt Tz-Bn-NOTA został zsyntezowany z wysoką wydajnością i czystością. Przeciwciało huA33 zostało zmodyfikowane z uzyskaniem 4,2 ± 0,6 TCO/mAb, a Tz-Bn-NOTA został radiomarkowany ⁶⁴Cu, co pozwoliło uzyskać oczyszczony radioligand o czystości radiochemicznej >99%, wydajności skorygow...

Dyskusja

Główną zaletą tej wstępnie ukierunkowanej strategii obrazowania PET jest to, że jest ona w stanie nakreślić guzy za pomocą kontrastu obrazu między celem a tłem przy zaledwie ułamku dawki promieniowania tła wytwarzanej przez bezpośrednio znakowane przeciwciała. Na przykład w opisanym tutaj systemie obrazowania raka jelita grubego wykorzystano dane z eksperymentów z ostrą biodystrybucją do wykonania obliczeń dozymetrycznych dla strategii pretargetowania opartej na ⁶⁴Cu wraz z bezpośrednio znakowanymi ⁶⁴

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Sklep w temperaturze -80 stopni; C
Trans-cyklookten NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Przechowywać w temperaturze -80 & deg; C
p-NH2-Bn-NOTA	Makrocykle	B-601	Przechowywać w temperaturze -80 ° Z