Artykuł metodologiczny

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

DOI:

10.3791/52388

⸱

6 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, Western University, 2Biochemistry, Western University, 3Surgery, Western University, 4Oncology, Western University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na wysoki poziom heterogeniczności i mutacji nieodłącznie związanych z ludzkimi nowotworami, terapie pojedynczym środkiem lub schematy skojarzone, które są ukierunkowane na ten sam szlak, prawdopodobnie zakończą się niepowodzeniem. Należy położyć nacisk na hamowanie szlaków, które są odpowiedzialne za wewnętrzną i/lub adaptacyjną oporność na terapię. Aktywnym obszarem badań jest opracowywanie i testowanie inhibitorów naprawy DNA, które promują działanie i zapobiegają oporności na powszechnie stosowaną chemioterapię i radioterapię. Zastosowaliśmy nowatorski protokół do oceny skuteczności hamowania BRCA2 jako sposobu na uwrażliwienie komórek nowotworowych na cisplatynę, lek uszkadzający DNA. Metabolizm komórek nowotworowych (zakwaszenie i oddychanie) był monitorowany w czasie rzeczywistym przez okres 72 godzin, aby określić skuteczność leczenia minuta po minucie. W połączeniu przeprowadziliśmy ocenę częstości przerzutów za pomocą modelu wynaczynienia i inwazji błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka kurczaka (CAM). Protokół ten odnosi się do niektórych słabości powszechnie stosowanych metod in vitro i in vivo do oceny nowych schematów terapii przeciwnowotworowych. Może być stosowany jako dodatek do powszechnie stosowanych metod, takich jak testy proliferacji komórek, testy śmierci komórek i badania ksenoprzeszczepów mysich in vivo, w celu dokładniejszego rozróżnienia potencjalnych celów i czynników oraz wybrania tylko najbardziej obiecujących kandydatów do dalszego rozwoju.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabyta oporność na celowane i/lub cytotoksyczne leczenie raka jest poważnym problemem klinicznym, który może prowadzić do niepowodzenia leczenia, nawrotu choroby i zwiększonej śmiertelności pacjentów1. Biorąc pod uwagę wysoki poziom heterogeniczności w większości nowotworów, jest matematyczną pewnością, że guz o wystarczająco dużej liczbie komórek będzie zawierał podzbiór komórek opornych na pojedyncze lub skojarzone terapie ukierunkowane na szlaki molekularne, od których zależy przeżycie tych komórek2,3. Takie komórki nowotworowe mogą być pozytywnie wybrane podczas leczenia, co prowadzi do nawrotu choroby. Opracowanie nowych terapii, które jednocześnie są ukierunkowane na różne mechanizmy przeżycia komórek nowotworowych, zarówno przed, jak i po selekcji za pośrednictwem leczenia, ma zatem znaczenie kliniczne.

Wysoki poziom niestabilności genomu i mutacji w genomach nowotworów jest podstawową cechą, która odróżnia komórki rakowe od komórek gospodarza niebędących nowotworami4. W związku z tym użyteczną strategią zwiększania skuteczności chemioterapii uszkadzającej DNA i zapobiegania rozwojowi oporności jest aktywne hamowanie naprawy DNA w komórkach nowotworowych5. Jest to aktywna dziedzina badań, a w warunkach przedklinicznych badane są różne nowe cele naprawy DNA. Opracowano szereg małocząsteczkowych lub opartych na antysensowności inhibitorów tych celów, które są obecnie testowane6-8. Celem jest zidentyfikowanie najbardziej obiecujących kandydatów przedklinicznych oraz ocena ich bezpieczeństwa i skuteczności w badaniach klinicznych.

Wysokie koszty badań klinicznych i ryzyko niepowodzenia (z różnych powodów, w tym nieoptymalnej oceny przedklinicznej) są ogromnymi przeszkodami dla postępu w rozwoju nowych terapii9. Zastosowanie odpowiednich i rygorystycznych modeli przedklinicznych w celu odpowiedniej oceny nowych celów terapeutycznych i potencjalnych leków może zmniejszyć wysoki odsetek niepowodzeń w badaniach klinicznych10.

Niektóre powszechnie stosowane metody przedkliniczne do oceny skuteczności nowych schematów przeciwnowotworowych to: a) pomiar zdolności do redukcji proliferacji komórek nowotworowych in vitro (testy proliferacji komórek), b) wywołane terapią zmniejszenie zdolności komórek nowotworowych do tworzenia kolonii kultur tkankowych (testy tworzenia kolonii), c) wywołane terapią zmniejszenie aktywności metabolicznej komórek nowotworowych in vitro (konwersja barwnika redoks) , d) indukcja wywołana terapiąŚmierć komórek nowotworowych in vitro (apoptoza, martwica, autofagia, związana z mitozą i innymi)11 oraz e) indukowane terapią in vivo zmniejszenie wzrostu lub ablacja ksenoprzeszczepów ludzkich i mysich12-14.

Główną słabością wymienionych metod in vitro jest to, że żadna z nich nie zapewnia ciągłej oceny efektów potencjalnych terapii w czasie rzeczywistym. Dostarczają one informacji tylko w wybranych, szeroko oddalonych od siebie punktach czasowych w trakcie leczenia. Takie pomiary mają zmniejszoną zdolność do dokładnego odzwierciedlenia wielkości i czasu odpowiedzi komórek nowotworowych. Modele ksenoprzeszczepów u myszy in vivo są również ograniczone wysokimi kosztami, czasem do zakończenia oraz ryzykiem nieoptymalnego dawkowania i czasu leczenia (harmonogramu). Ponadto istnieją dowody na to, że modele ksenoprzeszczepów gryzoni są ograniczonymi predyktorami skuteczności klinicznej u ludzi, w porównaniu z oceną in vitro odpowiedzi pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych i ustalonych linii ludzkich komórek nowotworowych na potencjalne interwencje terapeutyczne15,16.

Opracowaliśmy nowatorski protokół łączony do oceny nowych kombinacji leków przed klinicznym podejściem, w sposób, który rozwiązuje słabości bardziej powszechnych procedur wymienionych powyżej. Zamiast testów proliferacji, tworzenia kolonii lub konwersji barwnika redoks, wykorzystaliśmy jednostkę pomiaru metabolizmu do analizy adhezji komórek, oddychania i zakwaszenia w czasie rzeczywistym podczas całego okresu leczenia17. Jednocześnie badaliśmy efekty skojarzonego leczenia in vivo, wykorzystując model inwazji i przerzutów błony kosmówkowo-omoczniowej zarodka kurczaka (CAM)18,19. Użyliśmy tych metod do oceny zdolności oligonukleotydu antysensownego (ASO) ukierunkowanego na BRCA2 do wzmocnienia skuteczności powszechnie stosowanego leku chemioterapeutycznego cisplatyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Poniższy protokół został zaprojektowany do użytku z przylegającymi komórkami. Konieczne są modyfikacje w celu zastosowania metody do nieprzylegających komórek hodowanych w zawiesinie. Eksperymenty CAM opisane w protokole są przeznaczone do stosowania z komórkami, które wyrażają marker fluorescencyjny (np. GFP, RFP itp.). Dziewięciodniowe zarodki kurcząt są wymagane w 2. dniu protokołu doświadczalnego do eksperymentów CAM.

1. Przygotowanie i transfekcja komórek nowotworowych za pomocą oligonukleotydów antysensownych (ASO)

  1. Odessać pożywkę z kolby T75 zawierającej interesujące nas komórki, przemyć 1XPBS i dodać 2 ml 0,25% trypsyny/EDTA. Dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdej kolby i przenieść komórki w roztworze do probówki o pojemności 50 ml. Policz komórki i dostosuj objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1,0x105 komórek na ml.
  2. Oznacz dwie grupy kolb T25: jedna grupa będzie zawierać osiem kolb, oznaczonych 1-8, i będzie używana do eksperymentu pomiaru metabolizmu w czasie rzeczywistym; a druga grupa będzie również zawierać 8 kolb i będzie używana do eksperymentu CAM z zarodkami kurzymi. Dodać 2 ml komórek w roztworze do każdej kolby i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5%CO2O/N).
  3. Następnego ranka (Dzień 0, Czas 0) oznacz trzy probówki o pojemności 5 ml w następujący sposób: kontrolny (nieukierunkowany ASO lub siRNA), "cel zainteresowania" (tj. ukierunkowany na ASO lub siRNA) i Lipofectamine 2000 (lub podobny odczynnik do transfekcji). Rozcieńczyć podstawowe roztwory ASO do odpowiedniego stężenia z pożywką wolną od surowicy w odpowiedniej probówce.
    1. Dodać wymaganą ilość odczynnika do transfekcji do odpowiedniej probówki i inkubować w podłożu bez surowicy przez 5 minut. Dodać roztwór odczynnika do transfekcji do probówek ASO i inkubować przez 20 minut.
  4. Dodać 250 μl kontrolnego roztworu odczynnika do transfekcji ASO do każdej z kolb 1-4 w każdej grupie i 250 μl roztworu odczynnika do transfekcji ASO "będącego przedmiotem zainteresowania" do każdej z kolb 5-8 w każdej grupie. Inkubować przez 4 godziny (37 oC, 5% CO2 ).
    1. Podczas inkubacji należy postępować zgodnie z czynnościami opisanymi w ppkt 2.1. Po inkubacji dodać 3 ml kompletnej pożywki do każdej kolby w grupie doświadczalnej CAM i powrócić do inkubatora O/N (37 oC, 5% CO2 ). Przeprowadzić eksperyment grupy metabolizmu zgodnie z opisem w sekcji 2.2. Przeprowadzić zestaw eksperymentów CAM zgodnie z opisem w sekcji 4.

2. Przygotowanie chipów biosensorów i zasiewanie komórek

  1. W sterylnym środowisku ostrożnie umyj sześć chipów biosensora 400 μl PBS. Sterylizuj wióry 400 μl 70% etanolu przez 20 minut. Przemyć trzykrotnie 400 μl PBS.
    1. Umieść chipsy w sterylnych naczyniach do hodowli tkankowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Umieść trzy frytki w naczyniu oznaczonym jako "kontrola", a trzy w naczyniu oznaczonym jako "cel zainteresowania".
  2. Oznaczyć dwie probówki o pojemności 50 ml jako "kontrolne" i "będące przedmiotem zainteresowania". Umyj komórki PBS i dodaj odpowiednią objętość 0,25% trypsyny/EDTA. Poczekaj, aż monowarstwa się odczepi i zbierz komórki z każdej kolby. Umieścić roztwór w odpowiedniej probówce.
    1. Policz komórki i dostosuj objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 6,0x105 komórek/ml. Odwirować i ponownie zawiesić komórki, jeśli początkowe stężenie jest zbyt niskie.
  3. Dodaj 250 μl roztworu komórkowego do każdego chipa biosensora w odpowiedniej grupie (w sumie 1,25x105 komórek na chip). Wykonuj to zadanie pojedynczo, aby zminimalizować ryzyko pomylenia chipów. Umieść sterylne naczynia zawierające wióry w komorze wilgotnościowej, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieść komorę wilgotnościową w inkubatorze O/N (37 oC, 5% CO2 ).
  4. Następnego ranka (Dzień 1) ostrożnie odessać pożywkę z każdego chipa i zastąpić ją 250 μl pożywki wzrostowej uzupełnionej 0,2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1x penicyliną i streptomycyną (P/S). Inkubować przez 4 godziny (37 oC, 5% CO2 ).

3. Przygotowanie systemu pomiaru metabolizmu i przygotowanie roztworu

  1. Podczas inkubacji należy przygotować wymagane roztwory leków i system pomiaru metabolizmu do nadchodzącego testu.
    UWAGA: System pomiaru metabolizmu składa się łącznie z sześciu modułów. Każdy moduł mieści jeden chip na eksperyment.
    1. Podzielić test na następujące grupy doświadczalne: po jednym chipie z każdej z grup "kontrolnych" i "docelowych zainteresowania", które otrzymują nośnik na czas trwania testu; dwa chipy z każdej grupy otrzymują leczenie farmakologiczne przez określony czas podczas testu, a następnie nośnik w okresie wymywania.
    2. W przypadku badań uczulających na leki, należy zmodyfikować długość, czas i stężenie leczenia farmakologicznego, aby dopasować je do konkretnego leku, o którym mowa.
      UWAGA: W przypadku cisplatyny następujące kroki zostały określone empirycznie na komórkach A549 i mogą się różnić w zależności od linii komórkowej. Wszystkie etapy należy wykonywać przy domyślnym natężeniu przepływu 4 μl/min.
      6 godzin podłoża wzrostowego + 0,2% FBS i 1x P/S
      24 godziny cisplatyny 6 μM w pożywce + 0,2% FBS 1x P/S
      24 godziny pożywki + 0,2% FBS i 1x P/S
      18 godzin podłoża wzrostowego + 0,2% FBS i 1x P/S
      4 godziny od 0,1% Triton-X
      UWAGA: Odchylenia od tych kroków będą wymagały obliczeń w celu określenia wymaganej objętości pożywki i roztworów leków w oparciu o pożądane natężenie przepływu i czas trwania eksperymentu. Poniższe sekcje są oparte na krokach opisanych powyżej.
  2. Oznaczyć i napełnić czternaście probówek o pojemności 50 ml 50 ml pożywki wzrostowej + 0,2% FBS i 1x P/S. Umieść sześć w jednym stojaku na probówki systemu pomiaru metabolizmu, sześć w innym, a pozostałe dwie w trzecim stojaku na probówki, który zawiera również probówki z cisplatyną. Uszczelnij pierwsze dwa stojaki membraną przepuszczającą powietrze, aby zapobiec parowaniu.
  3. Przygotować roztwór 6 μM cisplatyny (o odpowiedniej objętości) w pożywce + 0,2% FBS z 1x P/S. Dozować wymaganą objętość roztworu cisplatyny do czterech znakowanych probówek o pojemności 50 ml.
    1. Umieść probówki w pozostałych czterech szczelinach w trzecim stojaku na probówki do pomiaru metabolizmu. Upewnij się, że rurki są umieszczone w odpowiednich szczelinach, które odpowiadają żądanym biomodułom. Uszczelnij rurki membraną przepuszczającą powietrze.
  4. Przygotować i oznaczyć sześć probówek o pojemności 50 ml i napełnić je po 20 ml 0,1% roztworu Triton-X w podłożu. Roztwór Triton-X podda lizie wszystkie pozostałe ogniwa i zapewni wartość "zero" dla każdego chipa. Umieść probówki w czwartym stojaku na probówki do pomiaru metabolizmu i uszczelnij membraną przepuszczającą powietrze, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu.
  5. Załaduj chipy do biomodułów i rozpocznij eksperyment.

4. Eksperyment CAM Leczenie i wstrzykiwanie narkotyków

UWAGA: Kroki i procedura przygotowania zarodków kurczaka do eksperymentu CAM są opisane gdzieindziej 19

  1. Rozpocznij przetwarzanie eksperymentu CAM 48 godzin po transfekcji (dzień 2). Podzielić grupy "kontrolną" i "docelową wartość zainteresowania" na dwie kolby dla nośnika i dwie dla cisplatyny. Odessać pożywkę z kolb i uzupełnić 3 ml świeżej pożywki lub 6 μM cisplatyny. Inkubować przez 6 godzin (37 oC, 5% CO2 ).
  2. Odessać pożywkę, następnie umyć i trypsynizować komórki; zebrać trypsynizowane komórki w roztworze do czterech odpowiednio oznakowanych probówek o pojemności 15 ml.
    1. Odwirować i umyć komórki trzykrotnie PBS. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS i policzyć komórki.
    2. Dostosuj objętość tak, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1,0x106 komórek/ml. Przenieść roztwór komórek do oznakowanych probówek o pojemności 5 ml do wstrzykiwań i umieścić na lodzie. Przed wstrzyknięciem delikatnie odwrócić probówki, aby upewnić się, że komórki są dobrze wymieszane.
  3. Odłożyć na bok łącznie 24 zarodki kurczaka (w wieku 9 dni) do wstrzyknięcia (po 6 na grupę). Wstrzyknięcie należy wykonać za pomocą szklanej igły przymocowanej do elastycznej rurki połączonej ze strzykawką o pojemności 1 ml. Osoba wykonująca wstrzyknięcie powinna być zaślepiona na grupę leczoną.
    1. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wstrzyknąć 1,0x105 komórek w objętości 100 μl do krążenia żylnego CAM. Użyj powolnej, pulsacyjnej techniki, aby wstrzyknąć pełną objętość komórek. Delikatnie przetrzyj miejsce wstrzyknięcia miękką chusteczką, aby zatamować przepływ krwi i wchłonąć rozlany płyn. Po każdym wstrzyknięciu należy odpowiednio oznaczyć każdy pojemnik na zarodki.
  4. Potwierdź obecność i rozmieszczenie komórek fluorescencyjnych w układzie naczyniowym CAM po wstrzyknięciu, wizualizując je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zwróć uwagę na wszelkie zarodki, w których liczba komórek nowotworowych wydaje się niska lub dystrybucja jest słaba.
  5. Umieść zarodki kurczaka w komorze wilgotnościowej i przechowuj je w inkubatorze (37 °C, 60% wilgotności). Odczekaj 7-9 dni przed wyliczeniem ognisk przerzutowych.

5. Wyliczanie ognisk przerzutów

  1. Podczas 7-9 dniowego okresu inkubacji monitoruj zarodki i wyrzuć martwe. Upewnij się, że komora wilgotnościowa pozostaje wilgotna przez cały czas trwania inkubacji.
  2. Za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego przy 20-krotnym powiększeniu zeskanuj całą górną powierzchnię zarodka CAM w regularny, przypominający siatkę wzór.
  3. Policz liczbę ognisk przerzutowych w każdym polu widzenia, a następnie zlicz liczbę, aby uzyskać ostateczną sumę na zarodek. Takie postępowanie w przypadku sześciu zarodków w każdej grupie zapewni średnią liczbę ognisk przerzutów na leczenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki i rysunki zaadaptowane za zgodą opublikowanych prac22.

Hamowanie BRCA2 powoduje zmniejszenie oddychania w komórkach nowotworowych leczonych cisplatyną

Ludzkie komórki raka płuc A549 leczone ASO i cisplatyną ukierunkowane na BRCA2 wykazywały wczesny i nieodwracalny spadek oddychania w porównaniu z komórkami, które otrzymywały kontrolną ASO i samą cisplatynę; po 24 godzinach leczenia cisplatyną różnica w oddychaniu między komórkami BRCA2 ASO...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na nieodłączne koszty i ryzyko związane z badaniami klinicznymi istnieje potrzeba opracowania lepszej i bardziej rygorystycznej metodologii badań przedklinicznych w celu odpowiedniej oceny nowych schematów leczenia przeciwnowotworowego. Wszystkie obecnie powszechnie stosowane techniki wykazują słabości, które mogą ograniczać ich zdolność do rozróżniania między potencjalnie obiecującymi celami/środkami terapeutycznymi a tymi, które mogą być mniej skuteczne. Opracowaliśmy protokół oceny nowych podejść przeciwnow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była możliwa dzięki grantom dla JK z Ontario Centres of Excellence i Ontario Research Fund.

Chcielibyśmy podziękować Siddice Pardhan i Dr. Peterowi Fergusonowi za pomoc techniczną podczas kręcenia filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki A549ATCCCCL-185http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
Folia AeraSealCarl Roth GmbH
AMEMBisent Bioproducts210-011-QK
Antysensowne oligodeoksynukleotydyAveciaBRCA2 sekwencja docelowa: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (zasady 7241-7259 )
Axio Zoom V16 MikroskopCarl Zeisshttp://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
Bionas Biosensor ChipsBionas GmbH i Micronas GmbHBIS8001D
System Bionas Discovery 2500 Bionas GmbHhttp://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
CisplatinSigma Aldrich479306
Zapłodnione jaja kurzepozyskiwane lokalnie
Surowica bydlęca Gibco - Life Technologies
Lipofectamine 2000 Invitrogen - Technologie Życia 12566014http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html
PBSBioprodukty z żubra311-010-CL
Trypsyna (0,25%)/EDTABioprodukty z żubra325-043-CL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
  2. Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747(2013).
  3. Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78(2013).
  6. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
  7. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
  8. Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
  9. Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
  10. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  11. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
  12. Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
  13. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
  14. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
  15. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
  16. Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
  17. Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714(2011).
  18. Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
  19. Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
  20. Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
  21. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  22. Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhibicja BRCA2leczenie cisplatynanaliza metabolizmu kom rkowegoocena cz stotliwo ci przerzutowaniamodel b ony amnestyjnej CAM zarodka kurczakaoligonukleotydy antysensownechipy biosensorycznemonitorowanie w czasie rzeczywistymin vitro in vivo

Powiązane artykuły