Artykuł metodologiczny

Model szczura kaniulowanego kaniulowanego w krezkowym przewodzie chłonnym: zastosowanie do oceny transportu leków limfatycznych w jelitach

DOI:

10.3791/52389

⸱

6 marca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Drug Delivery, Disposition, and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University (Parkville Campus)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy technikę kannuacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów, która umożliwia ilościowe określenie transportu lipidów i leków przez układ limfatyczny po porodzie jelitowym. Technika ta może być dostosowana do oceny stężenia limfy krezkowej i/lub transportu płynu, komórek odpornościowych, peptydów, białek i cząsteczek lipofilowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ limfatyczny jelit odgrywa kluczową rolę w transporcie płynów, wchłanianiu lipidów i funkcjonowaniu układu odpornościowego. Limfa przepływa bezpośrednio z jelita cienkiego przez szereg naczyń limfatycznych i węzłów, które zbiegają się w górnym przewodzie limfatycznym krezki. Kaniulacja krezkowego przewodu chłonnego umożliwia zatem pobieranie limfy krezkowej wypływającej z jelita. Limfa krezkowa składa się z frakcji komórkowej komórek odpornościowych (99% limfocytów), frakcji wodnej (płyn, peptydy i białka, takie jak cytokiny i hormony jelitowe) oraz frakcji lipoprotein (lipidy, cząsteczki lipofilowe i apo-proteiny). Model kaniulacji krezkowego przewodu chłonnego może być zatem wykorzystany do pomiaru stężenia i szybkości transportu szeregu czynników z jelita przez układ limfatyczny. Można również określić zmiany tych czynników w odpowiedzi na różne wyzwania (np. diety, antygeny, leki) i choroby (np. nieswoiste zapalenie jelit, HIV, cukrzyca). Obszarem rosnącego zainteresowania jest rola transportu limfatycznego w wchłanianiu podawanych doustnie leków lipofilowych i proleków, które wiążą się ze szlakami wchłaniania lipidów w jelitach. W tym miejscu szczegółowo opisujemy model szczura kaniulowany w kaniulowanym przewodzie limfatycznym krezki, który umożliwia ocenę szybkości i zakresu transportu lipidów i leków przez układ limfatyczny przez kilka godzin po porodzie jelitowym. Metodę można łatwo dostosować do pomiaru innych parametrów w limfie. Przedstawiamy szczegółowe opisy trudności, które można napotkać przy ustalaniu tej złożonej metody chirurgicznej, a także reprezentatywne dane z nieudanych i udanych eksperymentów, aby dostarczyć instrukcji, jak potwierdzić sukces eksperymentu i zinterpretować uzyskane dane.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfa przepływa z jelita cienkiego w jednokierunkowym procesie, który zaczyna się od pojedynczych mleczanów, które znajdują się w każdym kosmku jelita cienkiego1. Mleczaki są stosunkowo przepuszczalne dla płynów, makrocząsteczek i komórek, a zatem tworzenie limfy rozpoczyna się wraz z wejściem tych czynników do mleczanu. Początkowa limfa w mlekach przepływa następnie z jelita przez sieć mikronaczyń limfatycznych, zbierając (aferentne) naczynia limfatyczne, szereg węzłów chłonnych krezkowych i ostatecznie naczynia limfatyczne zawęzłowe (odprowadzające). W obrębie węzłów limfa przechodzi przez szereg zatok szpikowych, w których zachodzi wymiana z komórkami odpornościowymi rezydującymi w węzłach, a także materiałem wchodzącym do węzła z krwi. Cała limfa wypływająca z jelita cienkiego ostatecznie zbiega się w odprowadzającym górnym przewodzie chłonnym krezkowym, a następnie w cisterna chyli. Cisterna chyli zbiera również limfę odprowadzającą tkanki obwodowe ogona, okolice jelitowe, wątrobowe i lędźwiowe oraz łączy się z przewodem limfatycznym klatki piersiowej wraz z limfą ze śródpiersia i czaszkowych części ciała. Przewód chłonny piersiowy opróżnia limfę bezpośrednio do układu żylnego na styku lewej żyły szyjnej wewnętrznej i podobojczykowej. Opisany tu protokół, który umożliwia pobieranie limfy bezpośrednio z górnego przewodu chłonnego krezkowego, ułatwia tym samym analizę różnych czynników przechodzących bezpośrednio z jelita do krążenia ogólnoustrojowego (ogólnego) poprzez jelitowy układ limfatyczny.

Główne funkcje fizjologiczne przypisane układowi limfatycznemu jelit to utrzymanie równowagi płynów, ułatwienie wchłaniania lipidów i cząsteczek lipofilowych oraz umożliwienie odpowiednich odpowiedzi immunologicznych1. Komórki nowotworowe i wirusy rozprzestrzeniają się również przez limfatyczne jelita2-4, a kluczowe zmiany zachodzą w obrębie układu limfatycznego w kilku patologiach zapalnych i metabolicznych5-7. Kaniulacja krezkowego przewodu chłonnego w celu zebrania limfy w obrębie krezki umożliwia analizę przepływu płynu luzem przez limfy jelitowe, a także ilościowe określenie stężenia i szybkości transportu różnych komórek i cząsteczek. Można również ocenić zmiany w stężeniu lub pasażu tych czynników w odpowiedzi na różne wyzwania (np. diety, antygeny, leki) oraz w modelach chorobowych (np. zapalenie jelita grubego, HIV, cukrzyca). Chociaż niemożliwe jest dokładne opisanie każdego składnika limfatycznego, który może być tutaj analizowany i porównywany, limfa krezkowa w uproszczeniu składa się z fazy wodnej, lipidowej i komórkowej. Składniki będące przedmiotem zainteresowania w fazie wodnej obejmują peptydy i białka, takie jak antygeny lub tolerogeny8, przekaźniki immunologiczne, takie jak cytokiny i mediatory komórek tucznych9 oraz mediatory metaboliczne, takie jak inkretyny10. Frakcja komórkowa limfy krezkowej zawęzłowej składa się prawie w całości (ponad 99%) z limfocytów11. Różne komórki odpornościowe (komórki dendrytyczne, komórki tuczne itp.) dostają się do węzłowej limfy krezkowej, ale pozostają w węźle12. Jeśli interesujące są komórki w limfie doprowadzającej, możliwe jest pobranie tych komórek poprzez usunięcie węzłów chłonnych krezki na kilka dni przed kaniulacją węzła chłonnego krezki12. W ten sposób doprowadzające i odprowadzające przewody limfatyczne są bezpośrednio połączone, a komórki limfatyczne w limfie doprowadzającej przechodzą bezpośrednio do krezkowego przewodu chłonnego. W ten sposób można zbadać tranzyt i fenotyp różnych komórek odpornościowych przechodzących przez limfatyczne jelita. Być może najczęstszym powodem pobierania limfy krezkowej do tej pory jest jednak badanie przetwarzania jelitowego, wchłaniania i transportu lipidów pokarmowych i cząsteczek lipofilowych10.

Po spożyciu, lipidy dietetyczne są trawione (na przykład z trójglicerydów do kwasów tłuszczowych i monoglicerydów, fosfolipidów do kwasów tłuszczowych i lizofosfolipidów, a ester cholesterolu do kwasów tłuszczowych i cholesterolu, itd.) i rozpraszane w świetle jelita do małych struktur miceli i pęcherzyków poprzez dodanie amfifilów z żółci (fosfolipidy, cholesterol i sole żółciowe) oraz działanie enzymów trzustkowych10,13. Stąd są wchłaniane do enterocytów. Część wchłoniętych składników jest ponownie estryfikowana do wytworzenia trójglicerydów, fosfolipidów i estrów cholesterolu w komórkach absorpcyjnych (enterocytach). Te ponownie estryfikowane lipidy są składane z kombinacji egzogennie spożytych składników lipidowych i endogennych składników lipidowych z wydzielanej żółci, puli lipidów błony śluzowej lub dopływu krwi jelitowej13. Stąd estryfikowane lipidy są albo przechowywane w enterocytach, albo łączone w lipoproteiny jelitowe (chylomikrony, lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDL)) wraz z różnymi apoproteinami i innymi cząsteczkami lipofilowymi (np. witaminami)10,13. Po wyjściu z enterocytów lipoproteiny są specyficznie transportowane z jelita do krążenia ogólnoustrojowego przez krezkowy układ limfatyczny, ponieważ mleczan jelitowy jest bardziej przepuszczalny dla ich wejścia niż naczynia włosowate krwi jelitowej. Część wchłoniętych składników lipidowych jest również transportowana z jelita do krążenia ogólnoustrojowego przez naczynia włosowate krwi i żyłę wrotną w postaci pojedynczych, niezwiązanych z lipoproteinami cząsteczek14 . Ogólnie rzecz biorąc, droga transportu żyły wrotnej jest tylko znaczącym graczem w wchłanianiu lipidów o krótkiej i średniej długości łańcucha.

Gromadzenie limfy krezkowej umożliwia zatem ocenę transportu lipoprotein i związanych z nimi składników (lipidów, cząsteczek lipofilowych, białek apo) z jelita. Lipoproteiny można określić ilościowo i scharakteryzować z tą zaletą, że lipoproteiny limfatyczne krezki są na ogół w stanie początkowym, ponieważ nie zostały w znacznym stopniu zmodyfikowane przez enzymy ogólnoustrojowe, takie jak lipazalipoproteinowa 15. Podczas gdy model szczura kaniulowany limfą krezkową był być może historycznie najszerzej opisany do analizy transportu lipidów / lipoprotein z jelita, obszarem rosnącego zainteresowania jest rola limfów w transporcie leków lipofilowych, proleków i innych ksenobiotyków13,16, na czym skupia się opisywany tutaj model. Leki lipofilowe (zazwyczaj te z logarytmem P > 5 i rozpuszczalnością w długołańcuchowych trójglicerydach > 50 mg/g, chociaż wyjątki są oczywiste)17,18, proleki19 i inne ksenobiotyki13,16 mogą uzyskać dostęp do limfy jelitowej biernie lub aktywnie integrując się ze szlakami transportu lipoprotein jelitowych19.

Technika kaniulacji krezkowej limfy szczura ma więc wiele zastosowań. Bollman i wsp. Po raz pierwszy opisał technikę kaniulacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów w 1948roku. Od tego czasu opisano szereg wariacji na temat tego modelu. Na przykład pobranie może nastąpić, gdy szczur jest znieczulony różnymi środkami znieczulającymi21,22 lub w stanie przytomności, gdy jest skrępowany15 lub swobodnie się porusza23,24. Szczurom można podawać różne roztwory nawadniające i inne substancje, takie jak lipidy i preparaty leków, w różnym tempie do żołądka, jelita lub pozajelitowo (zwykle 0-5 ml/godz.)25. W niektórych badaniach kaniulowany jest klatka piersiowa, a nie krezkowy przewód chłonny, aby oszacować transport z jelita przez układ limfatyczny, chociaż może to zawyżać tranzyt z jelita cienkiego, w zależności od czynnika zainteresowania, ponieważ przewód limfatyczny klatki piersiowej otrzymuje również limfę z innych regionów22,26. Modele kaniulacji limfatycznej opisano również u kilku innych gatunków, w tym myszy15,27, świnek miniaturowych12, owiec28,29, świń30 i psów31. Jednak model szczura jest najczęściej i najczęściej cytowany. Szczegółowe protokoły kaniulacji krezkowego przewodu chłonnego, a następnie pobrania limfy u przytomnych25 lub znieczulonych22 szczurów i myszy15,27 zostały opublikowane wcześniej, a zainteresowany czytelnik jest kierowany do tych protokołów. Ten protokół jest pierwszym, który demonstruje tę technikę w formie wizualizacji.

Model szczura z kaniulacją limfatyczną ma przewagę nad większymi modelami zwierzęcymi pod względem kosztów, łatwości operacji i względów etycznych. W porównaniu z modelem mysim, operacja kaniulacji krezki limfatycznej jest również łatwiejsza u szczurów, chociaż model mysi umożliwia bardziej szczegółowe badania na zwierzętach transgenicznych27. Niemniej jednak istnieją pewne ograniczenia modelu szczurzego, szczególnie te związane z różnicami w fizjologii, które ograniczają ekstrapolację na inne sytuacje przedkliniczne i kliniczne. Na przykład u szczurów przepływ żółci jest stały i niezależny od przyjmowania pokarmu, podczas gdy u wyższych gatunków pokarm lub lipidy stymulują przepływ żółci32. Stwarza to wyzwania związane z uzyskaniem reprezentatywnych środowisk przed- i poposiłkowych u szczurów, które odzwierciedlają to, co obserwuje się u większych gatunków i ludzi. W przypadku badań nad dostarczaniem leków, większe gatunki mogą być również preferowane przy ocenie transportu limfatycznego po podaniu realistycznych postaci dawkowania u ludzi25. W niedawnym badaniu stwierdzono, że tempo transportu lipidów w limfie krezkowej jest porównywalne u różnych gatunków (mysz, szczur, pies) po podaniu równoważnej masy i rodzaju lipidu, co daje pewną pewność w ekstrapolacji danych dotyczących transportu lipidów między gatunkami27. Jednak transport modelowego leku lipofilowego, halofantryny, plasował się w kolejności wielkości zwierzęcia (tj. pies > szczur > mysz). W związku z tym może być wymagany czynnik skalujący w celu ekstrapolacji danych dotyczących transportu limfatycznego leków od szczurów do innych gatunków.

Ograniczeniem modeli kaniulacji limfy jest to, że pasywne pobieranie limfy bezpośrednio z przewodu limfatycznego może modyfikować przepływ i transport limfy, ponieważ naczynia limfatyczne działają przeciwko gradientowi ciśnienia, który zmienia się po kaniulacji naczynia33. Model kaniulacji limfatycznej może być również trudny do ustalenia w laboratoriach, które nie są zaznajomione z tą techniką. W ten sposób opisano alternatywne modele. Na przykład pośrednio badano transport czynników przez jelitowy układ limfatyczny, takich jak lipoproteiny i cząsteczki lipofilowe, poprzez pobieranie krwi. Jeden z takich modeli polega na porównaniu stężeń lipidów i/lub leków we krwi po podaniu doustnym w obecności i braku inhibitorów (np. kolchicyny, Pluronu L81, cykloheksymidu) produkcji lipoprotein jelitowych, które blokują transport limfatyczny34. Zaletą modeli, które określają ilościowo transport limfatyczny pośrednio poprzez pobieranie próbek krwi, jest to, że umożliwiają one pewną ocenę transportu limfatycznego u ludzi, ponieważ nie jest wymagana chirurgia inwazyjna35. Jednak inhibitory transportu limfatycznego nie są specyficzne, a czynniki transportowane przez limfy są rozcieńczane i modyfikowane w krążeniu ogólnoustrojowym, co komplikuje takie oceny. Opisano również alternatywy in vitro. Na przykład hodowle komórek caco-2 lub izolowanych enterocytów wykorzystano do bardziej szczegółowego zbadania wydzielania jelitowego cząsteczek, które dostają się do układu limfatycznego36-38. Niedawno opisano również zaawansowany model in vitro, który jest bardziej reprezentatywny dla mikrośrodowiska jelitowegoczłowieka39. W tym modelu warstwa komórek śródbłonka limfatycznego jest współhodowana z komórkami Caco-2, co umożliwia bardziej szczegółową analizę przenoszenia substancji z jelita do układu limfatycznego. Jednak w systemach komórkowych in vitro brakuje przepływu wymiany i transferu, tj. połączenia ze światłem jelita i leżącym pod nim zaopatrzeniem w krew i naczynia limfatyczne. W alternatywnym podejściu, Kassis i in. stworzyli dwukanałowy (szybkie wideo w jasnym polu i fluorescencja) system obrazowania in situ, który umożliwia ilościowe porównania między skurczem naczyń, przepływem limfy i fluorescencyjnymi stężeniami lipidów w krezkowych naczyniach limfatycznych33. Przewagą tego modelu nad wyżej wymienionymi systemami in vitro jest to, że umożliwia on dokładne śledzenie przejścia komórek odpornościowych przez układ limfatyczny. Bezwzględne pomiary masowego transportu lipidów (lub leków) nie są jednak jeszcze ustalone za pomocą metod obrazowania. Opublikowano również podejścia in vitro i in silico do specyficznego przewidywania zakresu lipofilowego transportu leków przez limfę jelitową40-42. Na przykład stwierdzono, że powinowactwo ex vivo kilku związków do chylomikronów osocza dość dobrze koreluje z ich transportem limfatycznym in vivo41. Następnie ta sama grupa stworzyła model in silico, aby przewidzieć powinowactwo leków do chylomikronów w oparciu o wiele właściwości fizykochemicznych40. Holm i wsp. ustanowili również stosunkowo złożony model in silico, aby bezpośrednio przewidzieć transport limfatyczny związków lipofilowych na podstawie deskryptorów molekularnych42. Modele te mogą stanowić użyteczne podejście do przewidywania zakresu transportu limfatycznego nieznanych leków. Walidacja modeli z szeroką gamą leków i w różnych laboratoriach będzie jednak wymagana w celu potwierdzenia ich dokładności i odtwarzalności.

Kaniulacja krezkowego przewodu chłonnego pozostaje zatem jedynym sposobem bezpośredniego badania zawartości limfy drenującej jelito cienkie i szybkości tranzytu złożonego zestawu czynników (komórek, białek, peptydów, lipidów, leków) w limfie w sytuacji in vivo. W niniejszym artykule opisano protokół kaniulacji krezkowego przewodu chłonnego i tętnicy szyjnej, który umożliwia pobranie limfy krezkowej i krwi ogólnoustrojowej od znieczulonych szczurów. Reprezentatywne dane pokazują, w jaki sposób model może być wykorzystany do badania transportu lipidów i leków z jelita przez krezkowy układ limfatyczny. Po tym następuje omówienie trudności, które można napotkać podczas ustanawiania modelu, oraz przewodnik rozwiązywania problemów. Po ustaleniu model staje się potężnym narzędziem do badania transportu limfatycznego w jelitach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tym manuskrypcie zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyki zwierząt i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Australijskiej i Nowozelandzkiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami w Badaniach i Nauczaniu. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury na zwierzętach upewnij się, że uzyskano odpowiednie pozwolenie za pośrednictwem lokalnej instytucji/organizacji. Podobnie jak w przypadku wszystkich operacji na zwierzętach, należy upewnić się, że operacja jest wykonywana przez odpowiednio przeszkolonych operatorów, w warunkach aseptycznych, a środki znieczulające, przeciwbólowe i antybiotyki są podawane, gdy jest to wymagane dla zapewnienia etycznego i pomyślnego wyniku.

1. Przygotowania dzień przed zabiegiem chirurgicznym

  1. W razie potrzeby pościć szczura w noc przed operacją. Upewnij się, że szczur ma swobodny dostęp do wody.
  2. Przygotować roztwory, które mają być podane szczurowi.
    1. Przygotuj roztwór nawadniający, taki jak sterylna sól fizjologiczna lub roztwór Ringera.
    2. Przygotuj roztwory znieczulające zgodnie z wymaganiami. Środek znieczulający stosowany w opisywanych tu eksperymentach składał się z "Koktajlu 1" przygotowanego przez połączenie 1,9 ml ketaminy 100 mg/ml, 0,5 ml ksylazyny 100 mg/ml, 0,2 ml acepromazyny 10 mg/ml i 2,5 ml soli fizjologicznej oraz "Koktajlu 2" składającego się z 1 ml ketaminy 100 mg/ml i 0,1 ml acepromazyny 10 mg/ml. UWAGA: Wziewny izofluran lub sewofluran może być preferowany, ponieważ może zapewnić chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia przez dłuższy czas.
    3. Opcjonalnie przygotuj preparat zawierający lek w np. emulsji lipidowej. Należy przeprowadzić odpowiednie badania stabilności, aby zapewnić stabilność preparatu w okresie przechowywania i podawania.
      UWAGA: Dokładny charakter preparatu i leku, który ma być podawany, będzie się różnić w zależności od badania, ponieważ celem badań nad transportem limfatycznym leków jest najczęściej ocena efektywności transportu limfatycznego leków w funkcji preparatu i podawanego leku.
      1. Preparat użyty w reprezentatywnych doświadczeniach na rysunku 4 i 5 jest przygotowany w sposób opisany poprzednio43. Krótko dodać 14C kwasu oleinowego (2-5 μCi) i halofantrynę (200 μg) do 40 mg kwasu oleinowego przed dyspersją w 5,6 ml fazy wodnej składającej się z 5 mM taurocholanu sodu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 6,9).
      2. W przypadku preparatów zawierających 2-monooleinę należy dodać 7,1 mg 2-monooleiny wraz z innymi składnikami do fazy wodnej w tym samym czasie, co fazę kwasu oleinowego zawierającą halofantrynę. Preparaty zawierające 2-monooleinę należy przygotować bezpośrednio przed podaniem szczurowi, ponieważ 2-monooleina jest stosunkowo niestabilna i izomeryzuje się do 1-monooleiny.
      3. Następnie emulgować preparaty za pomocą ultradźwięków przez 2 minuty w temperaturze RT.
        UWAGA: Jak opisano poprzednio43, należy monitorować stabilność preparatów poprzez i) oględziny emulsji w świetle spolaryzowanym w celu upewnienia się, że emulsja nie jest rozdzielana fazowo, ii) analizę wielkości cząstek bezpośrednio po przygotowaniu i po dozowaniu z wykorzystaniem dynamicznego rozpraszania światła w celu wskazania wszelkich zmian faz i/lub separacji, oraz iii) analiza stężeń halofantryny przy użyciu zwalidowanego testu HPLC.
  3. Przygotować roztwór przeciwzakrzepowy zawierający 10 mg/ml EDTA w sterylnej wodzie lub 10 j.m./ml heparyny w soli fizjologicznej w celu przepłukania kaniuli limfatycznej. Przygotuj również roztwór przeciwzakrzepowy zawierający 2,5 - 10 j.m./ml heparyny w soli fizjologicznej, aby przepłukać kaniulę tętnicy szyjnej.
  4. Przygotuj kaniule polietylenowe do wprowadzenia do krezkowego przewodu chłonnego (średnica zewnętrzna 0,8 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm), tętnicy szyjnej (średnica zewnętrzna 0,96 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm lub średnica zewnętrzna 0,8 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm) i dwunastnicy (średnica zewnętrzna 0,96 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm)
    1. Przyciąć kaniule na wymaganą długość (zwykle 25 - 30 cm dla tętnicy szyjnej i kaniuli dwunastnicy oraz 10 - 15 cm dla kaniuli limfatycznej) i umieścić skos na końcu kaniuli za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego (patrz ryc. 1).
      UWAGA: Zwiększa to łatwość wprowadzania kaniuli i zmniejsza częstość występowania zablokowania kaniuli po jej włożeniu.
    2. Umieść punkt zaczepienia w kształcie litery J w kaniuli śróddwunastniczej, zapętlając niewielką część kaniuli z powrotem na sobie, podgrzewając ją zapalniczką lub gorącą płytą, a następnie przycinając na wymiar (patrz rysunek 1).
  5. Podłączyć kaniulę limfatyczną do igły i strzykawki o strzykawce 25 G zawierającej roztwór przeciwzakrzepowy (przygotowany w kroku 1.3). Napełnij kaniulę limfatyczną roztworem przeciwzakrzepowym i pozostaw roztwór w kaniuli O/N, aby zmniejszyć częstość tworzenia się skrzepów w kaniuli limfatycznej podczas pobierania limfy.
  6. Przygotuj probówki do pobrania próbki limfy i krwi. Wstępnie zważyć probówki do pobierania limfy, oznaczyć probówki do pobierania próbek limfy i krwi i dodać roztwór przeciwzakrzepowy. Dodać wystarczającą ilość roztworu antykoagulantu, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/ml EDTA w sterylnej wodzie lub 10 - 20 j.m./ml heparyny w pobranej limfie lub krwi.

2. Przygotowania bezpośrednio przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego

  1. Sprawdź wszystkie kaniule, przepłukując je sterylnym roztworem soli fizjologicznej lub roztworem antyzakrzepowym, aby upewnić się, że są opatentowane.
  2. Przygotuj szczura do zabiegu chirurgicznego.
    UWAGA: Krezkowy przewód limfatyczny jest bardziej widoczny u szczurów, które zjadły lub otrzymały dawkę oleju, ponieważ limfa krezkowa staje się mleczna i nieprzezroczysta przy wyższym obciążeniu lipidami. Niektórzy operatorzy, szczególnie ci, którzy dopiero rozpoczynają zabieg, uważają, że łatwiej jest kaniulować krezkowy przewód chłonny, gdy szczurom wstępnie podaje się olej (około 0,1 - 1 ml), taki jak oliwa z oliwek lub olej sojowy na 0,5 - 2 godziny przed rozpoczęciem operacji. Jednak olej przed dawkowaniem wpływa na transport limfatyczny lipidów, leków lipofilowych i innych czynników w limfie, tak że wstępne dawkowanie oleju może nie być idealne w zależności od celu eksperymentu.
    1. Znieczulaj szczura przez cały okres operacji i pobierania próbek.
      1. Na przykład, należy rozpocząć znieczulenie poprzez podskórne wstrzyknięcie 1,5 ml/kg Cocktail I (z kroku 1.2.2) do fałdu skórnego z tyłu szyi szczura za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml dołączonej do igły 25 G. Utrzymać znieczulenie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe 0,44 ml/kg Cocktail 2 (od kroku 1.2.2) mniej więcej co godzinę, w zależności od potrzeb, za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml dołączonej do igły 25 G.
      2. Przed przystąpieniem do zabiegu należy upewnić się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca, obserwując częstość oddechów, ruchy wąsów, napięcie mięśniowe i reakcje na bodźce, takie jak szczypanie stopy. W razie potrzeby podać dodatkowe znieczulenie.
    2. Ogol sierść z obszarów chirurgicznych, które obejmują prawą stronę brzucha w przypadku kaniulacji limfy i dwunastnicy oraz szyję i lewy obojczyk w przypadku kaniulacji tętnicy szyjnej.
    3. Oczyść obszary operacyjne aseptycznie za pomocą roztworu powidyny i jodu lub roztworu chlorheksydyny i peelingu z 70% etanolem. Powtórz to 3 razy dla każdego regionu, kończąc końcowym oczyszczaniem za pomocą 70% etanolu.
  3. Umieścić zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej na czystym prześcieradle nad podgrzewaną podkładką chirurgiczną (37 °C).

3. Kaniulacja krezkowego przewodu chłonnego

  1. Ułóż zwierzę prawą stroną skierowaną w stronę operatora. W razie potrzeby wykonaj operację z pomocą mikroskopu operacyjnego lub bez niej.
  2. Otwórz górną warstwę ściany mięśnia brzucha z prostym 4-centymetrowym nacięciem rozciągającym się od linii środkowej (wyrostek ksyloidalny) do prawego boku około 2 cm poniżej klatki piersiowej (brzeg żebrowy) za pomocą sterylnego ostrza skalpela (patrz ryc. 2B).
  3. Otwórz pozostałe warstwy ściany mięśni brzucha od 4 - 5 mm bocznie do linii środkowej do prawej flanki za pomocą małej pary nożyczek chirurgicznych (patrz ryc. 2B).
  4. Cofnij jelito cienkie pod lewą ścianę mięśnia brzucha i utrzymuj je na miejscu za pomocą 2-3 kawałków sterylnej gazy nasączonej zwykłą solą fizjologiczną.
  5. Umieść szczura nad plastikową strzykawką o pojemności 10 ml umieszczoną poziomo pod grzbietem szczura na poziomie prawej nerki, aby ułatwić wizualizację krezkowego przewodu chłonnego.
  6. Zlokalizuj górny kanał chłonny krezkowy: naczynie o średnicy około 0,5 - 1 mm, które jest prostopadłe do prawej nerki i bezpośrednio rostralne i równoległe do tętnicy krezkowej (pulsujące ciemnoczerwone naczynie krwionośne; patrz ryc. 2C).
    UWAGA: U szczurów bez postu lub szczurów, którym podawano olej, naczynie jest białe, nieprzezroczyste i łatwiejsze do uwidocznienia niż u szczurów na czczo, u których jest dość przezroczyste.
  7. Sprawdź obszar bezpośrednio ogonowy do dużego górnego przewodu chłonnego krezki i tętnicy krezkowej, aby ustalić, czy obecny jest drugi, mniejszy dodatkowy przewód limfatyczny. Jeśli występuje, zablokuj przepływ limfy przez przewód, przecinając przewód i zamykając go klejem superglue lub zawiązując szew wokół kanału, aby upewnić się, że cała objętość limfy wypływającej z jelita jest pobierana z górnego przewodu chłonnego krezkowego.
  8. Przełóż parę prostych kleszczy przez łożysko tłuszczowe okołonerkowe na dolnym brzegu prawej nerki i przez warstwy tkanki łącznej bezpośrednio poniżej żyły głównej, w kierunku równoległym do górnego kanału chłonnego krezki.
  9. Za pomocą końcówki kleszczy chwyć kaniulę limfatyczną i przeciągnij ją przez złoże tłuszczowe wokół nerek, tak aby jednym końcem bezpośrednio przylegało do krezkowego przewodu chłonnego, a drugim było wysunięte na zewnątrz od zwierzęcia na poziomie prawej nerki.
  10. Odizoluj krezkowy przewód chłonny od leżących nad nim warstw tkanki łącznej i tłuszczowej przez rozwarstwienie. Uważaj, aby nie przekłuć ani nie uszkodzić przewodu limfatycznego.
  11. Po odizolowaniu przewodu limfatycznego wykonaj mały otwór w przewodzie limfatycznym za pomocą mikronożyczek, ostrej końcówki kleszczyków jubilerskich lub igły 25 G. Uważaj, aby nie przeciąć całkowicie naczynia.
  12. Upewnij się, że kaniula limfatyczna jest całkowicie wypełniona roztworem antykoagulacyjnym (za pomocą strzykawki i igły 25 G) bez szczelin powietrznych. Wprowadzić kaniulę limfatyczną około 2 - 4 mm do wnętrza krezki limfatycznej przez mały otwór za pomocą małej pary kleszczy.
  13. Obserwuj kaniulę limfatyczną przez kilka minut. Obserwuj stopniowy przepływ limfy jelitowej od swobodnie zbierającego końca kaniuli, jeśli kaniulacja się powiedzie. Jeśli kaniulacja się nie powiedzie, powtórz kroki 3.8 - 3.12.
  14. Jeśli kaniulacja się powiedzie, zabezpiecz kaniulę, umieszczając niewielką kroplę kleju weterynaryjnego nad otworem wejściowym do przewodu limfatycznego. Należy uważać, aby nie zatkać naczynia poprzez nałożenie nadmiaru kleju weterynaryjnego.
  15. Czekając, aż klej weterynaryjny stwardnieje, obserwuj przepływ limfy przez kilka minut, aby upewnić się, że procedura kaniulacji się powiodła. Po upewnieniu się o powodzeniu kaniulacji, ostrożnie usuń kawałki gazy, które zostały umieszczone w jamie brzusznej i umieść jelito cienkie w pierwotnej pozycji.
  16. Umieść probówkę do pobierania limfy zawierającą antykoagulant (patrz krok 1.6) na końcu kaniuli, aby zebrać swobodnie płynącą limfę.
  17. Następnie kanuuluj dwunastnicę w celu infuzji roztworów nawadniających i/lub preparatów.

4. Kaniulacja dwunastnicy

  1. Podłączyć kaniulę dwunastnicy do strzykawki (np. 10 ml) wypełnionej roztworem nawadniającym.
  2. Zidentyfikuj dwunastnicę jako jasnoróżowy (z większą liczbą naczyń krwionośnych) odcinek jelita cienkiego, który po delikatnym pociągnięciu w dół odsłania żołądek.
  3. Wykonać mały otwór do nakłucia w dwunastnicy około 2 cm poniżej połączenia żołądka i dwunastnicy (odźwiernika) za pomocą sterylnej igły 23 G.
  4. Przełóż haczykowaty koniec kaniuli dwunastnicy w kształcie litery J przez otwór do nakłucia. Zabezpiecz na miejscu kroplą kleju cyjanoakrylowego.
  5. Rozpocznij nawadnianie szczura, podłączając kaniulę do strzykawki nawadniającej załadowanej do pompy infuzyjnej. Według literatury tempo nawadniania waha się od 0,5 - 3 ml/h15,25.
  6. Po zakończeniu kaniulacji limfy i dwunastnicy należy zamknąć nacięcie w ścianie mięśnia brzucha szwami. Następnie zamknij nacięcie skóry, nakładając kilka kropel kleju tkankowego (cyjanoakrylanu) wzdłuż boku nacięcia i ściskając skórę po obu stronach nacięcia.

5. Kaniulacja tętnicy szyjnej

Kanituacja tętnicy szyjnej może być wykonana przed lub po kaniulacji krezkowego przewodu chłonnego. Niektórzy operatorzy wolą kaniulować tętnicę szyjną przed kaniulacją przewodu limfatycznego, aby zmniejszyć potencjalne przemieszczenie kaniuli limfatycznej podczas przenoszenia zwierzęcia.

  1. Umieść znak na kaniuli tętnicy szyjnej w odległości 2.5 cm od końcówki skosu, aby zidentyfikować część rurki, którą należy wprowadzić do tętnicy. Podłącz drugi koniec kaniuli (tj. bez skosu) do igły 23 lub 25 G przymocowanej do strzykawki wypełnionej roztworem antykoagulantu i napełnij kaniulę roztworem antykoagulantu, upewniając się, że nie ma szczelin powietrznych.
  2. Aby ułatwić kaniulację, umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej grzbietowej z wyciągniętą szyją i głową skierowaną w stronę operatora. Należy pamiętać, że niektórzy operatorzy wolą wykonywać tę technikę z ogonem szczura skierowanym w stronę operatora.
  3. Umieść podłużne nacięcie o długości 1 - 1,5 cm przez warstwę skóry powyżej lewej strony tchawicy w płaszczyźnie strzałkowej.
  4. Wypreparuj podskórną tkankę łączną za pomocą kleszczy z końcówką, aby odsłonić leżące pod spodem sparowane mięśnie szyi.
  5. Wycofaj mięśnie szyi, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną (znajdującą się ~1 cm poniżej powierzchni skóry i pulsującą). Oczyść leżącą tkankę łączną z tętnicy przez rozwarstwienie.
  6. Ostrożnie odizoluj ~1 cm odcinek tętnicy za pomocą kleszczy tkankowych, uważając, aby nie uszkodzić sąsiedniego toru nerwu błędnego. Wykonaj to, otwierając i zamykając kleszcze z końcówką pionowo po obu stronach tętnicy, aby uwolnić ją od otaczającej tkanki i nerwu błędnego.
  7. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką nawlecz dwa jedwabne szwy pod tętnicę szyjną i umieść je na każdym końcu izolowanego odcinka tętnicy. Zawiąż szew najbliżej operatora i najdalej od serca i obojczyka szczura (ryc. 3A).
  8. Zablokuj przepływ krwi przez tętnicę, umieszczając parę prostych kleszczyków z cienką końcówką pod tętnicą (ryc. 3B).
  9. Za pomocą nożyczek do tęczówki z cienką końcówką umieść małe nacięcie na górnej powierzchni tętnicy (około 1/3 drogi w dół od górnej części izolowanego obszaru). Przepłukać rozlaną krew na powierzchni tętnicy heparynizowaną solą fizjologiczną i delikatnie przetrzeć bawełnianymi patyczkami.
  10. Włóż końcówkę kaniuli do tętnicy za pomocą pary zakrzywionych kleszczyków z końcówką. Po włożeniu usuń proste kleszcze z cienką końcówką blokujące przepływ krwi i wsuń kaniulę o 2,5 cm do tętnicy za pomocą dwóch par kleszczy, jednej do przytrzymania kaniuli wewnątrz tętnicy, aby zapobiec wyciekowi krwi z powrotem, a drugiej, aby wprowadzić kaniulę.
  11. Użyj małego zacisku tętniczego, aby przytrzymać kaniulę wewnątrz tętnicy i usuń proste kleszcze z cienką końcówką, które zostały umieszczone poniżej tętnicy w kroku 5.8, aby zablokować przepływ krwi.
  12. Potwierdź drożność kaniuli, wstrzykując roztwór przeciwzakrzepowy do kaniuli i pobierając niewielką ilość krwi (ryc. 3C). Następnie przepłucz kaniulę roztworem antykoagulantu i uszczelnij koniec za pomocą płomienia zapalniczki lub zatyczki kaniuli.
  13. Zawiąż kaniulę na miejscu z dwoma szwami umieszczonymi pod tętnicą w kroku 5.8.
  14. Zdejmij zacisk tętniczy i zabezpiecz trzeci szew wokół tętnicy i kaniuli. Zamknij ranę szyi za pomocą szwów.

6. Okres pooperacyjny i infuzja preparatu

  1. Kontynuuj utrzymywanie szczura w znieczuleniu i na podgrzewanej podkładce.
  2. Ponownie nawodnić szczura poprzez wlew roztworu nawadniającego do dwunastnicy przez co najmniej 0,5 godziny po zakończeniu kaniulacji. Obserwuj spadek natężenia przepływu limfy (~0,1 - 0,5 ml/h) w początkowym okresie po kaniulacji i wkrótce wzrasta do stałej wartości wyjściowej (0,4 - 2,5 ml/h w zależności od szybkości nawodnienia).
  3. Po okresie rekonwalescencji należy wprowadzić do dwunastnicy interesujący preparat (zawierający lipidy, leki itp.) za pomocą kaniuli. Opcjonalnie należy użyć pompy infuzyjnej, aby regulować szybkość przepływu preparatu. UWAGA: W opisanym tutaj protokole zwierzęta pozostają znieczulone przez cały okres operacji i pobierania limfy i są poddawane eutanazji w znieczuleniu, tak aby nie było wymagane dodatkowe znieczulenie. Jeśli protokół zostanie zmodyfikowany, a zwierzęta będą mogły odzyskać przytomność, wymagane będzie odpowiednie znieczulenie i opieka pooperacyjna.
  4. Po zakończeniu infuzji preparatu należy kontynuować nawadnianie szczura w tempie 1,5-3 ml/godz. za pomocą zwykłej soli fizjologicznej do dwunastnicy, aby zapobiec odwodnieniu.
  5. Kontynuuj trzymanie szczura na podgrzewanej podkładce chirurgicznej o temperaturze 37°C, aby utrzymać temperaturę (zgodnie z krokiem 2.3), odciągaj mocz z pęcherza poprzez delikatne naciskanie w dół na dolną część brzucha, jeśli to konieczne, i ponownie nakładaj maść okulistyczną co godzinę (zgodnie z krokiem 2.2.3). Regularne zmiany pozycji ciała są zalecane, jeśli zwierzę ma odzyskać przytomność po zabiegu.

7. Pobieranie próbek limfy i krwi w celu oceny wchłaniania lipidów i leków

  1. Zbieraj limfę w sposób ciągły do probówek zawierających antykoagulant. Wymieniaj rurki w wymaganych odstępach czasu (np. co godzinę).
  2. Pobieraj próbki krwi w określonych punktach czasowych.
    1. Zablokuj przepływ krwi przez kaniulę, zginając kaniulę do tyłu około 2 cm od uszczelnionego końca. Rozszczelnić kaniulę, odcinając uszczelniony koniec lub wyjmując zatyczkę kaniuli.
    2. Za pomocą pustej strzykawki pobrać heparynizowaną sól fizjologiczną z kaniuli, aż krew wypełni całą kaniulę.
    3. Za pomocą nowej pustej strzykawki pobrać żądaną objętość krwi i umieścić ją w probówce zawierającej antykoagulant.
    4. Za pomocą pierwszej strzykawki należy wymienić krew pobraną przed pobraniem próbki, aby zmniejszyć niepotrzebną utratę krwi. Przed wstrzyknięciem należy przesunąć strzykawkę, trzymając ją w pozycji pionowej, aby upewnić się, że do kaniuli nie dostaną się pęcherzyki powietrza.
    5. Za pomocą strzykawki zastąp objętość krwi usuniętej od szczura roztworem przeciwzakrzepowym. Upewnij się, że w kaniuli nie są widoczne żadne resztki krwi, ponieważ wszelkie pozostałe mogą krzepnąć i blokować kaniulę.
    6. Zegnij kaniulę około 2 cm od nieuszczelnionego końca, aby zablokować przepływ krwi i wyjmij strzykawkę. Używając płomienia zapalniczki lub zatyczki kaniuli, ponownie uszczelnij kaniulę.
  3. Po zakończeniu pobierania krwi i limfy od szczura należy dokonać eutanazji szczura poprzez dootrzewnowe podanie >100 mg/kg pentobarbitonu sodu.
  4. Określ szybkość przepływu limfy, mierząc masę limfy zebranej w każdym okresie.
  5. Zmierz stężenie leku i lipidów w limfie i krwi za pomocą, na przykładample, HPLC, HPLC-MS lub za pomocą komercyjnych zestawów, aby ocenić skuteczność wchłaniania lipidów i leków.
  6. Obliczyć transport masy leku i lipidów w limfie na podstawie iloczynu zmierzonych stężeń i objętości pobranej limfy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki reprezentatywnego eksperymentu służącego do ilościowego oznaczenia skumulowanego zakresu i szybkości transportu lipidów oraz leku przez układ limfatyczny po podaniu dojelitnym z wykorzystaniem modelu kaniulacji naczyń chłonnych krezkowych przedstawiono na Rysunku 4 i Rysunku 5. W tym eksperymencie 200 µg halofantryny, będącej modelowym lekiem lipofilnym, podano do dwunastnicy szczurów w ciągu 2 hr w formulacji zawierającej 40 mg kwasu oleinowego (w tym 2 - 5 µCi 14C-kwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model kaniulacji limfy krezkowej szczura umożliwia bezpośrednie określenie ilościowe stężenia i szybkości transportu różnych komórek i cząsteczek (takich jak lipidy i leki) z jelita do limfy oraz zmian w nich, które zachodzą w odpowiedzi na prowokację różnymi substancjami (dietą, antygenem, lekami, preparatami itp.)10,27 i chorobami (rak, wirusy, zapalenie jelita grubego, insulinooporność itp.)5-7. Składniki zebrane w limfie mogą być również dalej wykorzystywane w dodatkowych eksp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie z Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (ARC) oraz Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) jest wdzięczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylna sól fizjologicznaBaxter healthcareAHB 1307Można użyć dowolnej marki. Przykładem są tutaj worki z solą Baxter 100 ml, pudełko zawierające 50
70 % etanolu w wodzieDowolnamożna użyć dowolnej marki
Roztwór glukonianu chlorheksydyny (Microshield 4)Livingstone InternationalJJ60243LMożna użyć dowolnej marki. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Roztwór betadynyLivingstone InternationalBU0510Można użyć dowolnej marki. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamina 100 mg/ml)PROVET VICTORIA KETA I 1http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Ksylazyna 100 mg/ml)PROVET VICTORIA TRO-3828http://www.provet.com.au/
ACP 10 Iniekcja (Acepromazyna 10 mg/ml)PROVET VICTORIA VTG-DACP010020http://www.provet.com.au/
Pentobarbiton soduPROVET VICTORIA 24529Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj Lethabarb® 325 mg/ml pentobarbiton sodu, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparyna (35000I.U. w 35 ml)Sigma Pharmaceuticals337220http://sigmaco.com.au/
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) sól disodowa dwuwodnaSigma-AldrichE1644Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj sól disodowa EDTA firmy Sigma. 
Kaniula polietylenowa (PE) o średnicy zewnętrznej 0,96 mm x średnica wewnętrzna 0,58 mmPrzedłużki mikroprobówekPE8050Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj rurka PE 0,96 x0,58 mm, 30 m
Kaniula z polietylenu (PE) ø zewnętrzna 0,8 mm x średnica wewnętrzna 0,5 mmPrzedłużki do mikroprobówekPE9658Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj rurka PE 0,8 x0,5 mm, linijka 30 m
DowolnaMożna użyć dowolnej marki
MarkeryDowolnamożna użyć
dowolnej marki ZapalniczkaDowolnaMożna użyć dowolnej marki
Klej weterynaryjnyDowolnaMożna użyć dowolnej marki
Igły o rozmiarze 23 LivingstoneInternationalDN23GX0.75LVMożna użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj jednorazowa igła Livingstone, sterylna, 23GX0.75 cala, 100 / PUDEŁKO. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6& search=DN23GX0.75LV
25 gauge igłyLivingstone InternationalDN25GX1.0LVMożna użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj jednorazowa igła Livingstone, sterylna, 25GX1.0 cala, 100 / PUDEŁKO. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml strzykawkaLivingstone InternationalT3SS01TAMożna użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj strzykawka Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
Strzykawka 10 mlLivingstone InternationalT3SS10SAMożna użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj strzykawka Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Waciki z gazyLivingstone InternationalGSC075Można użyć dowolnej marki i przyciąć do wymaganego rozmiaru. Przykładem są tutaj waciki z gazy wypełnione bawełną 7,5x7,5 cm, 8 warstw. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Patyczki kosmetyczneLivingstone InternationalCTAST075DPMożna użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj plastikowy aplikator bawełniany Livingstone z podwójną końcówką. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Poduszka grzewczaRatekWT1Można użyć dowolnej marki, która utrzymuje temperaturę na poziomie 37C. Przykładem jest tutaj taca do podgrzewania Ratek.
Światło chirurgiczneAparat Harvard72-0215 z 72-0267Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj aparat Harvard V-Lux 1000 Zimne źródło światła z bifurcated gooseneck Light Guide,, średnica włókna 4,7 mm (każde ramię). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail i  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Mikroskop chirurgicznyZeiss495005-0014-000Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj mikroskop stereoskopowy Zeiss Stemi 2000-C z podwójnym punktem Stand S i diodą LED KL 300. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Jedwabny szewLivingstone InternationalDTSK163019F4Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj  

3/8 Okrągły jedwabny szew o odwrotnym szlifie 3/0 Nić 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Ostrza skalpelaFine Science Tools (FST)10020-00Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj ostrze skalpela FST #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Rękojeść skalpelaFine Science Tools (FST)10004-13Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj rękojeść skalpela FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Małe nożyczki chirurgiczneFine Science Tools (FST)14060-09Można użyć dowolnej marki. Przykładem są tutaj cienkie nożyczki FST, 9 cm z krawędzią tnącą 21 mm, ostre, proste. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x kleszcze z ząbkowaną zakrzywioną końcówkąFine Science Tools (FST)11001-13Można użyć dowolnej marki. Przykładem są tutaj kleszczyki FST 13 cm o standardowym wzorze z zakrzywioną końcówką 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x nożyczki do irydektomiiFine Science Tools (FST)15000-08Można użyć dowolnej marki. Przykładem są tutaj nożyczki sprężynowe FST Vannas - krawędź tnąca 2.5 mm, prosta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x kleszcze z prostą ząbkowaną końcówkąFine Science Tools (FST)11650-10Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest FST Graefe 10 cm prosty z ząbkowaną końcówką 1 x 0,99 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x kleszcze z gładką, ostrą, prostą, cienką końcówkąFine Science Tools (FST)11251-10Można użyć dowolnej marki. Przykładem są kleszcze FST Dumont #5 proste 11 cm z końcówką 0,08 x 0,04 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x kleszcze z gładkimi, drobno zakrzywionymi kleszczamiFine Science Tools (FST)11063-07Można użyć dowolnej marki. Przykładem są tutaj delikatne kleszcze FST 9 cm z gładką końcówką 0,4 x 0,3 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x HemostatsFine Science Tools (FST)13010-12Można użyć dowolnej marki. Nie wszyscy operatorzy używają hemostatów. Przykładem jest FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats o długości 20 mm x szerokości 1,3 mm ząbkowana, prosta końcówka. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x uchwyt na igłę do szwówFine Science Tools (FST)12001-13Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj uchwyt na igłę FST 13 cm Hasley z końcówką o długości 16 mm i szerokości 1,9 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x zacisk tętniczyFine Science Tools (FST)18050-28Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest FST Bulldog Serrefines prosty, o długości 28 mm, wymiarach szczęk 9x1,6 mm ze średnią prasą zaciskową. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Kwas oleinowySigma AldrichO1008W razie potrzeby można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj 99% czysty kwas oleinowy. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU
Kwas 14C-oleinowyPerkin NEC317050UC Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj kwas oleinowy, [1-14C]-, 50&mikro; Ci (1,85 MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Taurocholan soduSigma AldrichT4009Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest tutaj kwas taurocholowy sól sodowa hydrat ≥ 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU
HalofantrineGlaxo Smith KlineHalofantrine został uprzejmie dostarczony jako prezent od Glaxo Smith Kline
Fosforan sodu jednozasadowySigma Aldrich71507Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest jednowodny monohydrat fosforanu sodu, BioXtra, dla biologii molekularnej, >99,5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU
Fosforan sodu dwuzasadowySigma Aldrich71643Można użyć dowolnej marki. Przykładem jest dwuwodny fosforan sodu dwuwodny, BioUltra, dla biologii molekularnej, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. , 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77 (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362 (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21 (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27 (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4 (12), e8442(2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7 (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60 (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261 (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6 (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27 (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42 (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33 (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85 (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89 (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50 (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24 (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30 (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35 (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64 (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69 (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90 (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16 (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17 (8), 086005(2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24 (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821 (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20 (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9 (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40 (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103 (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61 (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26 (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272 (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22 (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78 (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102 (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101 (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80 (4), 196-200 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kaniulacja przewodu ch onnego krezowegotransport ch onny w jelitachtechnika pobierania ch onkimetoda kaniulacji dwunastnicykaniulacja t tnicy szyjnejpomiar szybko ci przep ywu ch onkiocena transportu lipid wocena transportu lek wch onny transport lek wprzygotowanie modelu chirurgicznego

Powiązane artykuły