Artykuł metodologiczny

Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

DOI:

10.3791/52419

⸱

28 listopada 2014

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prosty, ilościowy test kolorymetryczny, który konkretnie mierzy aktywność proteolityczną ludzkiego, mysiego lub szczurzego Granzyme B (GzmB). Protokół ten można łatwo dostosować do określania aktywności proteazy innych granulowanych proteaz serynowych poprzez hydrolizę innych syntetycznych substratów peptydowych z odpowiednią sekwencją rozpoznawania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteaza serynowa Granzyme B (GzmB) pośredniczy w apoptozie komórek docelowych, gdy jest uwalniana przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL) lub komórki NK (NK). GzmB jest najczęściej badanym granzymem u ludzi i myszy, dlatego naukowcy potrzebują konkretnych i wiarygodnych narzędzi do badania jego funkcji i roli w patofizjologii. Wymaga to szczególnie testów, które nie rozpoznają proteaz, takich jak kaspazy lub inne granzymy, które są strukturalnie lub funkcjonalnie powiązane. Tutaj stosujemy preferencję GzmB dotyczącą rozszczepienia po resztach kwasu asparaginowego w teście kolorymetrycznym przy użyciu peptydu tioestru Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB jest jedyną ssaczą proteazą serynową zdolną do rozszczepienia tego substratu. Substrat jest rozszczepiany z podobną wydajnością przez GzmB ludzi, myszy i szczurów, co jest właściwością niepodzielną dla innych dostępnych na rynku substratów peptydowych, nawet takich, które są reklamowane jako odpowiednie do tego celu. Protokół ten jest demonstrowany przy użyciu niefrakcjonowanych lizatów z aktywowanych komórek NK lub CTL i jest również odpowiedni dla rekombinowanych proteaz generowanych w różnych systemach prokariotycznych i eukariotycznych, pod warunkiem, że stosowane są odpowiednie kontrole. Test ten jest wysoce specyficzną metodą służącą do ustalenia potencjalnej aktywności proapoptotycznej cząsteczek cytotoksycznych w limfocytach ssaków oraz ich rekombinowanych odpowiedników wyrażanych za pomocą różnych metodologii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granzymes to rodzina proteaz serynowych znajdujących się w lizosomach wydzielniczych komórek NK i cytotoksycznych limfocytów T (CTL) 1. U ludzi (A, B, H, K i M) występuje pięć różnych granzymów, a u myszy (A - G, K, M i N) 10 2,3. Granzyme A i Granzyme B (GzmA, GzmB) są najliczniejsze i zostały szeroko przebadane w środowisku ludzi i gryzoni.

Klasyczną funkcją GzmB jest indukcja apoptozy w komórkach docelowych wykonywana w połączeniu z białkiem tworzącym pory perforyną, które umożliwia granzymowi dostęp do cytozolu 4 komórki docelowej. Chociaż ekspresja GzmB jest jednoznacznie stwierdzona w limfocytach cytotoksycznych, ostatnie badania dotyczą wielu innych typów komórek wykazujących ekspresję GzmB, w tym między innymi keratynocytów 5, bazofili 6, komórek tucznych 7, plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych 8 i limfocytów B 9,10. W tym kontekście ujawniono nieapoptotyczne funkcje GzmB, począwszy od udziału w procesach zapalnych, przebudowy tkanek i innych właściwości immunoregulacyjnych 11-14.

Biorąc pod uwagę, że zaproponowano szerszą biologiczną rolę GzmB niż wcześniej podejrzewano, badacze potrzebują niezawodnych i konkretnych narzędzi do jego wykrywania. Zaletą jest specyficzne wymaganie GzmB do rozszczepiania po stronie karboksylowej reszt kwasu asparaginowego, właściwość unikalna wśród eukariotycznych proteaz serynowych 15. GzmB myszy, człowieka i szczura są strukturalnie bardzo podobne, jednak rozszerzona specyficzność substratu myszy GzmB różni się nieznacznie od swoistości zarówno człowieka, jak i szczura 16, co oznacza, że niektóre ogólne substraty z Asp na końcu (P1) mogą być skutecznie rozszczepiane przez GzmB ze wszystkich trzech gatunków, podczas gdy inne substraty z bardziej skomplikowanymi sekwencjami przed P1 mogą dawać bardzo zróżnicowane wyniki. Zarówno w dawnej, jak i nowszej literaturze fakt ten spowodował znaczne zamieszanie i błędną interpretację biologicznego znaczenia niektórych wyników eksperymentalnych, mimo że starannie kontrolowane, badania kinetyczne starały się skorygować tę sytuację 17.

W tym artykule staraliśmy się zilustrować te punkty za pomocą dwóch dostępnych na rynku substratów, a mianowicie Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl i N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilidku. Te dwa odczynniki generują różne grupy reaktywne po rozszczepieniu (wolny sulfirryl kontra fluorescencyjny wolny paranitroanilid), ale nie ma to żadnego wpływu na rozszczepienie proteolityczne. Opisany protokół jest nowoczesną adaptacją bardzo starego protokołu 18, ale powinien pomóc badaczom w odpowiednim wykorzystaniu różnych substratów GzmB, zapewniając jednocześnie ramy metodologiczne do wykrywania aktywności innych granzymów, takich jak GzmA i GzmH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Śledziony pochodziły od myszy (w wieku 6-10 tygodni), a wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi etyki zwierzęcej Centrum Onkologicznego Petera MacCalluma (E486).

1. Przygotowanie próbek.

  1. Przygotowanie aktywowanych mysich komórek NK.
    1. Wyizoluj pierwotne naiwne komórki NK z jednokomórkowych zawiesin śledziony myszy C57BL / 6 lub B6.GrzmB-/- (GzmB gen zerowy) przez selekcję negatywną przy użyciu dostępnych na rynku zestawów.
    2. Postępuj zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, magnetycznie znakuj komórki "inne niż NK", takie jak limfocyty T i B, komórki dendrytyczne, granulocyty, makrofagi i czerwone krwinki, używając przeciwciał sprzężonych z biotyną przeciwko ich specyficznym markerom powierzchniowym. Użyj separacji magnetycznej za pomocą kulek anty-biotyny, aby zubożyć komórki "inne niż NK".
    3. Hodowla izolowanych komórek NK przez 5-7 dni w pożywce zawierającej IL-2 (1 000 U/ml) w stężeniu 700 000 komórek/ml na 24-dołkowych płytkach w temperaturze 37 °C.
    4. Alternatywnie, użyj aktywowanych limfocytów T 19, pierwotnego CTL z ograniczeniem antygenu od transgenicznych myszy z receptorem komórek T OT1 20, CTL generowanych w mieszanych kulturach limfocytów 21 lub supernatantów z aktywowanych komórek NK w celu określenia aktywności wydzielanego GzmB 19.
  2. Utrzymanie ludzkiej linii komórkowej NK i izolacja pierwotnych komórek NK.
    1. Utrzymuj ludzką białaczkę NK (komórki YT) w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą. Alternatywnie, oczyść pierwotne komórki NK z krwi obwodowej zdrowych osób i stymuluj przez 2-3 dni w pożywce zawierającej IL-2 w stężeniu 100 U/ml, jak opisano wcześniej 22.
  3. Wytwarzanie lizatów komórkowych.
    1. Umyj komórki trzykrotnie w PBS (pH 7,4), a następnie zawieś w buforze do lizy Nonidet P-40 (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Najlepiej lizować co najmniej 5 x 106 komórek NK lub 1 x 107 komórek T w buforze 100 μl. Nie należy dodawać inhibitorów proteazy, ponieważ wiele z nich jest nieodwracalnymi inhibitorami proteaz serynowych, a w szczególności tryptaz, takich jak GzmA. Inkubować na lodzie przez 20 minut, a następnie granulować jądra w mikrowirówce o stężeniu 15 000 x g przez 10 minut. Wyrzucić osad jądrowy i przenieść supernatant do świeżej probówki.
  4. Określić stężenie białka w lizatach.
    1. Użyj dostępnego na rynku protokołu z wyboru, takiego jak kwas Bradforda lub kwas bicinchoninowy (BCA) i określ stężenie białka. Upewnij się, że stężenie wynosi minimum ~2 mg/ml. Przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne (aktywność granzyme jest stabilna przez wiele miesięcy w temperaturze -20 °C).

2. Test aktywności Granzyme B

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować 10 mM zapasu substratów (Boc-AAD-S-Bzl lub Ac-IEPD-pNA) w DMSO (~5 mg/ml) i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Przygotować świeżo roztwór roboczy i wyrzucić po każdym dniu, ponieważ Boc-AAD-S-Bzl ulega częściowej hydrolizie podczas przechowywania w DMSO.
    2. Przygotować 250 mM zapasu odczynnika kolorymetrycznego (5,5'-ditio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy), DTNB) w DMSO (0,09 g/ml) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Codziennie przygotowywać świeże rozcieńczenie robocze. Ten odczynnik jest wymagany tylko dla podłoży z grupami wskaźnikowymi SBzl, a nie pNA.
    3. Uzupełnij świeży bufor (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) co 2-3 tygodnie.
  2. Doprowadź DTNB i podłoża syntetyczne do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć substraty (1:16, np. 100 μl w 1,6 ml buforu) i DTNB (1:250, np. 10 μl w 2,5 ml buforu) i dobrze wymieszać.
  3. Rozcieńczyć co najmniej 100 μg lizatu białkowego z każdej próbki w buforze do końcowej objętości 160 μl. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl na studzienkę w trzech powtórzeniach (~33,3 μg/dołek) na dolnej płytce winylowej 96-dołkowej w kształcie litery "U". Dołącz kontrolkę "tylko bufor" (również w trzech egzemplarzach).
  4. Dodać 100 μl rozcieńczonego DTNB do próbki/buforu kontrolnego (pomiń ten krok podczas pracy z Ac-IEPD-pNA.
    UWAGA: Rozszczepienie Ac-IEPD-pNA przez GzmB bezpośrednio uwalnia fluorogenne pNA (Figura 4B).
  5. Za pomocą pipety wielokanałowej szybko dodaj 50 μl rozcieńczonych substratów do każdego zestawu trzech próbek, zaczynając od buforu, następnie wszelkich kontroli ujemnych, a kończąc na oczekiwanych próbkach dodatnich.
  6. Umieść płytkę w czytniku płytek. Zmierzyć aktywność Asp-azy przez hydrolizę Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl/Ac-IEPD-pNA w czytniku mikropłytek przy OD 405 nm. Użyj protokołu testu kinetycznego, wykonaj 25 odczytów co 15 sekund (ok. 6 minut całkowitego czasu odczytu).
  7. Użyj odczytów absorbancji wygenerowanych w każdym punkcie czasowym, aby ręcznie obliczyć szybkość rozszczepiania substratu, jeśli oprogramowanie czytnika płytek nie może wygenerować wartości Vmax.

3. Analiza danych

UWAGA: Wygenerowane dane są prezentowane jako maksymalna prędkość, zdefiniowana jako zmiana OD w czasie (mOD/min).

  1. Aby przeanalizować dane, określ maksymalną szybkość rozszczepiania substratu, która jest obliczana na podstawie szybkości zmiany absorbancji. Zrób to automatycznie za pomocą oprogramowania do odczytywania płytek, które zazwyczaj ma tę opcję.
  2. Alternatywnie, po przejrzeniu wykresów kinetycznych zmian absorbancji, które są generowane podczas testu kinetycznego na czytniku płytek, należy ręcznie wybrać punkty danych, które dają najbardziej stromą linię prostą. W przypadku większości testów maksymalna szybkość jest osiągana w ciągu pierwszych 2 minut testu.
  3. Odejmij początkowy odczyt OD od najwyższego odczytu OD na tej linii prostej i podziel przez przedział czasu. Przenieś surowe dane do programu Microsoft Excel/Graph pad w celu analizy statystycznej i wyświetlenia graficznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Substrat Boc-AAD-S-Bzl jest swoisty dla GzmB

Serynowa proteaza GzmB jest głównym składnikiem limfocytów cytotoksycznych (komórek CTL i NK) i odpowiada przede wszystkim za indukcję szybkiej śmierci apoptotycznej w komórkach docelowych, takich jak komórki zainfekowane wirusem lub przekształcone. Wynika to w dużej mierze z preferencji substratowej w kierunku cięcia po określonych, specyficznych resztach asparaginianu w wybranych białkach – cechy wspólnej z kaspazami, które równie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Historycznie rzecz biorąc, granzymy zostały zidentyfikowane jako kluczowe cząsteczki efektorowe cytotoksycznych limfocytów (komórek CTL i NK) zdolne do indukowania szybkiej śmierci apoptotycznej w komórkach docelowych. Wynikało to głównie z działania GzmB, który rozszczepiał cząsteczki docelowego substratu na resztach asparaginianu (D), a tym samym był w stanie aktywować kaskadę kaspazy zarówno poprzez rozszczepianie pro-kaspaz, jak i kilku ich dalszych celów. Jednak obecnie uznaje się, że ekspresja GzmB nie ogranicza si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca otrzymała wsparcie w postaci grantu HA 6136/1-1 od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemieckiej Fundacji Badawczej) dla MH. JAT jest wspierany przez granty programowe i projektowe Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Podłoże Granzyme B (mysz i człowiek)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Podłoże Granzyme B (tylko ludzkie)
N-α-CBZ-L-lizyna-S-BzlSigma-AldrichC3647Podłoże Granzyme A
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Podłoże Granzyme H
5,5'-dithio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy) Sigma-AldrichD8130DTNB, Ellman' s Odczynnik
Zestaw do izolacji komórek NK Mysz IIMiltenyi Biotec GmbH130-096-892zestaw do selekcji negatywnej
Zestaw do izolacji komórek NK ludzkiMiltenyi Biotec GmbH130-092-657zestaw do selekcji negatywnej
Czytnik płytekBiorad iMarkBiorad Microplate Manager Wersja oprogramowania MPM6.3
Serocluster U-bottom winylowa płytka 96-dołkowaCorning, MA, USA2797

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. , (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. , (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno granzymu Blizat kom rek NKpomiar aktywno ci proteolitycznejswoisto substratowareakcja z DTNBczytnik mikrop yteknokaut granzymu Blimfocyty cytotoksyczne

Powiązane artykuły