Artykuł metodologiczny

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

DOI:

10.3791/52427

⸱

9 marca 2015

 ,  , 
1Programme in Molecular Structure and Function, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przezbłonowy regulator przewodnictwa (CFTR) mukowiscydozy jest unikalnym członkiem nadrodziny transporterów ATP Binding Cassette (ABC). Fosforylacja i zależna od nukleotydów aktywność kanałów chlorkowych CFTR była często badana w całych układach komórkowych oraz jako pojedyncze kanały w wyciętych łatach błonowych. Wykazano, że wiele mutacji powodujących mukowiscydozę zmienia tę aktywność. Chociaż opublikowano niewielką liczbę protokołów oczyszczania, brakowało metody szybkiej rekonstytucji, która zachowywałaby aktywność kanału, oraz odpowiedniej metody badania aktywności kanału populacyjnego w oczyszczonym systemie. W tym miejscu opisano szybkie metody oczyszczania i funkcjonalnej rekonstytucji białka CFTR o pełnej długości w proteoliposomach o określonym składzie lipidowym, który zachowuje aktywność jako regulowany kanał halogenkowy. Ta metoda rekonstytucji wraz z nowatorskim testem aktywności kanału opartym na strumieniu stanowi odpowiedni system do badania właściwości kanałów populacyjnych CFTR typu dzikiego i mutantów wywołujących chorobę F508del- i G551D-CFTR. W szczególności metoda ta jest przydatna w badaniu bezpośredniego wpływu fosforylacji, nukleotydów i małych cząsteczek, takich jak wzmacniacze i inhibitory, na aktywność kanału CFTR. Metody te są również podatne na badanie innych kanałów/transporterów membranowych dla substratów anionowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transport chlorków przez błony wierzchołkowe komórek nabłonkowych w takich tkankach jak płuca, jelita, trzustka i gruczoły potowe odbywa się głównie za pośrednictwem Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), regulowanego przez ATP i fosforylację członka podrodziny białek błonowych ABC (ATP-Binding Cassette) C (przegląd w1). Podobnie jak inni członkowie podrodziny ABCC, CFTR jest dużym, wielozakresowym integralnym białkiem błonowym, które wiąże ATP w dwóch miejscach wiązania nukleotydów utworzonych na granicy domen wiążących nukleotydy (NBD), gdzie posiada niewielką aktywność ATPazy w jednym miejscu. Jednak w przeciwieństwie do innych członków podrodziny ABCC, CFTR ewoluował jako unikalny regulowany kanał Cl, a nie jako aktywny transporter substancji rozpuszczonej.

Mutacje w CFTR powodują mukowiscydozę, chorobę dotykającą wiele narządów, w tym płuca, przewód pokarmowy, trzustkę i układ rozrodczy, prowadząc do zachorowalności i śmiertelności u młodych dorosłych. Choroba płuc zazwyczaj odpowiada za wczesną śmiertelność w mukowiscydozie i w większości przypadków jest spowodowana utratą funkcji CFTR na powierzchni nabłonka przewodzących dróg oddechowych. Brak aktywności kanału chlorkowego CFTR powoduje zmniejszenie ruchu zarówno Cl-, jak i wody po nabłonku powierzchniowym, aby zmodyfikować warstwę płynu na wierzchołkowej powierzchni nabłonka rzęskowego układu oddechowego. W ten sposób powstaje lepka ciecz na powierzchni dróg oddechowych, która upośledza zdolność komórek nabłonka rzęskowego układu oddechowego do skutecznego usuwania patogenów z dróg oddechowych. W konsekwencji większość pacjentów z mukowiscydozą cierpi na nawracające napady infekcji płuc i uszkodzenie płuc z powodu stanu zapalnego.

Zgodnie z oczekiwaniami, badania nad mechanizmem działania normalnego białka CFTR skupiały się przede wszystkim na szczegółowych badaniach elektrofizjologicznych jego aktywności bramkowania kanału. Badania jednokanałowe wykazały bezpośrednio, że CFTR funkcjonuje jako zależny od PKA kanał Cl-, który posiada bramkę2 regulowaną przez ATP. Szczegółowe badania elektrofizjologiczne dostarczają wielu informacji na temat pojedynczych kanałów CFTR1,3, jednak mogą istnieć obawy, czy charakterystyka któregokolwiek z poszczególnych pojedynczych kanałów, które były badane, odzwierciedla całą populację kanałów CFTR i dlatego wyniki pojedynczego kanału powinny być zawsze rozpatrywane wraz z metodami badania populacji makroskopowej. Bezpośrednie badanie aktywności kanału populacyjnego oczyszczonego CFTR może potencjalnie dostarczyć informacji na temat defektu molekularnego związanego z mutacjami powodującymi chorobę i przyczynić się do odkrycia modulatorów chemicznych, które naprawiają zmutowane białka CFTR. Do tej pory istnieje ponad 1900 różnych mutacji w CFTR, które uważa się za powodujące mukowiscydozę4. Główna mutacja, F508del-CFTR, znaleziona na co najmniej jednym allelu u około 90% pacjentów w Ameryce Północnej i Europie, prowadzi do nieprawidłowego fałdowania i zatrzymywania białek w retikulum endoplazmatycznym5. F508del-CFTR ma również inne konsekwencje, w tym wadliwą aktywność kanału6-9. Wynikający z tego brak CFTR na powierzchni komórki wiąże się z ciężką chorobą. Uważa się, że G551D-CFTR, rzadziej występująca mutacja, jest prawidłowo sfałdowana, ale jest dysfunkcyjna jako kanał chlorkowy na powierzchni komórki6. Opracowanie korektorów i wzmacniaczy małych cząsteczek ma na celu skorygowanie fałdowania i/lub transportu mutantów, takich jak F508del-CFTR, na powierzchnię komórki, oraz odpowiednio wzmocnienie lub zwiększenie aktywności kanału mutacji, takich jak G551D, gdy są obecne na powierzchni komórki. Podczas gdy korektory VX-809 i VX-661 (nie są jeszcze zatwierdzone do stosowania u pacjentów, wzmacniacz Kalydeco (iwakaftor; VX-770) jest stosowany w dawce 150 mg co 12 godzin u pacjentów z mukowiscydozą >6 lat z co najmniej jedną mutacją G551D-CFTR, a ostatnio u pacjentów z jedną z G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255P i G1349D. Kalydeco jest zarówno bezpieczny, jak i przyczynia się do poprawy wskaźników klinicznych choroby mukowiscydozy10, jednak mechanizm działania tej małej cząsteczki był słabo poznany w momencie zatwierdzenia przez FDA do stosowania u pacjentów.

Kilka metod oczyszczania CFTR zostało opisanych wcześniej2,11-18, z których wiele wymaga dużo czasu na ukończenie. W niedawnej publikacji19 opisano unikalną metodę szybkiego oczyszczania i rekonstytucji dla nadekspresji CFTR w systemie ekspresji komórek Sf9, a to oczyszczone białko w określonych układach lipidowych wykorzystano do opracowania testu aktywności kanału halogenkowego CFTR dla populacji cząsteczek CFTR. Test podsumowuje znany wpływ fosforylacji, nukleotydów i inhibitorów na funkcję CFTR. System został wykorzystany do zbadania wpływu wzmacniacza VX-770/Kalydeco na Wt- (typ dziki), F508del- i G551D-CFTR i po raz pierwszy wykazano, że lek oddziałuje bezpośrednio z białkiem CFTR w celu wzmocnienia jego aktywności kanałowej w sposób niezależny od ATP, wykazując użyteczność i zastosowanie tych metod do badania interakcji CFTR i mutantów z nukleotydami i małymi cząsteczkami z perspektywy populacji w celu uzyskania odpowiedzi klinicznej istotne pytania dotyczące białka. Metody te wykorzystano również do badania innych cząsteczek wzmacniających i ich pochodnych20, a także wpływu korektora małych cząsteczek na aktywność białka21.

Testy wypływu były wcześniej używane w wielu badaniach do badania aktywności mutantów CFTR i wpływu związków modulujących CFTR na jego aktywność, w tym testy całych komórek przy użyciu elektrod, radioaktywnych znaczników i fluoroforów22,23, pęcherzyków błonowych z elektrodami jonoselektywnymi24 oraz oczyszczonego odtworzonego CFTR z radioaktywnymi znacznikami25. Jednak zastosowanie elektrod jonoselektywnych do badania oczyszczonego, odtworzonego CFTR zostało po raz pierwszy zgłoszoneniedawno19. Adaptacja obecnej metody została wykorzystana do rekonstytucji i charakterystyki funkcjonalnej dwóch białek błonowych w Pseudomonas aeruginosa, powszechnym patogenie mukowiscydozy. Rekonstytucja oczyszczonego białka błony zewnętrznej AlgE w połączeniu z pomiarami wypływu jodku została wykorzystana do wsparcia modelu wydzielania alginianu anionowego przez ten transporter26. Pomiary rekonstytucji i wypływu jodku zastosowano do oczyszczonego białka Wzx, co pozwoliło na zaproponowanie modelu, który sugeruje zależny od H + mechanizm antyportowy translokacji oligosacharydów związanych z lipidami przez wewnętrzną błonę bakteryjną przez to białko27. W obu przypadkach jodek został użyty jako substytut substratu anionowego, aczkolwiek przy niższej przepustowości niż można by się spodziewać w przypadku substratu natywnego. Metoda ta może być odpowiednia do adaptacji do innych białek z kationowymi szlakami transportu lub przewodzenia dla substratów anionowych.

Tutaj opisana jest procedura szybkiego oczyszczania białka CFTR i jego rekonstytucji do proteoliposomów określonego lipidu. Procedura szybkiej rekonstytucji może być łatwo dostosowana do stosowania z CFTR oczyszczonym innymi metodami, pod warunkiem, że rodzaj detergentu użytego do oczyszczania jest podatny na usunięcie za pomocą metod zastosowanych tutaj lub może zostać wymieniony na odpowiedni detergent przed procedurą rekonstytucji. Szczegółowo opisano metodę wypływu jodku do pomiaru aktywności kanałowej oczyszczonego i odtworzonego białka CFTR oraz przedstawiono kilka typowych wyników, które można uzyskać tą metodą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanie CFTR

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów i Sprzętu, aby zapoznać się z listą sprzętu i materiałów użytych w tym protokole. Istnieje szczegółowy protokół nadekspresji ludzkiego Wt-CFTR i mutantów w systemie ekspresji Sf9-bakulowirusa17,28. Nadekspresja CFTR i przygotowanie granulek komórek Sf9 zgodnie z tym protokołem.

  1. Surowe przygotowanie membrany
    1. Otrzymać świeżą lub rozmrozić zamrożony osad komórek Sf9 z 500 ml hodowli komórek z nadmierną ekspresją białka typu dzikiego, F508del- lub G551D-CFTR z C-końcowym znacznikiem His10, wyhodowanym przy użyciu standardowych metod hodowli komórkowej, jak opisano wcześniej17,28. Granulki komórkowe będą miały objętość około 5 ml i mokrą masę około 5 g.
    2. Zawiesić 9 komórek Sf9 w 20 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 z koktajlem inhibitorów proteazy (1 tabletka na 50 ml) w temperaturze 4 °C, upewniając się, że próbka wydaje się wizualnie jednorodna i nie pozostają żadne grudki komórek.
    3. Lizuj komórki za pomocą wysokociśnieniowego zakłócacza ogniw (Tabela materiałów i wyposażenia), osiągając minimum 10 000 psi (najlepiej 15 000-20 000 psi) przez 2 minuty na przejście. Podczas lizy próbkę należy utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      1. Po okresie lizy należy zebrać próbkę w probówce na lodzie, a następnie natychmiast ponownie załadować próbkę do urządzenia zakłócającego działanie komórek. Powtórz procedurę lizy 3 razy. Zbadaj pod mikroskopem, aby upewnić się, że mniej niż 10% pozostało nienaruszone.
        UWAGA: inne metody lizy komórek, takie jak szklane kulki itp., nie zostały rygorystycznie przetestowane dla tego systemu, jednak użytkownik może uznać taką alternatywną metodę za odpowiednią.
    4. Odwirować materiał do lizy komórek w temperaturze 4 °C w wirówce wysokoobrotowej przy 2 000 x g przez 20 minut. Zebrać supernatant i usunąć osad. Podzielić supernatant na 20 probówek i odwirować próbki przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy 125 000 x g w ultrawirówce stołowej.
    5. Usunąć i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu, i przechowywać granulki w tych samych probówkach w temperaturze -80 °C przez mniej niż 2 miesiące do momentu użycia lub zachować na lodzie i natychmiast kontynuować oczyszczanie.
  2. Solubilizacja CFTR
    1. Otrzymać 1-4 świeże lub mrożone granulki surowej błony membranowej Sf9 i ponownie zawiesić każdy z nich w 1 ml buforu 1 (2% fos-choliny; pełna receptura) w temperaturze 4 °C na lodzie, używając igły 25 G i strzykawki o pojemności 1 ml do momentu, gdy roztwór stanie się jednorodny na oko bez widocznych grudek błony komórkowej. W przypadku gdy rozpuszcza się więcej niż jeden osad, należy kontynuować obróbkę każdej próbki zgodnie z poniższymi instrukcjami dla pojedynczej osadówki, łącząc próbki na etapie 1.3.2.
    2. Rozpuścić 1 tabletkę mini inhibitora proteazy w 1 ml buforu 2 (10 mM imidazolu; patrz Tabela 1), w którym brakuje detergentu fos-choliny 14 (inhibitory proteazy są 10 razy bardziej skoncentrowane niż zalecane rozcieńczenie w tym momencie) i dodać 100 μl do zawieszonego surowego osadu błonowego (inhibitory proteazy są w tym momencie w zalecanym rozcieńczeniu). Ustawić na lodzie na 45-60 min z mieszaniem przez odwrócenie 5 razy co 5 minut.
    3. Odwirować zawieszone surowe granulki membranowe w ultrawirówce stołowej przez 25 minut w temperaturze 125 000 x g i temperaturze 4 °C. Zachować supernatant, który zawiera rozpuszczony CFTR i wyrzucić osad.
  3. Wiązanie kolumn, fosforylacja i elucja
    1. Przepłukać 400 μl zawiesiny agarozy niklowo-NTA (kwas nitrylotrioctowy) lub równoważnej żywicy 1 ml buforu 2 (10 mM imidazolu; patrz tabela 1), który nie zawiera detergentu, w celu usunięcia rozpuszczalnika i buforu w temperaturze 4 °C. Powtórzyć mycie jeszcze dwa razy.
    2. Połączyć rozpuszczony CFTR, pozostały inhibitor proteazy (900 μl) i żywicę niklową (z 400 μl zawiesiny) w sumie 10 ml z buforem 2 (10 mM imidazolu; patrz tabela 1), w którym nie dodano detergentu. Na tym etapie stężenie fos-choliny 14 jest skutecznie rozcieńczane do 0,2% (w/v). Jeśli jest wiele probówek, zbierz wszystkie próbki zawierające rozpuszczony CFTR, inhibitory proteazy, żywicę niklowo-NTA i 0,2% (w/v) fos-choliny-14 w tym momencie. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
    3. Przepuścić roztwór NTA inhibitora proteazy CFTR i niklu w dół małej kolumny przesiewowej (Tabela 1) lub równoważnej pustej kolumny.
    4. Przemyć żywicę niklowo-NTA, która jest zatrzymana w kolumnie, 4 ml na początkową osadę buforu 3 (10 mM imidazolu + DDM; patrz tabela 1), który nie zawiera fos-choliny 14, ale zawiera 1 mM DDM (detergent dodecylmaltozyd), w temperaturze 4 °C. Dodanie detergentu DDM nie zmienia znacząco pH tego buforu.
    5. Przygotować roztwór PKA-MgATP, dodając 25 μl (5 mM, stężenie końcowe) MgATP, 2,500 U kinazy białkowej A zależnej od cAMP, podjednostki katalitycznej (PKA) do 475 μl buforu 3 (10 mM imidazol+DDM; patrz tabela 1) do kolumny. Fosforylować białko poprzez uszczelnienie dolnego końca kolumny nasadką lub parafilmem i dodanie 500 μl roztworu PKA-MgATP na każdą użytą początkową osadkę.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej (20 °C) przez 20 minut, delikatnie mieszając i ponownie zawieszając żywicę za pomocą pipetora o pojemności 1 ml co 2 minuty, aby upewnić się, że PKA weszła w kontakt z całą powierzchnią żywicy niklowej NTA.
    7. Zdjąć nasadkę i wymyć roztwór PKA/MgATP z kolumny. Przemyć kolumnę 2 ml buforu 3 (10 mM imidazolu+DDM; patrz tabela 1) w temperaturze 4 °C.
    8. Pomnóż liczbę granulek użytych w eksperymencie przez 4. Przemyć kolumnę tą liczbą ml buforu 4 (50 mM imidazolu + DDM; patrz tabela 1) w temperaturze 4 °C, dodając 4 ml buforu do kolumny, pozwalając mu przepłynąć i natychmiast dodając do kolumny następną 4 ml podwielokrotność.
    9. Eluować białko, przepuszczając 1 ml buforu 5 (600 mM imidazolu + DDM; patrz tabela 1) w temperaturze 4 °C na początkową osadę użytą przez kolumnę, po 1 ml na raz bez przerwy, aby umożliwić wyschnięcie kolumny, i zebrać cały eluat zawierający oczyszczony CFTR w jednej probówce.
    10. Zagęścić próbkę białka w celu usunięcia imidazolu i produktów degradacji o niskiej masie cząsteczkowej za pomocą wirówkowego urządzenia filtrującego (odcięcie 100 000 masy cząsteczkowej), takiego jak opisane w Tabeli materiałów i wyposażenia lub innego podobnego urządzenia, w sumie 10 ml buforu 6 (75 mM KI+DDM; patrz tabela 1) lub innego wybranego buforu zawierającego 1 mM DDM (takiego jak bufor 7 do eksperymentów z wypływem bez jodku, 25 mM HEPES+DDM; patrz tabela 1), przez odwirowanie w temperaturze 2 000 x g i w temperaturze 4 °C przez około 20 minut, aż próbka zagęści się do 200 μl. Rozcieńczyć próbkę do 10 ml i powtórzyć etap zatężania.
      UWAGA: Z naszego doświadczenia (niepublikowanego) wynika, że imidazol znacząco hamuje aktywność ATPazy CFTR i powinien być usunięty na tym etapie przez rozcieńczenie i zagęszczenie co najmniej dwukrotnie, jeśli próbka będzie używana do pomiarów funkcjonalnych.
    11. Zebrać skoncentrowany oczyszczony CFTR. Przechowywać w temperaturze 4 °C w obecności buforu DDM do czasu użycia w ciągu 1-2 dni lub natychmiast przejść do etapu rekonstytucji. Nie zamrażaj oczyszczonego białka, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że obserwujemy zmniejszoną aktywność.

2. Rekonstrukcja CFTR

  1. Preparat lipidowy
    UWAGA: CFTR został z powodzeniem odtworzony w mieszaninie Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC (1:1 w/w) lub mieszaninie PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w).
    1. W przypadku eksperymentów z wypływem jodku należy wysuszyć 5 mg PC jaj (200 μl z 25 mg/ml bulionu, patrz Tabela materiałów i wyposażenia) pod strumieniem argonu przez 20 minut w temperaturze pokojowej w pyrexie lub innej wytrzymałej (nieborokrzemianowej) szklanej probówce.
    2. Stosując absorbancję przy długości fali 280 nm, test ELISA lub inną metodę, należy oszacować stężenie oczyszczonej próbki białka CFTR. Do eksperymentów z wypływem jodku z CFTR typu dzikiego należy użyć stosunku białka do lipidu 1:300-1:3,000 (w/w), aby wytworzyć wystarczający sygnał. W przypadku G551D- i F508del-CFTR należy użyć stosunku białka do lipidów około 1:200-1:1,200 (w/w) w celu wykrycia aktywności wypływu.
    3. Zoptymalizuj stosunek białka do lipidów dla każdego konkretnego systemu. Obliczyć wymaganą objętość oczyszczonego białka. Obliczyć objętość buforu z 1 mM DDM potrzebną do uzyskania końcowej objętości 1 ml, tj. 1 ml – (wymagana objętość roztworu białkowego) = objętość buforu.
      1. Dodać obliczoną objętość żądanego układu buforowego z 1 mM DDM do wysuszonego lipidu (ale nie dodawać w tym czasie białka CFTR) i przykryć szklaną probówkę Parafilmem. W przypadku eksperymentów z wypływem jodku należy ponownie zawiesić lipidy w buforze 6 (75 mM KI+DDM; patrz Tabela 1). W przypadku innych eksperymentów zawiesić ponownie w buforze 8 (25 mM HEPES+DDM, patrz Tabela 1) lub innym żądanym buforze wewnętrznym zawierającym 1 mM DDM.
      2. Wiruj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby wspomóc zawieszenie lipidów w buforze DDM. Na przemian podgrzewać próbkę do temperatury 37 °C przez 1-2 minuty przed wirowaniem.
    4. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25 G kilkakrotnie zawiesić lipid w temperaturze pokojowej, aż po bokach probówki nie będzie widoczny film lipidowy. Należy unikać wstrzykiwania powietrza do roztworu, które mogłoby wytworzyć drobne pęcherzyki i pomóc w utlenianiu jodku i lipidów.
    5. Sonikować zawieszony lipid w probówce pokrytej Parafilm przez 20 sekund w sonikatorze do kąpieli zawierającym lód, a następnie natychmiast przenieść do lodu na 1 minutę. Powtórz 3 razy.
      UWAGA: Intensywna sonikacja zmienia roztwory jodku na żółknące z powodu utleniania. Dlatego należy unikać nadmiernej sonikacji. Monitoruj próbkę pod kątem zmian koloru. Jeśli zauważy się zmianę koloru, wyrzuć próbkę i przygotuj ponownie. Zmiana koloru spowodowana utlenianiem części jodku spowodowałaby utlenianie lipidów w tych samych warunkach. Wyparcie powietrza z rurki gazowym argonem przed sonikacją roztworu pomoże zapobiec utlenianiu lipidów i jodku. Intensywna sonikacja może zniszczyć szklane rurki o niskiej jakości lub porysowane, powodując utratę próbki.
    6. Dodać objętość oczyszczonego CFTR obliczoną w kroku 2.1.3 do sonikowanej próbki lipidów, aby uzyskać końcową objętość 1 ml. Wymieszać białko z roztworem lipidów i detergentu przez ponowne zawieszenie 10 razy za pomocą igły 25 G i strzykawki o pojemności 1 ml.
    7. Umieść próbkę lipidów i białek na lodzie na 30 minut z obracaniem probówki, aby mieszać 5 razy co 5 minut.
  2. Przygotowanie kolumny wiążącej detergent
    1. Zaopatrz się w jednorazową dostępną w handlu kolumnę wirową wiążącą detergenty (patrz Tabela materiałów i wyposażenia) o pojemności 1 ml i przełam dolną klapkę, aby rozpocząć przepływ kolumny.
    2. Odwirować kolumnę przez 2 minuty przy 2 000 x g w celu usunięcia buforu do przechowywania i wyrzucić ten bufor.
    3. Dodać 5 ml buforu 7 (75 mM KI, patrz tabela 1) do kolumny, a następnie odwirować przy 200 x g przez 4 minuty w celu wymycia buforu do płukania. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy, w sumie 3 prania, aby usunąć wszelkie ślady bufora magazynowego. Odrzuć cały przepływ.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby bufor używany do mycia kolumny NIE zawierał DDM ani żadnego innego detergentu. Kolumna ma skończoną zdolność wiązania detergentu i jeśli używany jest bufor zawierający detergent, kolumna będzie nieskuteczna w usuwaniu detergentu z próbki białkowo-lipidowo-detergentowej.
    4. Ostrożnie podsycić cały 1 ml próbki lipidowo-detergentowo-białkowej na wierzchu żywicy kolumny i inkubować próbkę w górnej części kolumny przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Odwirować próbkę w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 2 000 x g i zebrać mętną próbkę proteoliposomu w czystej probówce do mikrofugu o pojemności 1,5 lub 2 ml lub szklanej probówce i umieścić próbkę na lodzie.
    6. Zebrać pozostałe proteoliposomy w kolumnie, dodając 200 μl buforu 7 (75 mM KI, tabela 1) lub innego buforu (bez detergentu) do górnej części kolumny i powtórzyć etap wirowania przez 2 minuty.
    7. Dodaj drugi eluat do próbki proteoliposomu, jeśli wygląda na mętny.
    8. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez noc lub natychmiast użyć do pomiaru wypływu jodku.

3. Pomiary wypływu jodku dla oczyszczonego, odtworzonego CFTR

  1. Generowanie gradientu jodku w poprzek błony proteoliposomalnej
    1. Wstępnie pęczniejące kulki Sephadex G50 w buforze 9 (75 mM K-Glu; glutaminian potasu, patrz tabela 1) (około 5 g suchych kulek w 50 ml buforu) lub żądanym buforze zewnętrznym w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Przygotować 4 kolumny Sephadex G50 nasycone buforem 9 (75 mM K-Glu, patrz tabela 1) lub innym buforem w małych kolumnach przesiewających, ładując żywicę do co najmniej 3/4 objętości kolumny.
    3. Wirować przez 4 minuty przy 2 000 x g, aby usunąć nadmiar buforu z żywicy. Na końcu etapu wirowania w kolumnie powinno znajdować się około 2,25 ml upakowanej uwodnionej żywicy.
      UWAGA: Żywica powinna być lekko uwodniona, ale nie zanurzona w płynie, a następujące po niej krótkie wirowanie nie powinno wymywać znacznych objętości buforu. Dla pomyślnego wymycia próbki proteoliposomu kluczowe znaczenie ma to, aby żywica kolumnowa nie była ani zbyt mokra, ani zbyt sucha, a użytkownik może być zmuszony do eksperymentowania z kolumnami, aby zapoznać się z najbardziej skutecznymi warunkami wymiany buforu.
    4. Ostrożnie dodać 125-150 μl próbki proteoliposomu na wierzch każdej kolumny i wirować przez 4 minuty przy 2,000 x g.
    5. Pulowy proteoliposom eluuje się razem do natychmiastowego użycia w wypływie jodku lub innych eksperymentach.
      UWAGA: Objętość elucji z każdej kolumny powinna wynosić około 150 μl, a próbka powinna być nieco mętna, ale mniej mętna niż oryginalna próbka. Większe objętości lub klarowne eluaty sugerują, że kolumny nie zostały wystarczająco wysuszone lub zostały odpowiednio wysuszone zbyt mocno, co nie spowoduje udanego eksperymentu z wypływem jodku.
  2. Oznaczenie wypływu jodku
    1. Przemyć mikroelektrodę selektywną jodkiem (Tabela materiałów i wyposażenia) dokładnie wodą dejonizowaną, a następnie inkubować przez 20 minut przed eksperymentem w buforze 10 (15 μM KI, patrz Tabela 1). Ponownie dokładnie umyj elektrodę wodą dejonizowaną.
    2. Dodać 150 μl leku (typowe stężenie 20 μM, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM w teście) w buforze 9 (75 mM K-Glu, patrz tabela 1) lub nośniku w buforze 9 do jednego dołka 96-dołkowej płytki z małym mieszadłem przeciw pchłom.
      1. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Użyj końcówki pipety, aby usunąć zabłąkane pęcherzyki. Jeśli stosowany jest roztwór leku, upewnij się, że końcowe stężenie DMSO w studzience jest mniejsze niż 1% (v/v) (zwykle 0,1-0,2% (v/v)).
    3. Dodać 150 μl odtworzonego białka CFTR, które zostało wytworzone w sekcji 3.1 w buforze 9 (75 mM K-Glu, patrz Tabela 1) do dołka z lekiem lub buforem, aby uzyskać całkowitą objętość 300 μl w dołku płytki.
    4. Umieścić 96-dołkową płytkę na płytce mieszającej i mieszać z prędkością 130 obr./min (lub z umiarkowaną prędkością około 1/4 prędkości maksymalnej).
    5. Ostrożnie włożyć końcówkę elektrody selekcyjnej jodku do studzienki z próbką w taki sposób, aby końcówka nie dotykała dna studzienki ani nie była uderzana przez mieszadło. Upewnij się, że elektroda odniesienia, jeśli jest oddzielna, również styka się z roztworem w studni.
    6. Zapisuj trasy za pomocą domowego lub komercyjnego programu komputerowego, który łączy się z elektrodą (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów i sprzętu). Użyj częstotliwości próbkowania 2 Hz, z filtrowaniem sygnału przez filtr dolnoprzepustowy.
    7. Pozwól próbce zrównoważyć się przez 5 minut, aby uzyskać stabilną płaską lub prawie płaską linię podstawową podczas nagrywania.
    8. Dodać 3 μl MgATP (100 mM zapasu przygotowanego wdH2O i dostosowanego do pH 7 za pomocą KOH; 1 mM stężenie końcowe) do próbki w celu aktywacji białka. Odczekaj ~5 minut, aby osiągnąć nową stabilną linię bazową. Przed użyciem należy zawsze dostosować pH 100 mM MgATP do neutralnego, aby uniknąć zmian pH buforu zewnętrznego.
    9. Dodać 3 μl podstawowego walinomycyny (2 μM; stężenie końcowe 20 nM) do próbki, aby przetoczyć zmiany w różnicy potencjałów generowane przez przewodnictwo selektywne jodkiem przez CFTR. Rejestrować zmniejszające się nachylenie (spadek mV) spowodowane aktywnością jodku za pośrednictwem CFTR przez co najmniej 5 minut.
    10. Aby upewnić się, że uwięzienie jodku w świetle proteoliposomu było wystarczające, dodaj do próbki 3 μl 10% (v/v) Triton X-100. Znaczące i natychmiastowe uwolnienie jodku wskazuje, że wystarczająca ilość jodku została uwięziona w pęcherzykach, tak że uwięzienie nie było czynnikiem ograniczającym zmiany nachylenia określone w ppkt 3.2.9, ale raczej aktywność za pośrednictwem CFTR.
    11. Dokładnie umyj elektrodę i mieszadło wodą dejonizowaną po potraktowaniu próbek lekiem lub Triton X-100, aby upewnić się, że wszystkie ślady tych odczynników zostały usunięte, aby uniknąć zanieczyszczenia następnej próbki.
    12. Przygotować serię rozcieńczonych stężeń KI w zakresie od mikromolowych do nanomolowych w buforze 9 (bufor K-Glu, patrz tabela 1). Zapisać odpowiedź elektrody mV na każde stężenie od 0 do najwyższego przygotowanego stężenia. Skonstruuj krzywą standardową, w której odpowiedź sondy (mV) jest wykreślana vs. log stężenia molowego jodku. Użyj krzywej standardowej, aby przeliczyć odpowiedź mV sondy podczas eksperymentu z wypływem na stężenie uwolnionego jodku.
      UWAGA: Krzywą kalibracyjną należy przygotowywać co tydzień, aż użytkownik będzie pewien, jak szybko zmienia się reakcja sondy. Z czasem nastąpi dryf w odpowiedzi i czułości sondy. Wraz ze starzeniem się sondy odpowiedź będzie się pogarszać. Można to częściowo znieść poprzez okresową wymianę roztworów wewnętrznych i intensywne mycie końcówki sondy w wodzie po użyciu, co prawdopodobnie ogranicza przyleganie cząsteczek do powierzchni sondy.
    13. Określić średnie nachylenie linii wykresu stężenia w funkcji czasu dla każdej próbki proteoliposomu w ciągu ostatnich 30 sekund przed dodaniem MgATP i po dodaniu walinomycyny, ale przed dodaniem Triton X-100. Odejmij nachylenie linii podstawowej od walinomycyny, aby określić aktywność wypływu jodku za pośrednictwem CFTR dla tej próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej publikacji opisano metody oczyszczania, rekonstytucji oraz pomiaru aktywności regulowanych kanałów białka CFTR. Rycina 1a przedstawia schemat procedur oczyszczania, rekonstytucji i odpływu jodków. Metody rekonstytucji oraz pomiary aktywności kanałów za pomocą przepływu jodków zostały szczegółowo omówione w powiązanym materiale wideo.

Oczyszczanie i rekonstytucja CFTR w proteoliposomach

Białko CFTR może być funkcjonalnie ekspresowane na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje ograniczona liczba protokołów oczyszczania dla pełnej, funkcjonalnej izolacji CFTR z różnych komórkowych systemów nadekspresji. Opisana tutaj metoda jest korzystna, ponieważ umożliwia szybkie oczyszczanie Wt-CFTR lub wysokie wzbogacenie F508del- i G551D-CFTR w umiarkowanych ilościach, co jest wysoce funkcjonalne w testach, w tym ATPazie i bezpośrednich pomiarach funkcji kanału, w tym pomiarach jednokanałowych w płaskich układach dwuwarstwowych i zademonstrowanych pomiarach funkcji kanału populacji CFTR, które są...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy przyjmują do wiadomości rady dr Mohabira Ramjeesingha podczas opracowywania opisanych tu metod oczyszczania. Badania te były wspierane przez granty operacyjne dla C.E.B. z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Mukowiscydozy Kanady (CFC). P.D.W.E. było częściowo wspierane przez stypendia przyznawane przez CIHR i CFC. Autorzy przyznają, że dr R. Bridges (Rosalind University of Medicine and Science) dostarcza leki korygujące, wzmacniające i inhibitory, a ich dystrybucją zajmuje się Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Autorzy doceniają również wybitne zasługi Baylor Cell Culture Facility (grant NIH P30 CA125123) w ekspresji Wt i zmutowanego białka CFTR przy użyciu systemu bakulowirusa. Nieaktywny analog VX-770, V-09-1188, był prezentem od Vertex Pharmaceuticals.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
fos-cholina 14 detergentAnatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)F312Affymetrix: Produkty Anatrace; CAS#  :77733-28-9
Kompletne tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy bez EDTARoche (www.roche-applied-science.com)04 693 132 001Tabletki koktajlowe inhibitorów proteazy bez EDTA (1 na 50 ml lub mini: 1 na 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Nr ref.: 11873 580 001)
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, bez EDTA, EASYpack Roche (www.roche-applied-science.com)05 892 791 001
Ni-NTA AgaroseQaigen GmbH1018240
Fisherbrand Kolumny przesiewoweFisher Healthcare11-387-50
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra, Ultracel-100KMillipore (www.millipore.com)UFC910008
Kinaza białkowa A zależna od cAMP (PKA), podjednostkakatalitycznaNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)Peirce PKA nadaje się również
do PC, Jajo kurzeAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)840051C
POPCAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)850457C
PS, Lipidy polarne Porcine BrainAvanti (www.avantilipids.com)840032CCFTR został pomyślnie odtworzony do Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC lub mieszaniny PE:PS:PC:ergosterolu, 5:2:2:1 (w/w)
PE, Jaja kurzeAvanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)841118C
ErgosterolSigma (www.sigmaaldrich.com)45480
Pierce Kolumna wirowa do usuwania detergentuThermo Scientific87779Kolumny o pojemności 1 ml
valinomycynaSigma (www.sigmaaldrich.com)V-0627
VX-770 (ivacaftor)Selleck ChemicalsS1144
jodkowa selektywna mikroelektrodaLazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)LIS-146ICM 
 
 
 
 
 
[nagłówek]
Oprogramowanie Clampex 8.1Axon Instruments (www.axon.com)używamy komponentów systemu ClampX z domowym filtrem do monitorowania i rejestrowania odpowiedzi na naszą elektrodę
Alternatywne oprogramowanie: ArrowLabb System Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)LIS-146LICM-XSLazar Research sprzedaje miernik, który może współpracować z komputerem i oprogramowaniem w celu rejestrowania odpowiedzi sondy. To oprogramowanie powinno pełnić podobną funkcję do naszej konfiguracji.
małe mieszadłaBig Science Inc (www.stirbars.com)SBM-0502-CMBwybierz mieszadło wystarczająco małe, aby łatwo zmieścić się w studzience 96-dołkowej płytki
Sephadex G50, drobneGE Health Care (www.gelifesciences.com)17-0042-01
SonicatorLaboratory Supplies Co, Inc.G112SP1GOdpowiednie powinny być również dźwiękomierze do kąpieli innych producentów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
  2. Bear, C. E., et al. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Cell. 68 (4), 809-818 (1992).
  3. Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants. Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).
  4. Genetic Analysis Consortium. , http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html (1989).
  5. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  6. Yang, Y., et al. Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR. Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).
  7. Mendoza, J. L., et al. Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences. Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).
  8. Rabeh, W. M., et al. Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function. Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).
  9. Aleksandrov, A. A., et al. Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508. CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).
  10. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  11. Riordan, C. R., et al. Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells. J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).
  12. Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae. JoVE. (61), (2012).
  13. Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).
  14. Peng, S., et al. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system. Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).
  15. Ramjeesingh, M., et al. A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).
  16. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).
  17. Ramjeesingh, M., et al. Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).
  18. Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose. Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).
  19. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).
  20. Alkhouri, B., et al. Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).
  21. Eckford, P. D., et al. VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface. Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).
  22. Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR. Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).
  23. Verkman, A. S., Galietta, L. J. Chloride channels as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).
  24. Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease. Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).
  25. Norez, C., et al. Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods. J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).
  26. Whitney, J. C., et al. Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).
  27. Islam, S. T., et al. Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane. mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).
  28. Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).
  29. Wellhauser, L., et al. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).
  30. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).
  31. Chang, X. B., et al. Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites. J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).
  32. Gadsby, D. C., Nairn, A. C. Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation. Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).
  33. Li, C., et al. ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).
  34. Ma, T., et al. Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion. J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).
  35. Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative. J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).
  36. Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts. Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie bia ka CFTRrekonstrukcja w proteoliposomachtest przep ywu jodk waktywno kana u CFTRCFTR typu dzikiegoCFTR F508delCFTR G551Daktywacja zale na od fosforylacjiregulacja nukleotydowaprzesiewanie cz steczek modulatorowych

Powiązane artykuły