Supramolekularny hydrożel do wstrzykiwań i lek do miejscowego wstrzykiwania cewnika do serca świni

Chociaż leczenie ostrego zawału mięśnia sercowego znacznie poprawiło wskaźniki przeżywalności, przewlekła niedokrwienna niewydolność serca jest poważnym problemem zdrowia publicznego, który postępuje wraz ze starzeniem się populacji. W Stanach Zjednoczonych jest około 6 milionów pacjentów z niewydolnością serca, przy czym szacuje się, że częstość występowania wzrośnie o 25% w 2030 r.^1,2. Początkowa utrata tkanki mięśnia sercowego prowadzi do przebudowy serca i ostatecznie powoduje przewlekłą niewydolność serca. Z wyjątkiem przeszczepu serca, nie ma prawdziwego leczenia dla tej grupy pacjentów. Coraz częstsze niedobory serc dawców podkreślają potrzebę opracowania nowych dostępnych terapii, aby odwrócić ten proces przebudowy. Dlatego celem przyszłych terapii jest regeneracja utraconego mięśnia sercowego.

Hydrożele są interesującymi materiałami w dziedzinie medycyny regeneracyjnej ze względu na ich biokompatybilność i wrażliwość na zewnętrzne czynniki^{wyzwalające 3}. Hydrożele do wstrzykiwań mają przewagę nad hydrożelami nieiniekcyjnymi w ich zastosowaniu w chirurgii małoinwazyjnej⁴. Te hydrożele do wstrzykiwań mogą być podawane przez strzykawkę ze względu na ich przełączalność w warunkach fizjologicznych⁵ i zasadniczo pozwalają na wstrzykiwanie za pomocą cewnika⁶. W odniesieniu do materiałów iniekcyjnych zastosowano różne strategie, począwszy od chemicznego sieciowania po wstrzyknięciu, a skończywszy na fizycznym sieciowaniu za pomocą temperatury, pH i rozrzedzania przy ścinaniu^4,7,8. Chociaż kilka systemów wykazało łatwą wstrzykiwalność za pomocą strzykawki^9,10, pełna kompatybilność z cewnikiem nie była często wykazywana⁶.

Hydrożele przygotowane z polimerów supramolekularnych powstają w wyniku oddziaływań niekowalencyjnych, które można wygodnie przełączyć ze stanu żelu na stan roztworu, i odwrotnie za pomocą wyzwalaczy środowiskowych¹¹. Ponadto prekursory o niskiej masie cząsteczkowej pozwalają na łatwe przetwarzanie^12,13. Łagodne warunki wymagane do zmiany pozwalają na dodanie różnych biologicznie aktywnych składników, takich jak często trudne w obsłudze czynniki wzrostu.

Supramolekularne sieci przejściowe w wodzie na bazie poli(glikolu etylenowego) (PEG), ostatecznie modyfikowane ugrupowaniami ureido-pirymidynonu (UPy)¹⁴ wykazały korzyści z interakcji niekowalencyjnych w połączeniu z zastosowaniami biomedycznymi i były używane jako system dostarczania leków w sercu⁶ i pod torebką nerkową¹⁵. Sieci te powstają w wyniku dimeryzacji grup UPy osłoniętych przed środowiskiem wodnym przez przekładki alkilowe tworzące kieszeń hydrofobową. Wiązanie mocznikowo-wodorowe ułatwia późniejsze układanie tych dimerów w nanowłókna. Ze względu na odwracalną interakcję dimera UPy-UPy, wyzwalacze, takie jak pH i temperatura, mogą być używane do przełączania się z roztworów na żele. Zastosowanie motywu syntetycznego pozwala na zaprojektowanie właściwości cząsteczki i żelu, na przykład poprzez dostrojenie długości łańcuchów PEG i dystansów alkilowych^14,16.

Ponadto, kilka składników bioaktywnych można włączyć, po prostu mieszając supramolekularny roztwór hydrożelatora przed wstrzyknięciem, z lekami lub substancjami bioaktywnymi, takimi jak odpowiednio czynniki wzrostu lub egzosomy. Egzosomy to małe pęcherzyki błonowe, które zawierają pochodne cytozolowe. Są wydzielane przez wiele komórek i biorą udział w komunikacji międzykomórkowej. Sugeruje się, że egzosomy pochodzące z komórek progenitorowych kardiomiocytów odgrywają rolę w ochronie serca¹⁷.

Tutaj opisujemy protokół formułowania i iniekcji in vivo mięśnia sercowego takiego bioaktywnego hydrożelu supramolekularnego. Opisano eksperymenty in vitro, które na wstępie wskazują stabilność żelu i uwalnianie leku, co pozwala na dostrojenie właściwości żelu i uwalniania przed zastosowaniem in vivo.

UWAGA: Wszystkie eksperymenty in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Instytutu Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Doświadczalny na Zwierzętach Wydziału Medycyny Uniwersytetu w Utrechcie w Holandii.

1. Formuła hydrożelu

1. Aby przygotować 1 ml żelu o stężeniu 10% wag., rozpuścić 100 mg hydrożelatora UPy w fiolce w 900 μl PBS o pH 11,7, mieszając w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie schłodzić lepki roztwór do temperatury pokojowej. Roztwór powinien mieć teraz pH około 9,0. To rozwiązanie może być przechowywane przez kilka dni.
2. Odpipetować odpowiednią ilość leku lub biomolekuły rozpuszczonej w obojętnym PBS do lepkiego roztworu i mieszać przez 10 minut, aby uzyskać równomierny rozkład. Jeśli roztwór stanie się zbyt lepki, krótko podgrzej go gorącą wodą.
3. Umieść roztwór na 1 godzinę pod lampą UV w celu sterylizacji.

2. Analiza hydrożelu

1. Ocena reologiczna roztworu
   1. Przed załadowaniem żelu zamontuj w reometrze geometrię płytka-płytka 25 mm, ustaw temperaturę na 20 °C i napełnij płytkę wodą, aby zapobiec parowaniu żelu podczas pomiaru.
   2. Odpipetować 300 μl roztworu na płytkę o geometrii 25 mm na reometrze utrzymywanym w temperaturze 20 °C i opuścić płytki, aby uzyskać odstęp 0,5 mm.
   3. Zapisuj lepkość ścinania w funkcji naprężenia ścinającego od 0,1 do 500 Pa z 10 punktami na dekadę.
2. Ocena reologiczna żelu
   1. Odpipetować 300 μl roztworu na płytkę i odpipetować łącznie 4,2 μl 1 M HCl w różnych miejscach roztworu, aby wywołać tworzenie się żelu.
   2. Opuścić płytki na odległość szczeliny 0,5 mm i pozostawić żel do utwardzenia przez około 30 minut. Podczas tego procesu utwardzania należy zmierzyć moduły magazynowania i strat przy niskiej częstotliwości i odkształceniu, na przykład odpowiednio 1 rad/s i 0,5%.
   3. Po utwardzeniu żelu (po około 30 minutach) zapisuj moduły przechowywania i utraty w funkcji częstotliwości (0,1-100 rad/s), a następnie w funkcji odkształcenia (0,1-1,000%).

3. Eksperymenty z erozją i uwalnianiem

1. Przenieść 100 μl lepkiego roztworu zawierającego lek lub biomolekułę do wiszącej wkładki do hodowli komórkowej z poli(tereftalanu etylenu) na 24-dołkową płytkę o wielkości porów 8,0 μm. Aby zapobiec wyciekowi roztworu polimeru w fazie ciekłej, należy pokryć spód wkładek Parafilmem (rysunek 2A).
2. Natychmiast po tym odpipetować 1,4 μl 1 M HCl na wierzch lepkiego roztworu, aby obniżyć pH do około 7,0-7,2 i pozostawić żel do utwardzenia wewnątrz wkładki przez około 30 minut.
3. Usuń Parafilm z wkładek, umieść wkładkę w 24-dołkowej płytce i napełnij studzienkę 800 μl PBS pH 7,4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, wykonując powolne kołysanie lub potrząsanie. Aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika, napełnij pozostałe puste studzienki PBS i uszczelnij 24-dołkową płytkę Parafilmem (rysunek 2B).
4. Okresowo odświeżaj PBS i analizuj usunięty PBS pod kątem uwolnionego produktu erozji UPy lub leku/biomolekuły.
   1. Określ ilościowo produkty erozji UPy lub pirfenidon, mierząc absorbancję UV odpowiednio przy 265 nm lub 320 nm. Dla białka fluorescencyjnego mRuby2 zmierz emisję fluorescencji przy 587 nm po wzbudzeniu przy 559 nm.
   2. Przelicz zmierzone wartości absorpcji/emisji na stężenia za pomocą wcześniej określonych krzywych kalibracyjnych.
      1. Przygotować krzywe kalibracyjne rozpuszczające serię znanych stężeń analitu w buforze i zmierzyć absorbancję UV lub emisję fluorescencyjną tych próbek. Interpoluj dane za pomocą funkcji liniowej, aby określić stężenie nieznanych próbek. W przypadku białek niefluorescencyjnych należy zastosować detekcję ELISA⁶.

4. Miejscowe wstrzyknięcie przez cewnik

1. Indukcja zawału mięśnia sercowego
   1. Po 12 godzinach postu, z wyłączeniem wody, uspokoić świnię w stajni, wstrzykując domięśniowo midazolam 0,4 mg/kg, ketaminę 10 mg/kg i atropinę 0,014 mg/kg.
   2. Podawać dożylnie tiopental sodu w dawce 5 mg/kg mc. w celu wywołania znieczulenia i zaintubować świnię rurką dotchawiczą. W razie potrzeby należy przeprowadzić wentylację balonową z szybkością 12/min podczas transportu zwierzęcia na salę operacyjną.
   3. Po przybyciu na salę operacyjną natychmiast uruchomić mechaniczną wentylację nadciśnieniową o FiO₂ 0,50, objętości oddechowej 10 ml/kg i częstotliwości 12/min pod ciągłą kapnografią. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
   4. Znieczulenie zrównoważone należy rozpocząć od ciągłego wlewu dożylnego midazolamu w dawce 0,5 mg/kg mc./godz., sufentanylu w dawce 2,5 μg/kg mc./godz. i bromku pankuronium w dawce 0,1 mg/kg mc./godz. Aby zapewnić prawidłowe znieczulenie, należy stale monitorować EKG, ciśnienie tętnicze krwi, temperaturę i kapnografię.
   5. Podać dożylnie 4,3 mg/kg amiodaronu i umieścić cewnik do defibrylacji wewnątrzsercowej w prawej komorze za pomocą arkusza żylnego¹⁸.
   6. Niedrożność lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) dystalnie do drugiej gałęzi ukośnej za pomocą wewnątrzwieńcowej niedrożności balonu przez 90 minut, zgodnie z wcześniej opisanym protokołem¹⁸.
2. Mapowanie elektromechaniczne
   1. Po czterech tygodniach od zawału mięśnia sercowego zaplanuj procedurę mapowania. Przygotuj system (ryc. 4) w pracowni cewnika do elektromechanicznego mapowania 3D (EMM) lewej komory. Dzięki temu systemowi można zidentyfikować hibernujący i zawał mięśnia sercowego bez kontroli fluoroskopowej. Aby skonstruować taką mapę elektromagnetyczną, należy uzyskać serię punktów w wielu miejscach na powierzchni wsierdzia lewej wysokości, wykorzystując źródło energii pola magnetycznego o bardzo niskim poziomie i cewnik z końcówką czujnika^19,20.
   2. Znieczulić świnię, postępując zgodnie z krokami protokołu 4.1.1-4.1.4.
   3. Umieść zewnętrzną naszywkę odniesienia na grzbiecie świni.
   4. Zabezpiecz dostęp naczyniowy (tętnicę udową) zgodnie z protokołem¹⁸.
   5. Po uzyskaniu dwupłaszczyznowego angiogramu lewej komory w widoku 25° prawego skośnego przedniego (RAO) i 40° lewego skośnego przedniego (LA) w celu oszacowania wielkości lewej komory, należy podać 75 U/kg heparyny.
   6. Przesunąć cewnik z mapowaniem francuskim 8 (krzywa D lub F) pod kierunkiem fluoroskopowym do aorty zstępującej, łuku aorty i przez zastawkę aortalną do lewej komory (LV).
   7. Zorientuj końcówkę cewnika do wierzchołka lewej komory, aby uzyskać pierwsze dane, a następnie drogę odpływu, punkty boczne i tylne, aby utworzyć sylwetkę 3D, określającą granice komory.
   8. Uzyskiwać kolejne punkty, aż wszystkie segmenty wsierdzia zostaną pobrane, przeciągając cewnik mapujący nad wsierdziem i sekwencyjnie uzyskując położenie końcówki w kontakcie z wsierdziem^21,22.
   9. Zdefiniuj obszar docelowy, czyli obszar, w którym aktywność elektryczna jest (prawie) normalna, a ruch mechaniczny upośledzony, tzw. hibernujący mięsień sercowy (ryc. 6).
3. Iniekcja domięśniowa
   1. Zastąp cewnik mapujący cewnikiem do iniekcji domięśniowej serca, który składa się z igły o rozmiarze 27 i światła rdzenia wewnątrz cewnika francuskiego 8 (ryc. 5A i B). Aby dostarczyć określone ilości, należy naładować strzykawkę o stopniowanej objętości około 2 ml roztworu hydrożelu i umieścić ją w pompie strzykawkowej.
   2. Wyregulować przedłużenie igły pod kątem 0° i 90° i umieścić 0,1 ml roztworu hydrożelu, aby wypełnić martwe miejsce igły. Następnie umieścić końcówkę cewnika iniekcyjnego w poprzek zastawki aortalnej i w obszarze docelowym.
   3. Spełniać następujące kryteria dla pozycji iniekcji wewnątrz obszaru docelowego, określone w ppkt 4.2.9: 1) prostopadłe położenie cewnika do ściany lewej kominy; (2) doskonała stabilność pętli (<4 mm) zgodnie z obliczeniami systemu emm; oraz (3) napięcie podstawowe>6,9 mV²¹.
      1. Wsunąć igłę do mięśnia sercowego (4) potwierdzone przedwczesnym skurczem komorowym lewej żyły, i wstrzyknąć 0,1-0,3 ml hydrożelu w bolusie ze stałą szybkością około 0,4-0,5 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej. Powtórz to w 6-10 różnych pozycjach, tak rozproszonych, jak to możliwe. Naturalne pH tkanki zneutralizuje roztwór po wstrzyknięciu, po którym powstaje hydrożel.
4. poświęcenie
   1. Po zabiegu humanitarnie złożyć zwierzę w ofierze przez wykrwawienie. Przetnij dolną żyłę jamy głównej i usuń krew za pomocą urządzenia ssącego. Wywołaj migotanie komór, umieszczając baterię 9 V na wierzchołku.

Typowe wyniki uzyskane z oscylacyjnych pomiarów reologicznych zarówno roztworu, jak i żelu są pokazane na rysunku 1. Do wstrzykiwań przez długi cewnik pożądany jest płyn newtonowski o niskiej lepkości. Lepkość mierzono w funkcji szybkości ścinania, wykazując, że przy pH 8,5 roztwór jest rozrzedzany przy ścinaniu, ale przy pH 9,0 i 9,5 roztwory zachowują się jak płyny newtonowskie, o czym świadczy stała lepkość wynosząca odpowiednio 0,54 i 0,36 Pa·s (rysunek 1A). Po zobojętnieniu próbek, próbki wykazują reakcję podobną do ciała stałego obserwowaną przez moduł magazynowania G′, który jest większy niż moduł strat G", a zatem tanδ = G"/G′ <1 (rysunek 1B). Żel osiąga ostateczną wytrzymałość w ciągu 30 minut. Oscylacyjne pomiary reologiczne wykazują typową reakcję podobną do ciała stałego, przy czym G′ jest prawie niezależny od częstotliwości kątowej i G′ >G" dla wszystkich mierzonych częstotliwości (rysunek 1C).

Niezbędne do użycia jako system dostarczania leków jest erozja hydrożelu w miarę upływu czasu. Oddziaływania supramolekularne są z natury dynamiczne i pozwalają na powolną erozję żelu in vitro. Eksperymenty z erozją i uwalnianiem przeprowadza się w temperaturze 37 °C przy użyciu porowatych wkładów studziennych (rys. 2A i B). Dostrajając długość hydrofobowego i hydrofilowego bloku14, można uzyskać żel, który ulega erozji w ciągu kilku tygodni (ryc. 3A). Żel ulega erozji o 25% w ciągu 2 tygodni z początkową erozją o 10% w pierwszym dniu, prawdopodobnie z powodu początkowego obrzęku hydrożelu. Na przykład badano zarówno uwalnianie leku małocząsteczkowego (pirfenidon), jak i uwalnianie modelowego białka fluorescencyjnego (mRuby2). Białko modelu fluorescencyjnego pozwala na łatwy odczyt; jednak eksperymenty uwalniania in vitro można również przeprowadzić na innych białkach przy użyciu testu ELISA do oznaczania ilościowego6. Lek małocząsteczkowy jest uwalniany w ciągu jednego dnia, podczas gdy większe cząsteczki, takie jak białka, są stopniowo uwalniane w ciągu 1 tygodnia (ryc. 3B). Dopasowanie profilu uwalniania mRuby2 do 60% uwalniania do półempirycznego modelu Korsmeyera-Peppasa wskazuje na uwolnienie w wyniku dyfuzji (n = 0,44)23. Brak przesunięcia w (dostosowanym) modelu Korsmeyera-Peppasa pokazuje, że dla mRuby224 nie występuje uwolnienie impulsu. Ze względu na ograniczoną liczbę punktów danych, w których uwalnianie jest mniejsze niż 60% dla pirfenidonu, nie przeprowadzono dopasowania do tego profilu uwalniania.

System nawigacji cewnika składa się z konsoli jednostki komunikacyjnej, stacji roboczej (Rysunek 4), trójkątnej podkładki lokalizacyjnej (generującej niskie pole magnetyczne) z zewnętrznym plastrem referencyjnym oraz dwóch cewników, mapowania z końcówką czujnika i cewnika iniekcyjnego (Rysunek 5).

Po przefiltrowaniu niestabilnych punktów przez analizę po przetworzeniu, rekonstrukcja 3D wsierdzia LV jest aktualizowana w czasie rzeczywistym wraz z akwizycją każdego nowego punktu danych i jest stale wyświetlana jako jednobiegunowe i dwubiegunowe potencjały napięciowe na stopniowanej skali kolorów (Rysunek 6A). Funkcja lokalnego skracania liniowego (LLS) określa ilościowo regionalny ruch ściany, uzyskując średnią zmianę odległości między miejscem próbki a sąsiednimi punktami w skurczu końcowym i rozkurczu końcowym. Średnie wartości napięcia i LLS są obliczane dla każdego segmentu i wyświetlane na mapie biegunowej. (Rysunek 6B). Obecność nieprawidłowego lub niskiego potencjału jednobiegunowego (≤6 mV) i upośledzonej aktywności mechanicznej (LLS ≤4%) charakteryzuje obszary zawałowe22.

Rysunek 1:. Ocena reologiczna roztworów i żeli. (A) Lepkość w funkcji szybkości ścinania roztworów o różnym pH. Dla próbki o pH 8,5 obserwuje się rozrzedzenie ścinające, ale dla próbek o pH 9,0 i 9,5 uzyskuje się stałą lepkość, co pokazuje newtonowskie zachowanie tych roztworów. (B) Utwardzanie żelem, a następnie wykreślanie δ opalenizny w funkcji czasu. (C) Przemiatanie częstotliwości dla zneutralizowanej próbki po 2 godzinach utwardzania. Słupki błędów pokazują odchylenia standardowe 3 niezależnych pomiarów, wskazując na typowy błąd eksperymentalny.

Rysunek 2: Konfiguracja eksperymentów z degradacją i wydaniem. (A) Wkładka studzienkowa z poli(tereftalanu etylenu) pokryta Parafilmem, aby zapobiec wyciekom podczas przygotowania. (B) Płytka 24-dołkowa z wkładkami, owinięta parafilmem, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika.

Rysunek 3: Erozja i uwalnianie. (A) Erozja hydrożelu w czasie. Obserwuje się stopniową erozję żelu przez co najmniej 2 tygodnie. (B) Uwolnienie leku małocząsteczkowego i białka modelowego. Podczas gdy mała cząsteczka jest uwalniana w ciągu jednego dnia, białko modelowe jest stopniowo uwalniane w ciągu tygodnia bez znaczącego uwolnienia impulsowego. Linia pokazuje dopasowanie modelu Korsmeyer-Peppas do początkowej fazy wydania.

Rysunek 4: System nawigacji cewnika. Konsola jednostki komunikacyjnej z systemem nawigacji kardiologicznej NOGA XP.

Rycina 5: (A) Cewnik do iniekcji domięśniowej mięśnia sercowego z dołączoną strzykawką. (B) Szczegół igły do wstrzykiwań.

Rysunek 6: Mapa napięcia unipolarnego i LLS. (A) Mapa jednobiegunowa, widok LAO (na górze) i strzał w dziesiątkę (na dole). Kolor czerwony oznacza niskie jednobiegunowe wartości napięcia u podstawy mięśnia sercowego (normalne) z utratą aktywności elektrycznej tylno-bocznej. Niebieski oznacza normalny mięsień sercowy, podczas gdy zielony i żółty kolory wskazują na zmniejszoną żywotność. (B) Mapa LLS, widok LAO (na górze) i strzał w dziesiątkę (poniżej). Kolor czerwony oznacza akinezję w ścianie tylno-bocznej, zielony i żółty oznaczają zmniejszony ruch ściany. Punkty mapowania są oznaczone białymi kropkami. Narysowana biała linia pokazuje obszar zainteresowania, charakteryzujący się obniżonymi napięciami unipolarnymi i upośledzonymi ruchami ścian. Brązowe punkty reprezentują miejsca wstrzyknięcia.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.