Artykuł metodologiczny

Supramolekularny hydrożel do wstrzykiwań i lek do miejscowego wstrzykiwania cewnika do serca świni

17.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52450

⸱

7 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Laboratory of Chemical Biology, Eindhoven University of Technology, 2Department of Cardiology, Division Heart and Lungs, Interuniversity Cardiology Institute of the Netherlands (ICIN), University Medical Center Utrecht

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Supramolekularne hydrożelatory oparte na ureido-pirymidynonach pozwalają na pełną kontrolę nad makroskopowymi właściwościami żelu i zachowaniem zol – żel za pomocą pH. W tym miejscu przedstawiamy protokół formułowania i wstrzykiwania takiego supramolekularnego hydrożelatora za pomocą systemu dostarczania cewnika do miejscowego dostarczania bezpośrednio w odpowiednie obszary serca świni.

Streszczenie

Regeneracja utraconego mięśnia sercowego jest ważnym celem dla przyszłych terapii ze względu na coraz częstsze występowanie przewlekłej niedokrwiennej niewydolności serca i ograniczony dostęp do serc dawców. Przykładem leczenia mającego na celu przywrócenie funkcji serca jest miejscowe dostarczanie leków i substancji bioaktywnych z hydrożelu. W niniejszej pracy przedstawiono metodę formułowania i wstrzykiwania hydrożelu z lekiem w sposób nieinwazyjny i swoisty dla stron trzecich do serca świni za pomocą długiego, elastycznego cewnika. Zastosowanie elektromechanicznego mapowania 3D i iniekcji za pomocą cewnika pozwala na leczenie mięśnia sercowego specyficzne dla boku. Aby zapewnić hydrożel kompatybilny z tym cewnikiem, stosuje się hydrożel supramolekularny ze względu na wygodne przełączanie ze stanu żelu do stanu roztworu za pomocą wyzwalaczy środowiskowych. Przy zasadowym pH ten modyfikowany ureido-pirymidynonem poli(glikol etylenowy) działa jak płyn newtonowski, który można łatwo wstrzyknąć, ale przy fizjologicznym pH roztwór szybko zamienia się w żel. Te łagodne warunki przełączania pozwalają na włączenie leków bioaktywnych i gatunków bioaktywnych, takich jak czynniki wzrostu i egzosomy, co prezentujemy tutaj zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo. Eksperymenty in vitro dają bezpośrednie wskazanie stabilności żelu i uwalniania leku, co pozwala na dostrojenie właściwości żelu i uwalniania przed późniejszym zastosowaniem in vivo. Takie połączenie pozwala na optymalne dostrojenie żelu do stosowanych związków i gatunków bioaktywnych oraz systemu iniekcyjnego.

Wprowadzenie

Chociaż leczenie ostrego zawału mięśnia sercowego znacznie poprawiło wskaźniki przeżywalności, przewlekła niedokrwienna niewydolność serca jest poważnym problemem zdrowia publicznego, który postępuje wraz ze starzeniem się populacji. W Stanach Zjednoczonych jest około 6 milionów pacjentów z niewydolnością serca, przy czym szacuje się, że częstość występowania wzrośnie o 25% w 2030 r.1,2. Początkowa utrata tkanki mięśnia sercowego prowadzi do przebudowy serca i ostatecznie powoduje przewlekłą niewydolność serca. Z wyjątkiem przeszczepu serca, nie ma prawdziwego leczenia dla tej grupy pacjentów. Coraz częstsze niedobory serc dawców podkreślają potrzebę opracowania nowych dostępnych terapii, aby odwrócić ten proces przebudowy. Dlatego celem przyszłych terapii jest regeneracja utraconego mięśnia sercowego.

Hydrożele są interesującymi materiałami w dziedzinie medycyny regeneracyjnej ze względu na ich biokompatybilność i wrażliwość na zewnętrzne czynnikiwyzwalające 3. Hydrożele do wstrzykiwań mają przewagę nad hydrożelami nieiniekcyjnymi w ich zastosowaniu w chirurgii małoinwazyjnej4. Te hydrożele do wstrzykiwań mogą być podawane przez strzykawkę ze względu na ich przełączalność w warunkach fizjologicznych5 i zasadniczo pozwalają na wstrzykiwanie za pomocą cewnika6. W odniesieniu do materiałów iniekcyjnych zastosowano różne strategie, począwszy od chemicznego sieciowania po wstrzyknięciu, a skończywszy na fizycznym sieciowaniu za pomocą temperatury, pH i rozrzedzania przy ścinaniu4,7,8. Chociaż kilka systemów wykazało łatwą wstrzykiwalność za pomocą strzykawki9,10, pełna kompatybilność z cewnikiem nie była często wykazywana6.

Hydrożele przygotowane z polimerów supramolekularnych powstają w wyniku oddziaływań niekowalencyjnych, które można wygodnie przełączyć ze stanu żelu na stan roztworu, i odwrotnie za pomocą wyzwalaczy środowiskowych11. Ponadto prekursory o niskiej masie cząsteczkowej pozwalają na łatwe przetwarzanie12,13. Łagodne warunki wymagane do zmiany pozwalają na dodanie różnych biologicznie aktywnych składników, takich jak często trudne w obsłudze czynniki wzrostu.

Supramolekularne sieci przejściowe w wodzie na bazie poli(glikolu etylenowego) (PEG), ostatecznie modyfikowane ugrupowaniami ureido-pirymidynonu (UPy)14 wykazały korzyści z interakcji niekowalencyjnych w połączeniu z zastosowaniami biomedycznymi i były używane jako system dostarczania leków w sercu6 i pod torebką nerkową15. Sieci te powstają w wyniku dimeryzacji grup UPy osłoniętych przed środowiskiem wodnym przez przekładki alkilowe tworzące kieszeń hydrofobową. Wiązanie mocznikowo-wodorowe ułatwia późniejsze układanie tych dimerów w nanowłókna. Ze względu na odwracalną interakcję dimera UPy-UPy, wyzwalacze, takie jak pH i temperatura, mogą być używane do przełączania się z roztworów na żele. Zastosowanie motywu syntetycznego pozwala na zaprojektowanie właściwości cząsteczki i żelu, na przykład poprzez dostrojenie długości łańcuchów PEG i dystansów alkilowych14,16.

Ponadto, kilka składników bioaktywnych można włączyć, po prostu mieszając supramolekularny roztwór hydrożelatora przed wstrzyknięciem, z lekami lub substancjami bioaktywnymi, takimi jak odpowiednio czynniki wzrostu lub egzosomy. Egzosomy to małe pęcherzyki błonowe, które zawierają pochodne cytozolowe. Są wydzielane przez wiele komórek i biorą udział w komunikacji międzykomórkowej. Sugeruje się, że egzosomy pochodzące z komórek progenitorowych kardiomiocytów odgrywają rolę w ochronie serca17.

Tutaj opisujemy protokół formułowania i iniekcji in vivo mięśnia sercowego takiego bioaktywnego hydrożelu supramolekularnego. Opisano eksperymenty in vitro, które na wstępie wskazują stabilność żelu i uwalnianie leku, co pozwala na dostrojenie właściwości żelu i uwalniania przed zastosowaniem in vivo.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych Instytutu Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Doświadczalny na Zwierzętach Wydziału Medycyny Uniwersytetu w Utrechcie w Holandii.

1. Formuła hydrożelu

  1. Aby przygotować 1 ml żelu o stężeniu 10% wag., rozpuścić 100 mg hydrożelatora UPy w fiolce w 900 μl PBS o pH 11,7, mieszając w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie schłodzić lepki roztwór do temperatury pokojowej. Roztwór powinien mieć teraz pH około 9,0. To rozwiązanie może być przechowywane przez kilka dni.
  2. Odpipetować odpowiednią ilość leku lub biomolekuły rozpuszczonej w obojętnym PBS do lepkiego roztworu i mieszać przez 10 minut, aby uzyskać równomierny rozkład. Jeśli roztwór stanie się zbyt lepki, krótko podgrzej go gorącą wodą.
  3. Umieść roztwór na 1 godzinę pod lampą UV w celu sterylizacji.

2. Analiza hydrożelu

  1. Ocena reologiczna roztworu
    1. Przed załadowaniem żelu zamontuj w reometrze geometrię płytka-płytka 25 mm, ustaw temperaturę na 20 °C i napełnij płytkę wodą, aby zapobiec parowaniu żelu podczas pomiaru.
    2. Odpipetować 300 μl roztworu na płytkę o geometrii 25 mm na reometrze utrzymywanym w temperaturze 20 °C i opuścić płytki, aby uzyskać odstęp 0,5 mm.
    3. Zapisuj lepkość ścinania w funkcji naprężenia ścinającego od 0,1 do 500 Pa z 10 punktami na dekadę.
  2. Ocena reologiczna żelu
    1. Odpipetować 300 μl roztworu na płytkę i odpipetować łącznie 4,2 μl 1 M HCl w różnych miejscach roztworu, aby wywołać tworzenie się żelu.
    2. Opuścić płytki na odległość szczeliny 0,5 mm i pozostawić żel do utwardzenia przez około 30 minut. Podczas tego procesu utwardzania należy zmierzyć moduły magazynowania i strat przy niskiej częstotliwości i odkształceniu, na przykład odpowiednio 1 rad/s i 0,5%.
    3. Po utwardzeniu żelu (po około 30 minutach) zapisuj moduły przechowywania i utraty w funkcji częstotliwości (0,1-100 rad/s), a następnie w funkcji odkształcenia (0,1-1,000%).

3. Eksperymenty z erozją i uwalnianiem

  1. Przenieść 100 μl lepkiego roztworu zawierającego lek lub biomolekułę do wiszącej wkładki do hodowli komórkowej z poli(tereftalanu etylenu) na 24-dołkową płytkę o wielkości porów 8,0 μm. Aby zapobiec wyciekowi roztworu polimeru w fazie ciekłej, należy pokryć spód wkładek Parafilmem (rysunek 2A).
  2. Natychmiast po tym odpipetować 1,4 μl 1 M HCl na wierzch lepkiego roztworu, aby obniżyć pH do około 7,0-7,2 i pozostawić żel do utwardzenia wewnątrz wkładki przez około 30 minut.
  3. Usuń Parafilm z wkładek, umieść wkładkę w 24-dołkowej płytce i napełnij studzienkę 800 μl PBS pH 7,4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, wykonując powolne kołysanie lub potrząsanie. Aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika, napełnij pozostałe puste studzienki PBS i uszczelnij 24-dołkową płytkę Parafilmem (rysunek 2B).
  4. Okresowo odświeżaj PBS i analizuj usunięty PBS pod kątem uwolnionego produktu erozji UPy lub leku/biomolekuły.
    1. Określ ilościowo produkty erozji UPy lub pirfenidon, mierząc absorbancję UV odpowiednio przy 265 nm lub 320 nm. Dla białka fluorescencyjnego mRuby2 zmierz emisję fluorescencji przy 587 nm po wzbudzeniu przy 559 nm.
    2. Przelicz zmierzone wartości absorpcji/emisji na stężenia za pomocą wcześniej określonych krzywych kalibracyjnych.
      1. Przygotować krzywe kalibracyjne rozpuszczające serię znanych stężeń analitu w buforze i zmierzyć absorbancję UV lub emisję fluorescencyjną tych próbek. Interpoluj dane za pomocą funkcji liniowej, aby określić stężenie nieznanych próbek. W przypadku białek niefluorescencyjnych należy zastosować detekcję ELISA6.

4. Miejscowe wstrzyknięcie przez cewnik

  1. Indukcja zawału mięśnia sercowego
    1. Po 12 godzinach postu, z wyłączeniem wody, uspokoić świnię w stajni, wstrzykując domięśniowo midazolam 0,4 mg/kg, ketaminę 10 mg/kg i atropinę 0,014 mg/kg.
    2. Podawać dożylnie tiopental sodu w dawce 5 mg/kg mc. w celu wywołania znieczulenia i zaintubować świnię rurką dotchawiczą. W razie potrzeby należy przeprowadzić wentylację balonową z szybkością 12/min podczas transportu zwierzęcia na salę operacyjną.
    3. Po przybyciu na salę operacyjną natychmiast uruchomić mechaniczną wentylację nadciśnieniową o FiO2 0,50, objętości oddechowej 10 ml/kg i częstotliwości 12/min pod ciągłą kapnografią. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
    4. Znieczulenie zrównoważone należy rozpocząć od ciągłego wlewu dożylnego midazolamu w dawce 0,5 mg/kg mc./godz., sufentanylu w dawce 2,5 μg/kg mc./godz. i bromku pankuronium w dawce 0,1 mg/kg mc./godz. Aby zapewnić prawidłowe znieczulenie, należy stale monitorować EKG, ciśnienie tętnicze krwi, temperaturę i kapnografię.
    5. Podać dożylnie 4,3 mg/kg amiodaronu i umieścić cewnik do defibrylacji wewnątrzsercowej w prawej komorze za pomocą arkusza żylnego18.
    6. Niedrożność lewej przedniej tętnicy zstępującej (LAD) dystalnie do drugiej gałęzi ukośnej za pomocą wewnątrzwieńcowej niedrożności balonu przez 90 minut, zgodnie z wcześniej opisanym protokołem18.
  2. Mapowanie elektromechaniczne
    1. Po czterech tygodniach od zawału mięśnia sercowego zaplanuj procedurę mapowania. Przygotuj system (ryc. 4) w pracowni cewnika do elektromechanicznego mapowania 3D (EMM) lewej komory. Dzięki temu systemowi można zidentyfikować hibernujący i zawał mięśnia sercowego bez kontroli fluoroskopowej. Aby skonstruować taką mapę elektromagnetyczną, należy uzyskać serię punktów w wielu miejscach na powierzchni wsierdzia lewej wysokości, wykorzystując źródło energii pola magnetycznego o bardzo niskim poziomie i cewnik z końcówką czujnika19,20.
    2. Znieczulić świnię, postępując zgodnie z krokami protokołu 4.1.1-4.1.4.
    3. Umieść zewnętrzną naszywkę odniesienia na grzbiecie świni.
    4. Zabezpiecz dostęp naczyniowy (tętnicę udową) zgodnie z protokołem18.
    5. Po uzyskaniu dwupłaszczyznowego angiogramu lewej komory w widoku 25° prawego skośnego przedniego (RAO) i 40° lewego skośnego przedniego (LA) w celu oszacowania wielkości lewej komory, należy podać 75 U/kg heparyny.
    6. Przesunąć cewnik z mapowaniem francuskim 8 (krzywa D lub F) pod kierunkiem fluoroskopowym do aorty zstępującej, łuku aorty i przez zastawkę aortalną do lewej komory (LV).
    7. Zorientuj końcówkę cewnika do wierzchołka lewej komory, aby uzyskać pierwsze dane, a następnie drogę odpływu, punkty boczne i tylne, aby utworzyć sylwetkę 3D, określającą granice komory.
    8. Uzyskiwać kolejne punkty, aż wszystkie segmenty wsierdzia zostaną pobrane, przeciągając cewnik mapujący nad wsierdziem i sekwencyjnie uzyskując położenie końcówki w kontakcie z wsierdziem21,22.
    9. Zdefiniuj obszar docelowy, czyli obszar, w którym aktywność elektryczna jest (prawie) normalna, a ruch mechaniczny upośledzony, tzw. hibernujący mięsień sercowy (ryc. 6).
  3. Iniekcja domięśniowa
    1. Zastąp cewnik mapujący cewnikiem do iniekcji domięśniowej serca, który składa się z igły o rozmiarze 27 i światła rdzenia wewnątrz cewnika francuskiego 8 (ryc. 5A i B). Aby dostarczyć określone ilości, należy naładować strzykawkę o stopniowanej objętości około 2 ml roztworu hydrożelu i umieścić ją w pompie strzykawkowej.
    2. Wyregulować przedłużenie igły pod kątem 0° i 90° i umieścić 0,1 ml roztworu hydrożelu, aby wypełnić martwe miejsce igły. Następnie umieścić końcówkę cewnika iniekcyjnego w poprzek zastawki aortalnej i w obszarze docelowym.
    3. Spełniać następujące kryteria dla pozycji iniekcji wewnątrz obszaru docelowego, określone w ppkt 4.2.9: 1) prostopadłe położenie cewnika do ściany lewej kominy; (2) doskonała stabilność pętli (<4 mm) zgodnie z obliczeniami systemu EMM; oraz (3) napięcie podstawowe >6,9 mV21.
      1. Wsunąć igłę do mięśnia sercowego (4) potwierdzone przedwczesnym skurczem komorowym lewej żyły, i wstrzyknąć 0,1-0,3 ml hydrożelu w bolusie ze stałą szybkością około 0,4-0,5 ml/min za pomocą pompy strzykawkowej. Powtórz to w 6-10 różnych pozycjach, tak rozproszonych, jak to możliwe. Naturalne pH tkanki zneutralizuje roztwór po wstrzyknięciu, po którym powstaje hydrożel.
  4. poświęcenie
    1. Po zabiegu humanitarnie złożyć zwierzę w ofierze przez wykrwawienie. Przetnij dolną żyłę jamy głównej i usuń krew za pomocą urządzenia ssącego. Wywołaj migotanie komór, umieszczając baterię 9 V na wierzchołku.

Wyniki

Typowe wyniki uzyskane z oscylacyjnych pomiarów reologicznych zarówno dla roztworu, jak i żelu, przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku wtryskiwania przez długi cewnik pożądany jest płyn newtonowski o niskiej lepkości. Lepkość mierzono jako funkcję szybkości ścinania, co wykazało, że przy pH 8,5 roztwór wykazuje pseudoplastyczność (rozrzedzanie ścinaniem), natomiast przy pH 9,0 i 9,5 roztwory zachowują się jak płyny newtonowskie, o czym świadczy stała lepkość wynosząca odpowiednio 0,54 i 0,36 Pa·sec (Rysunek 1A). Po zneutralizowaniu próbek, wykazują one odpowiedź charakterystyczną dla ciał stałych, co objawia się modułem zachowawczym G′ większym od modułu strat G″, a tym samym tanδ = G″/G′ <1 (Rysunek 1B). Żel osiąga ostateczną wytrzymałość w ciągu 30 minut. Oscylacyjne pomiary reologiczne wykazują typową odpowiedź ciała stałego, w której G′ jest niemal niezależny od częstotliwości kątowej, a G′ >G″ dla wszystkich mierzonych częstotliwości (Rysunek 1C).

Kluczowym elementem wykorzystania hydrożelu jako systemu dostarczania leków jest jego stopniowa erozja w czasie. Oddziaływania supramolekularne są z natury dynamiczne, co umożliwia powolną erozję żelu in vitro. Eksperymenty dotyczące erozji i uwalniania prowadzone są w temperaturze 37 °C z wykorzystaniem porowatych wkładów do studzienek (Rysunek 2A i B). Poprzez regulację długości bloków hydrofobowego i hydrofilowego14, można uzyskać żel, który ulega erozji w okresie kilku tygodni (Rysunek 3A). Żel ulega erozji w 25% w ciągu 2 tygodni, przy początkowej erozji na poziomie 10% w pierwszym dniu, co prawdopodobnie wynika z początkowego pęcznienia hydrożelu. Przykładowo, zbadano uwalnianie leku o małej cząsteczce (pirfenidonu) oraz uwalnianie modelowego białka fluorescencyjnego (mRuby2). Modelowe białko fluorescencyjne pozwala na łatwy odczyt; jednak doświadczenia z uwalnianiem in vitro można przeprowadzić również na innych białkach, wykorzystując metodę ELISA do ich ilościowego oznaczenia6. Lek o małej cząsteczce uwalnia się w ciągu jednego dnia, podczas gdy większe cząsteczki, takie jak białka, są uwalniane stopniowo w ciągu 1 tygodnia (Rysunek 3B). Dopasowanie profilu uwalniania mRuby2 do poziomu 60% za pomocą półempirycznego modelu Korsmeyera-Peppasa wskazuje na uwalnianie sterowane dyfuzją (n = 0,44)23. Brak przesunięcia (offsetu) w (zaadaptowanym) modelu Korsmeyera-Peppasa pokazuje, że w przypadku mRuby2 nie występuje gwałtowne uwalnianie początkowe (burst release)24. Ze względu na ograniczoną liczbę punktów danych przy uwalnianiu poniżej 60% dla pirfenidonu, nie przeprowadzono dopasowania dla tego profilu uwalniania.

System nawigacji cewnika składa się z konsoli jednostki komunikacyjnej, stacji roboczej (Rysunek 4), trójkątnej podkładki lokalizacyjnej (generującej słabe pole magnetyczne) z zewnętrznym plastrem referencyjnym oraz dwóch cewników: mapującego z czujnikiem na końcówce i cewnika do iniekcji (Rysunek 5).

Po przeprowadzeniu analizy w przetwarzaniu końcowym, która odfiltrowała punkty niestabilne, trójwymiarowa rekonstrukcja endokardium LV jest aktualizowana w czasie rzeczywistym wraz z pozyskiwaniem każdego nowego punktu danych i jest stale wyświetlana jako jednobiegunowe i dwubiegunowe potencjały napięcia na stopniowanej skali kolorystycznej (Rysunek 6A). Funkcja lokalnego skrócenia liniowego (LLS) kwantyfikuje regionalny ruch ścian poprzez wyznaczenie średniej zmiany odległości między miejscem poboru próby a punktami sąsiednimi w końcowej fazie skurczu i końcowej fazie rozkurczu. Średnie wartości napięcia i LLS są obliczane dla każdego segmentu i wyświetlane na mapie polarnej (Rysunek 6B). Obszary zawałowe charakteryzują się obecnością nieprawidłowego lub niskiego potencjału jednobiegunowego (≤6 mV) oraz upośledzoną aktywnością mechaniczną (LLS ≤4%)22.

Analiza reologiczna; wykresy lepkości, wiskoelastyczności, modułów w funkcji szybkości ścinania, czasu, częstotliwości.
Rycina 1:. Ocena reologiczna roztworów i żeli. (A) Lepkość w funkcji szybkości ścinania dla roztworów przy różnych wartościach pH. Dla próbki o pH 8,5 obserwuje się rozrzedzanie ścinaniem, natomiast dla próbek o pH 9,0 i 9,5 uzyskano stałe lepkości, co wskazuje na zachowanie newtonowskie tych roztworów. (B) Utwardzanie żelu z następującym wykresem tan δ w funkcji czasu. (C) Skan częstotliwości dla zneutralizowanej próbki po 2 h utwardzania. Słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe z 3 niezależnych pomiarów, wskazując na typowy błąd eksperymentalny.

Układ eksperymentu laboratoryjnego z probówkami do wirowania i wahadłowym mieszadłem do mieszania i przygotowania próbek.
Rycina 2: Układ do eksperymentów nad degradacją i uwalnianiem. (A) Wkład do dołka z poli(tereftalanu etylenu) przykryty Parafilmem w celu zapobiegania wyciekom podczas przygotowania. (B) Płytka 24-dołkowa z wkładami, owinięta Parafilmem w celu zapobiegania odparowywaniu rozpuszczalnika.

Wykresy kinetyki erozji i uwalniania, mRuby2, dopasowany model, pirfenidon, czas w dniach.
Rysunek 3: Erozja i uwalnianie. (A) Erozja hydrożelu w czasie. Obserwuje się stopniową erozję żelu przez co najmniej 2 tygodnie. (B) Uwalnianie leku będącego małą cząsteczką oraz białka modelowego. Podczas gdy mała cząsteczka uwalnia się w ciągu jednego dnia, białko modelowe jest uwalniane stopniowo w ciągu tygodnia, bez znaczącego uwalniania gwałtownego (burst release). Linia przedstawia dopasowanie modelu Korsmeyer-Peppasa do początkowej fazy uwalniania.

Analiza elektrofizjologii serca; wizualizacja danych; konfiguracja z dwoma monitorami; wyniki mapowania serca.
Rycina 4: System nawigacji cewnikiem. Konsola jednostki komunikacyjnej z systemem nawigacji kardiologicznej NOGA XP.

Konfiguracja sprzętu do endoskopowej terapii próżniowej, szczegół instrumentu chirurgicznego, narzędzie do procedury medycznej.
Rysunek 5: (A) Cewnik do wtryskiwania wewnątrzmięśniowego z dołączoną strzykawką. (B) Szczegół igły do wtryskiwania.

Schemat mapowania serca; jednobiegunowa analiza napięcia; widok tylny; wyniki badania elektrofizjologicznego.
Rycina 6: Mapa napięcia jednobiegunowego i LLS. (A) Mapa jednobiegunowa, widok LAO (góra) oraz widok typu „bulls eye” (dół). Kolor czerwony wskazuje niskie wartości napięcia jednobiegunowego u podstawy mięśnia sercowego (norma) z utratą aktywności elektrycznej w części tylno-bocznej. Kolor niebieski oznacza prawidłowy mięsień sercowy, natomiast kolory zielony i żółty wskazują na obniżoną żywotność. (B) Mapa LLS, widok LAO (góra) oraz widok typu „bulls eye” (dół). Kolor czerwony wskazuje akinezję w ścianie tylno-bocznej, kolory zielony i żółty oznaczają upośledzoną ruchomość ściany. Punkty mapowania zaznaczono białymi kropkami. Narysowana biała linia wyznacza obszar zainteresowania, charakteryzujący się obniżonymi napięciami jednobiegunowymi i upośledzoną ruchomością ściany. Brązowe punkty reprezentują miejsca wstrzyknięć.

Dyskusja

Kluczowym wyzwaniem jest uzyskanie roztworu, który można wstrzykiwać przez długi cewnik, przy jednoczesnym zachowaniu kompatybilności roztworu ze związkami bioaktywnymi. Chociaż pH należy zwiększyć, aby zwiększyć możliwość wstrzykiwania, związki bioaktywne, takie jak czynniki wzrostu, są delikatnymi cząsteczkami, z którymi należy obchodzić się ostrożnie. Po dodaniu hydrogelatora ściśle monitorujemy pH roztworu za pomocą pH-metru, aby potwierdzić, że ma pH 9,0 przed dodaniem jakichkolwiek składników bioaktywnych. Początkowo konieczne było kilka rund dostosowywania początkowego pH PBS, aby zakończyć się odpowiednim pH. Ponadto, ponieważ używamy stosunkowo lepkich roztworów i długiego, cienkiego cewnika, występuje duży spadek ciśnienia (rzędu 0,5 MPa, w zależności od prędkości wstrzyknięcia). Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na dobór odpowiednich połączeń między strzykawką a cewnikiem. Pompka strzykawkowa wspomaga kontrolowane wstrzykiwanie, ponieważ ręczne stosowanie takich sił jest trudne. W eksperymentach in vitro roztwór żelowano przez neutralizację roztworu HCl, podczas gdy in vivo odbywa się to za pomocą naturalnego pH tkanki. Dlatego ważne jest, aby dodać odpowiednią ilość HCl, aby zapobiec przekroczeniu pH. Dyfuzja tego kwasu jest prawdopodobnie czynnikiem ograniczającym żelowanie hydrożelu w eksperymentach in vitro ; Jednak in vivo ciecz miałaby dużą powierzchnię kontaktu z tkanką neutralizującą, co najprawdopodobniej spowoduje szybsze i bardziej równomierne żelowanie w porównaniu z kroplowym dodawaniem stężonego kwasu. Co więcej, wymiana żelu jest znacznie szybsza w przypadku tej łagodnej procedury w porównaniu z poprzednio stosowanymi metodami (0,5 godziny w porównaniu z 2 godzinami)25. Wykorzystanie naturalnego pH organizmu do zmiany właściwości materiału jest bardzo atrakcyjne, ponieważ przejście jest szybkie, odwracalne, nie może zachodzić wewnątrz cewnika i jest w pełni automatyczne in vivo . Właściwości te dają przewagę nad np. żelami przełączanymi termicznie26, w przypadku których występuje ryzyko żelowania w cewniku z powodu zmian temperatury, żelami, które wymagają polimeryzacji indukowanej światłem, co jest trudne ze względu na ograniczoną penetrację światła i tworzenie rodników27, lub żelami, które wymagają jednoczesnego wstrzykiwania inicjatora lub przyspieszacza polimeryzacji28.

Pomyślne uwolnienie leku z hydrożelu w dużej mierze zależy od wielkości leku. Jak wykazano, lek małocząsteczkowy jest uwalniany natychmiast, podczas gdy stopniowe uwalnianie białka modelowego w ciągu 1 tygodnia pokazuje nadzieję na to, że te hydrożele będą systemami dostarczania czynników wzrostu. Ogólnie rzecz biorąc, hydrożele są bardziej obiecujące jako narzędzie dostarczania większych obiektów, takich jak białka, egzosomy i komórki29,30.

Procedura elektromechanicznego mapowania 3D i wstrzykiwania zapewnia klinicznie potwierdzone podejście do dostarczania oparte na cewniku dla różnych terapii regeneracyjnych mięśnia sercowego, takich jak hydrożele. Wartością dodaną tej technologii w porównaniu z innymi niechirurgicznymi technikami dostarczania jest planowanie leczenia, co umożliwia różnicowanie normalnego, zawałowego i hibernującego mięśnia sercowego oraz ukierunkowanie terapii w obszarze zainteresowania. Wady tego podejścia dotyczą wymaganych umiejętności technicznych oraz czasochłonnej i kosztownej procedury20. W prezentowanym świńskim modelu zawału mięśnia sercowego po mapowaniu elektromechanicznym wykonano sterowane iniekcje domięśniowe bioaktywnym supramolekularnym hydrożelem UPy. Inne kombinacje z terapiami regeneracyjnymi muszą być testowane in vitro i in vivo , aby odnieść większy sukces w tej rozwijającej się dziedzinie. Ponadto należy przeprowadzić optymalizację procedur wstrzykiwania i sterylizacji, aby skutecznie przełożyć tę metodę na warunki kliniczne.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Ministerstwo Edukacji, Kultury i Nauki (program Gravity 024.001.035), Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO), Europejską Radę ds. Badań Naukowych (FP7/2007-2013) Umowę o Grant ERC 308045 i przeprowadzona w ramach LSH TTKI. Badania te stanowią część projektu P1.03 PENT programu badawczego Instytutu Materiałów Biomedycznych, współfinansowanego przez holenderskie Ministerstwo Gospodarki. Projekt ten był wspierany przez ICIN - Netherlands Heart Institute (www.icin.nl) oraz "Wijnand M. Pom Stichting". Autorzy pragną podziękować Henkowi Janssenowi i Jorisowi Petersowi za syntezę hydrogelatora UPy oraz firmie Remco Arts za dostarczenie mRuby2. Dziękujemy Bertowi Meijerowi, Tonny'emu Bosmanowi, Roxanne Kieltyka, Stijnowi Kramerowi, Joostowi Sluijterowi, Imo Hoeferowi i Frebusowi van Slochterenowi za wiele pożytecznych dyskusji oraz Marlijn Jansen, Joyce Visser, Grace Croft i Martijn van Nieuwburg za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M HCl
1 M NaOH
Polistyren 24-dołkowa płytkaFalcon353047
AmiodaroneCordaron I.V. (Sanofini)
Anton Paar Physica MCR501Anton Paar GmbHWyposażony w geometrię płytki równoległej (25 mm)
AtropinaPCH
Wentylator
Cary 50 Scan Spektrofotometr UV-Visible
Cary EclipsePlastry
DMSOBiosolve44705
Rurka dotchawiczaCovidien
Heparyna
KetaminaNarketan 10 Vé Cewnik mapujący tochinol
115  cmBiosense Webster
MidazolamActavis
MilliQMD Milipore MilliQ Zintegrowany system
mRuby2
NaCl 0,9% 500  ccCewnik
NOGABiosense Webster
NOGA-RefStar EFO-patchBiosense Webster
Bromek
ParafilmVWRIKAA3801100
PBSSigma AldrichP4417 
Milicel PETMilliporePIEP12R48
PirfenidoneSigma AldrichP2116Używany od 100  mM zapas DMSO
SodiumthiopentalInresa
Sufentanyl-Hameln
Tegaderm
UPy-PEG10k
UV-Lamp
Maść
Visipaque contrastfluid 100  DW
balonowy Spektrofotometr fluorescencyjny Varian defibrylacyjne Varian oczyszczania wody iniekcyjny Myostar prowadzony przez Braun pankuroniumweterynaryjna

Bibliografia

  1. Levy, D., et al. Long-Term Trends in the Incidence of and Survival with Heart Failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
  2. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics—2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 120 (1), 2-220 (2012).
  3. Peppas, N. A., Huang, Y., Torres-Lugo, M., Ward, J. H., Zhang, J. Physicochemical foundations and structural design of hydrogels in medicine and biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 9-29 (2000).
  4. Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43 (21), 9094-9099 (2010).
  5. Guvendiren, M., Lu, H. D., Burdick, J. A. Shear-thinning hydrogels for biomedical applications. Soft Matter. 8 (2), 260(2012).
  6. Bastings, M., et al. A Fast pH-Switchable and Self-Healing Supramolecular Hydrogel Carrier for Guided, Local Catheter Injection in the Infarcted Myocardium. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 70-78 (2014).
  7. Pawar, G. M., et al. Injectable Hydrogels from Segmented PEG-Bisurea Copolymers. Biomacromolecules. 13 (12), 3966-3976 (2012).
  8. Yoon, H. -J., Jang, W. -D. Polymeric supramolecular systems for drug delivery. Journal of Materials Chemistry. 20 (2), 211-222 (2009).
  9. Christman, K. L., Lee, R. J. Biomaterials for the treatment of myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 48 (5), 907-913 (2006).
  10. Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chemical Society Reviews. 37 (8), 1473-1481 (2008).
  11. Krieg, E., Rybtchinski, B. Noncovalent Water-Based Materials: Robust yet Adaptive. Chemistry – A European Journal. 17 (33), 9016-9026 (2011).
  12. Davis, M. E., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
  13. Li, J., Ni, X., Leong, K. W. Injectable drug-delivery systems based on supramolecular hydrogels formed by poly(ethylene oxide)s and alpha-cyclodextrin. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 196-202 (2003).
  14. Dankers, P. Y. W., et al. Hierarchical formation of supramolecular transient networks in water: a modular injectable delivery system. Advanced materials. 24 (20), 2703-2709 (2012).
  15. Dankers, P. Y. W., et al. Development and in-vivo characterization of supramolecular hydrogels for intrarenal drug delivery. Biomaterials. 33 (20), 5144-5155 (2012).
  16. Kieltyka, R. E., et al. Mesoscale modulation of supramolecular ureidopyrimidinone-based poly(ethylene glycol) transient networks in water. Journal of the American Chemical Society. 135 (30), 11159-11164 (2013).
  17. Vrijsen, K. R., et al. Cardiomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate migration of endothelial cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (5), 1064-1070 (2010).
  18. Koudstaal, S., et al. Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  19. Koudstaal, S., et al. Sustained delivery of insulin-like growth factor-1/hepatocyte growth factor stimulates endogenous cardiac repair in the chronic infarcted pig heart. Journal of Cardiovascular Translational Research. 7 (2), 232-241 (2014).
  20. Spoel, T. I., et al. Non-surgical stem cell delivery strategies and in vivo cell tracking to injured myocardium. International Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 367-383 (2011).
  21. Gepstein, L., Hayam, G., Shpun, S., Ben-Haim, S. A. Hemodynamic evaluation of the heart with a nonfluoroscopic electromechanical mapping technique. Circulation. 96 (10), 3672-3680 (1997).
  22. Gyöngyösi, M., Dib, N. Diagnostic and prognostic value of 3D NOGA mapping in ischemic heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (7), 393-404 (2011).
  23. Siepmann, J., Siepmann, F. Modeling of diffusion controlled drug delivery. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 161 (2), 351-362 (2012).
  24. Kim, H., Fassihi, R. Application of binary polymer system in drug release rate modulation. 2. Influence of formulation variables and hydrodynamic conditions on release kinetics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 86 (3), 323-328 (1997).
  25. Pape, A. C. H., et al. Mesoscale characterization of supramolecular transient networks using SAXS and rheology. International Journal Of Molecular Sciences. 15 (1), 1096-1111 (2014).
  26. Lee, B. H., Vernon, B. In Situ-Gelling, Erodible N-Isopropylacrylamide Copolymers. Macromolecular Bioscience. 5 (7), 629-635 (2005).
  27. Annabi, N., et al. 25th Anniversary Article: Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
  28. Asai, D., et al. Protein polymer hydrogels by in situ, rapid and reversible self-gelation. Biomaterials. 33 (21), 5451-5458 (2012).
  29. Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in Biology and Medicine: From Molecular Principles to Bionanotechnology. Advanced Materials. 18 (11), (2006).
  30. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dostarczanie lekówmapowanie elektromechanicznehibernujące mięsień sercowyanaliza in vitroeksperymenty in vivotworzenie żeluzwiązki bioaktywne
Supramolekularny hydrożel do wstrzykiwań i lek do miejscowego wstrzykiwania cewnika do serca świni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.