Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Streszczenie

Genetyka myszy oferuje potężne narzędzie określające rolę określonych genów podczas rozwoju. Analiza otrzymanych fenotypów za pomocą metod immunohistochemicznych i molekularnych dostarcza informacji o potencjalnych genach docelowych i szlakach sygnałowych. Dalsze wyjaśnienie specyficznych mechanizmów regulacyjnych wymaga systemu pozwalającego na manipulowanie tylko niewielką liczbą komórek określonej tkanki poprzez nadekspresję, ablację lub ponowne wprowadzenie określonych genów i śledzenie ich losu podczas rozwoju. Aby to osiągnąć, takim narzędziem jest elektroporacja ex utero struktur hipokampa, zwłaszcza zakrętu zębatego, a następnie organotypowa hodowla plastrów. Wykorzystanie tego systemu do generowania delecji mozaikowych pozwala określić, czy gen będący przedmiotem zainteresowania reguluje procesy rozwojowe komórki, takie jak proliferacja komórek progenitorowych lub różnicowanie neuronów. Ponadto ułatwia ratowanie fenotypów poprzez ponowne wprowadzenie usuniętego genu lub jego genów docelowych. W przeciwieństwie do elektroporacji in utero, podejście ex utero poprawia wskaźnik skutecznego celowania w głębsze warstwy mózgu, takie jak zakręt zębaty. Ogólnie rzecz biorąc, elektroporacja ex utero i organotypowa hodowla plastrów stanowią potężne narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych w częściowo natywnym środowisku odzwierciedlającym warunki endogenne.

Wprowadzenie

Hipokamp odgrywa ważną rolę w pamięci i uczeniu się, a także w zachowaniu emocjonalnym. Jedna z głównych funkcji polega na konsolidacji pamięci krótkotrwałej w pamięci długotrwałej, co wymaga dużej plastyczności układu nerwowego. Zakręt zębaty hipokampa działa jako główna brama dla informacji wejściowych, a także jest jednym z dwóch regionów mózgu z trwającą neurogenezą przez całe dorosłe życie^1,2. Rozwój struktury hipokampa następuje w późnym okresie embriogenezy, a zwłaszcza w ciągu pierwszych 3 do 4 tygodni po urodzeniu³. We wczesnym rozwoju zakrętu zębatego tworzy się pula komórek macierzystych niezbędna do neurogenezy pourodzeniowej i dorosłej⁴. Rozwijające się neurony przechodzą przez różne etapy, od komórki macierzystej przez kilka etapów komórek progenitorowych do niedojrzałego i wreszcie dojrzałego neuronu podczas neurogenezy poporodowej i dorosłej. Na różnych etapach neurogenezy wymagana jest ekspresja określonych genów, aby umożliwić dojrzewanie i integrację nowych neuronów z obwodami hipokampa^5,6.

Wykorzystanie genetyki myszy i analizy fenotypu za pomocą immunohistochemii, jak również metod molekularnych, pozwoliło na zdefiniowanie wzorca ekspresji i funkcji wielu z tych genów. Ponadto analiza mikromacierzy oraz immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) dostarczyły informacji na temat potencjalnych bezpośrednich i pośrednich genów docelowych^7,8. Wciąż jednak pozostaje wiele otwartych pytań dotyczących mechanizmów regulacyjnych rozwoju hipokampa, w szczególności rozwoju zakrętu zębatego. Aby uzyskać więcej informacji na temat regulacji określonych genów, potrzebny jest system umożliwiający manipulowanie niewielką liczbą komórek poprzez regulację w dół lub w górę genu będącego przedmiotem zainteresowania i/lub jego genów docelowych oraz śledzenie ich losu podczas rozwoju. Takim narzędziem jest elektroporacja shRNA w macicy, cDNA genów będących przedmiotem zainteresowania lub rekombinaza Cre. Aby zapewnić obecność pożądanej ekspresji DNA lub małych RNA, do elektroporacji należy użyć plazmidów. Podejście to jest z powodzeniem wdrażane w badaniach nad rozwojem kory mózgowej^9,10, ale jest bardziej wymagającym podejściem do badania rozwoju zakrętu zębatego ze względu na położenie struktur hipokampa w głębszych warstwach mózgu.

Elektroporacja ex utero, a następnie organotypowa hodowla plastrów jest jednym ze sposobów obejścia tego problemu^11,12. W przeciwieństwie do elektroporacji in utero nie wykorzystuje się całego zarodka, a jedynie głowę, co pozwala zatem na ułożenie elektrod w bardziej korzystny sposób, aby skierować shRNA/DNA w kierunku hipokampa i zakrętu zębatego. Nasza grupa z powodzeniem zastosowała elektroporację ex utero do zbadania roli czynnika transkrypcyjnego Bcl11b w rozwoju zakrętu zębatego⁸. Bcl11b odgrywa podwójną rolę w rozwoju zakrętu zębatego poprzez regulację proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych, co wykazano za pomocą immunohistochemii. Aby dokładniej zdefiniować mechanizm udziału Bcl11b w tych procesach, protokoły grupy Polleux^11,12 dostosowano do badania zakrętu zębatego, jak opisano poniżej w sekcji protokołu. W pierwszym podejściu postawiono sobie za cel ustalenie, czy Bcl11b autonomicznie reguluje różnicowanie komórek neuronalnych. W ramach drugiego podejścia sprawdzono, czy desmoplakina, bezpośredni gen docelowy dla Bcl11b, jest wystarczająca do uratowania fenotypu Bcl11b.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim prawem i zostały zatwierdzone przez urzędy rządowe w Tybindze.

1. Przygotowanie mikropipet, roztworów i membran

1. Przygotowanie mikropipet
   1. Wyciągać szklane mikropipety za pomocą ściągacza do mikropipet z następującym programem: Ciepło: 540, Ciągnięcie: 125, Prędkość: 20 i Opóźnienie: 140. Długość igły wynosi 5,5 cm.
   2. Igły do ukosowania należy wykonać za pomocą mikromłynka, aby uzyskać odpowiedni rozmiar końcówki 4 mm. Przechowuj igły w pudełku lub na szalce Petriego o średnicy 15 cm, aby zapobiec uszkodzeniu końcówek.
2. Przygotowanie roztworów
   1. Roztwór plazmidowego DNA
      1. Przygotuj plazmidowe DNA zawierające pożądany konstrukt cDNA za pomocą zestawu Maxi-prep bez endotoksyn zgodnie z protokołem producenta.
      2. Dostosuj roztwór plazmidowego DNA do końcowego stężenia 3 μg/μl (bez wektora kolca GFP) lub 4 μg/μl (z 1 μg wektora kolca GFP) w wolnym od endotoksyn buforze Tris-EDTA zawierającym Fast Green (stężenie końcowe 0,05%).
   2. Laminin Roztwór podstawowy
      1. Rozpuścić 1 mg lamininy w sterylnej wodzie do końcowej objętości 1 ml. Przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   3. Roztwór podstawowy poli-L-lizyny
      1. Rozpuścić 50 mg poli-L-lizyny w 50 ml sterylnej wody do końcowego stężenia 1 mg/ml. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Kompletny Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (Kompletny HBSS)
      1. Przygotuj kompletny HBSS, łącząc 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M buforu HEPES (pH 7,4), 30 ml 1 M D-glukozy, 10 ml 100 mM CaCl₂, 10 ml 100 mM_MgSO4 i 4 ml 1 M NaHCO₃. Dodać sterylną wodę do 1 l i przechowywać w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: W autoklawie wszystkie roztwory oczekują 1 M buforu HEPES i 1 M D-glukozy, które są sterylizowane filtrem.
   5. Pożywka do kultur plastrowych
      1. Przygotować pożywkę do hodowli warstw, dodając 35 ml preparatu Basal Medium Eagle, 12,9 ml kompletnego HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-glukozy, 250 μl 200 mM L-glutaminy i 500 μl penicyliny-streptomycyny, aby uzyskać końcową objętość 50 ml. Dodać surowicę końską do końcowego stężenia 5% i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   6. Agaroza o niskiej temperaturze topnienia (LMP)
      1. Przygotować 4% roztwór agarozy LMP, dodając 2 g agarozy LMP do 50 ml kompletnego HBSS (1.2.4), a następnie podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 1-2 minuty z dużą mocą. Roztwór należy przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 37–39 °C. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C i użyć ponownie.
   7. Roztwór paraformaldehydu
      1. W dygestorium przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA), dodając 4 g paraformaldehydu do 100 ml 1x PBS. Podgrzać roztwór do temperatury 60 °C i dodać kilka kropli 1 N NaOH, aż roztwór stanie się klarowny.
   8. Roztwór przepuszczalności
      1. Rozpuścić 9 g BSA w 300 ml 1x PBS zawierającego 0,3% Trition X-100 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać 10% azydku sodu do długotrwałego przechowywania.
3. Powlekanie wkładów membranowych
   1. Rozcieńczyć jedną podwielokrotność roztworu podstawowego lamininy (1.2.2) i jedną podwielokrotność roztworu podstawowego poli-L-lizyny (1.2.3) w sterylnej wodzie do końcowej objętości 12 ml.
   2. Umieść wkładki membranowe w 6 dołkach, z których każda zawiera 2 ml sterylnej wody. Dodać 1 ml roztworu powlekającego na wierzch membrany i inkubować O/N w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
   3. Po inkubacji przemyć wkładki membrany trzykrotnie 1 ml sterylnej wody i wysuszyć. Tego samego dnia należy stosować powlekane wkładki membranowe lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do czterech tygodni w suchej płytce 6-dołkowej.

2. Iniekcja DNA i elektroporacja zarodków E15.5 i E18.5

1. Znieczulenie samicy myszy krytej w czasie umieszczając ją w komorze anestezjologicznej nasyconej 5% izofluranem i podłączonej do parownika. Izofluran i tlen krążą z szybkością 1 l/min. Trzymaj zwierzę w pudełku przez 2-4 minuty lub do utraty przytomności, co jest testowane poprzez ściskanie między łapkami myszy.
2. Poddaj eutanazji nieprzytomną mysz przez zwichnięcie szyjki macicy w dniu embrionalnym (E) 15,5 lub 18,5. Wyciąć macicę zawierającą zarodki¹³ i umieścić ją na szalce Petriego zawierającej 15-20 ml zimnego kompletnego HBSS.
   UWAGA: Od tego momentu należy przechowywać zarodki i tkanki na lodzie.
3. Użyj nożyczek, aby oddzielić każdy zarodek od rogu macicy i umieścić go na drugiej szalce Petriego zawierającej zimny, kompletny HBSS.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym odetnij ścianę mięśniową macicy i łożysko za pomocą cienkich kleszczy (#55) i nożyczek. Ostrożnie uwolnij zarodek z woreczka żółtkowego.
5. Użyj nożyczek z Bonn, aby odciąć zarodki tuż nad kończynami przednimi pod kątem 60°. Jeśli eksperyment wymaga genotypowania zarodków, należy pobrać próbkę tkanki do izolacji genomowego DNA (mały fragment ogona).
6. Przenieś głowę na czystą i suchą szalkę Petriego. Ponieważ głowa została ścięta pod kątem 60°, głowa powinna przechylić się na jedną stronę, gdy jest umieszczona grzbietem do góry.
7. Ostrożnie umieść igłę w środku półkuli w pobliżu bregmy (Rysunek 1A, B). Wstrzyknij około 2-3 μl (przy 3 lub 4 μg/μl) roztworu DNA, naciskając pedał pikospritzera III, wywierając nacisk 30 funtów przez czas 10-15 ms na impuls, stosując 5-8 impulsów. Czas trwania i liczba impulsów zależy od średnicy otworu igły, przy czym mniejsze otwory wymagają więcej czasu. Odstęp między każdym impulsem wynosi 1 sek.
8. Przed umieszczeniem elektrod nałóż kilka kropli pełnego HBSS na głowę zarodka. Umieścić elektrody w taki sposób, aby "ujemny" koniec znajdował się po tej samej stronie co wstrzykiwana komora, a "dodatnia" elektroda po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory poniżej ucha głowy zarodka (ryc. 1C, D). Zastosuj 5 impulsów 50 V.
   1. Do elektrod E 15,5 należy stosować elektrody o średnicy 3 mm, a do elektrody o średnicy 5 mm.

3. Sekcja mózgu

1. Po elektroporacji zdejmij skórę z głowy za pomocą cienkich kleszczy. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe nacięcie na środku móżdżku w linii środkowej czaszki.
2. Włóż nożyczki sprężynowe do nacięcia i przetnij wzdłużnie wzdłuż szwu strzałkowego. Oderwij czaszkę i odłącz mózg od czaszki za pomocą cienkich kleszczy. Przenieś cały mózg do 15-20 ml zimnego, kompletnego roztworu HBSS.
3. W międzyczasie wlać 4% agarozy LMP, przechowywanej w temperaturze 37-39 °C w łaźni wodnej, do odklejanej formy.
4. Wyjmij mózg z całego HBSS za pomocą małej szpatułki i odsącz nadmiar HBSS za pomocą cienkiej bibułki lub chusteczek Kimwipes.
5. Umieść delikatnie cały mózg w agarozie i dostosuj jego położenie za pomocą cienkiej igły. Trzymaj pleśń na lodzie, aż agaroza zestali się, a blok zostanie podzielony na sekcje (w przypadku odcinków koronalnych opuszki węchowe są skierowane do góry).

4. Podział wibratomu i kultura plastrów

1. Przytnij bloki agarozy LMP i przyklej je do etapu próbki za pomocą "super kleju". Po wyschnięciu kleju przenieś stolik z próbką do tacki buforowej wibratomu i napełnij lodowatym kompletnym HBSS, aż blok zostanie zanurzony w roztworze.
   UWAGA: Przed cięciem wysterylizuj wszystkie powierzchnie narzędzi i sprzętu 70% etanolem.
2. Przygotuj sekcje wibratomu o grubości 250 μm za pomocą nowego ostrza, jak pokazano poniżej.
   1. Przytnij blok z następującymi ustawieniami: częstotliwość – 60 Hz, amplituda – 0,7 μm, prędkość 16-18 mm/sek. Wytnij odcinki zawierające żądaną tkankę z powyższymi ustawieniami z małą prędkością (9 mm/s). Rozpoczynając cięcie od tyłomózgowia, zbierz 5-7 sekcji z mózgu.
   2. Przenieść skrawki do czystego 6-dołkowego naczynia hodowlanego zawierającego 5 ml lodowatego kompletnego HBSS za pomocą wygiętej szpatułki i trzymać na lodzie, aż wszystkie skrawki zostaną zebrane (Rysunek 1E).
3. Zwilżyć membranę w sposób krzyżowy 100 μl pełnego HBSS przed umieszczeniem sekcji na membranie, aby ułatwić orientację sekcji.
4. Przenieś skrawki za pomocą wygiętej szpatułki na membranę (podnieś róg sekcji kleszczami i pociągnij za szpatułkę, a następnie użyj kleszczyków, aby wepchnąć sekcję na membranę). Umieść do pięciu sekcji na jednej membranie i ułóż za pomocą kleszczy (Rysunek 1F). Nie nakładaj na siebie sekcji.
   1. Usuń nadmiar HBSS z membrany za pomocą pipety. Zastosowane tutaj specjalne membrany są przymocowane do ramy i umieszczone w płytce do hodowli tkankowej, co pozwala na kontakt tkanki, ale nie jest pokryta pożywką.
5. Umieścić wkładki membranowe na płytce 6-dołkowej zawierającej 1,8 ml pożywki do hodowli warstw (1.2.5) (Rysunek 1G, H). Inkubować szalkę hodowlaną w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ dla 11 DIV lub 14 DIV. Zmieniać połowę pożywki (0,9 ml) co drugi dzień.
   UWAGA: Na tym etapie dodaj odczynniki, takie jak bromodeoksyurydyna (BrdU; stężenie końcowe 10 μM) do znakowania proliferujących komórek na pożywce przez pierwsze 20 godzin czasu hodowli.

5. Utrwalenie skrawków, a następnie barwienie immunofluorescencyjne

1. Użyj czystego i ostrego ostrza skalpela, aby przeciąć i przyciąć membrany w zależności od orientacji sekcji.
2. Przenieść skrawki wraz z membraną na 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml 4% PFA (1.2.7). Inkubować sekcje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie 3 płukania z 1x PBS przez 15 minut każde. Inkubować sekcje O/N z roztworem przepuszczalnym w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
3. Następnego dnia inkubować skrawki z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi, rozcieńczonymi w roztworze przepuszczalnym, O/N lub przez 48 godzin w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
4. Przemyć skrawki 3 razy przez 15 minut 1x PBS i inkubować O/N w temperaturze 4 °C z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze permeabilizacyjnym.
5. Po inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi przemyć skrawki raz 1x PBS przez 15 minut, a następnie barwienie DAPI przez 10 minut.
6. Przemyć skrawki 3 razy 1x PBS przez 15 minut każdy i przenieść na szkiełka mikroskopowe. Dodaj ImmunoMount i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu sekcji. Wysuszyć szkiełka o średnicy zewnętrznej i napełnić je lakierem do paznokci.
   UWAGA: Szkiełka należy zawsze utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   1. Przeanalizuj kultury plastrów za pomocą mikroskopii konfokalnej (ryc. 1I).

Wyniki

Ablacja czynnika transkrypcyjnego Bcl11b powoduje upośledzenie proliferacji komórek progenitorowych oraz różnicowania neuronalnego, co skutkuje zmniejszeniem rozmiaru i liczby komórek zakrętu zębatego. Co więcej, zmutowane neurony nie integrują się z obwodami hipokampa, co prowadzi do zaburzeń uczenia się i pamięci⁸. Aby odpowiedzieć na pytania dotyczące mechanizmów regulacyjnych Bcl11b w tych procesach, zastosowano elektroporację ex utero.

Aby odpowiedzieć na pytanie, czy ...

Dyskusja

Hipokamp pełni ważną funkcję w uczeniu się i pamięci. Zakręt zębaty jest również jednym z dwóch obszarów mózgu, w których neurogeneza zachodzi nie tylko podczas rozwoju, ale także przez całe dorosłe życie. Neurogeneza hipokampa po urodzeniu i u dorosłych przebiega w podobny sposób, obejmując wiele wspólnych czynników. Zdefiniowanie mechanizmów regulacyjnych tych czynników będzie bardzo pomocne w zrozumieniu chorób neurodegeneracyjnych, co z kolei doprowadzi do opracowania nowych terapii i środków zapobiegawczych. Aby uzy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płonący / brązowy ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
Pipety z drobnego szkła	Warner Instruments	G100F-4
Mikromłynek	Narishige, Japonia	EG-44
Wspornik anestezjologiczny Aparat	Harvard	PY2 34-0412
Waporyzator Halovet	Aparat Harvard	PY2 34-0398
Fluovac System	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
Komora anestezjologiczna	Aparat Harvard	PY2 34-0460
Elektroporator	BEX Company	CUY21 EDIT
Pęseta z elektrodami dyskowymi	Firma BEX	LF650P3	Elektrody 3 mm do Pęseta E15.5
z elektrodami dyskowymi	Firma BEX	LF650P5	Elektrody 5 mm do E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Mikrotom z ostrzem wibracyjnym, 230 V	Thermo Scientific	920120
	Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
Mikroskop odwrócony	Leica	Leica DM IL LED
Mikroskop konfokalny	Leica	Sp5II
6-dołkowa miska	BD Falcon	#353502
6-dołkowa	miska CELLSTAR	#657160
Wkładki do hodowli tkankowych	BD Falcon	#353090
Fast Green	Sigma	F7252
Laminin	Sigma
Poly-L-lizyna	Sigma	#P5899
Nożyczki sprężynowe	Narzędzia do nauki	15003-08
Bardzo cienkie nożyczki do bonn	Narzędzia do nauki	14084-08
Kleszcze	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Life Technology	14180-046
Technologia BME	Life	Numer katalogowy: 41010-26

Mikroskop preparacyjny Carl #L2020 o wysokiej jakości