Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Podsumowanie

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Skóra jest organem barierowym, który oddziałuje ze środowiskiem zewnętrznym. Będąc stale narażonym na potencjalną inwazję drobnoustrojów, skóra właściwa i naskórek są domem dla różnych komórek odpornościowych zarówno w stanach homeostatycznych, jak i zapalnych. Narzędzia do uwalniania komórek skóry do analiz cytofluorymetrycznych są zatem bardzo przydatne w celu badania złożonej sieci komórek odpornościowych znajdujących się w skórze i ich odpowiedzi na bodźce mikrobiologiczne. W tym miejscu opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy w celu szybkiego i skutecznego uzyskania zawiesin jednokomórkowych. Protokół ten pozwala na utrzymanie maksymalnej żywotności komórek bez uszczerbku dla powierzchniowej ekspresji antygenu. Opisujemy również, jak pobierać i trawić próbki skóry z różnych miejsc anatomicznych, takich jak ucho, tułów, ogon i poduszka stopy. Otrzymane zawiesiny są następnie barwione i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu rozróżnienia różnych populacji leukocytów.

Wprowadzenie

Skóra jest jednym z największych organów ciała, a jej duża powierzchnia jest stale wystawiona na działanie środowiska zewnętrznego. Dlatego skóra musi chronić organizm przed potencjalnymi zagrożeniami, aby utrzymać homeostazę, zarówno za pomocą środków fizycznych, jak i poprzez aktywną ochronę przed potencjalnym wnikaniem patogenu. Podobnie jak błona śluzowa jelit i płuc, skóra jest domem dla różnych komórek odpornościowych, które w sposób ciągły wchodzą w interakcje z nabłonkiem w celu utrzymania nadzoru immunologicznego. Ten złożony system, który obejmuje zarówno komórki odpornościowe, jak i nieimmunologiczne skóry, jest znany od początków immunologii, kiedy to w 1978 roku po raz pierwszy ukuto termin "tkanka limfatyczna związana ze skórą" (SALT) ¹ w celu opisania takiej złożoności.

Duża liczba komórek odpornościowych znajdujących się w skórze pomaga organizmowi nie tylko zwalczać potencjalne inwazje, ale także koordynować gojenie się ran i utrzymać tolerancję na antygeny własne i mikrobiotę skóry ^2,3.

Wśród komórek odpornościowych rezydujących w skórze, komórki dendrytyczne (DC) odgrywają kluczową rolę w kształtowaniu odpowiedzi immunologicznej i utrzymaniu homeostazy ⁴. Skórne DC i komórki Langerhansa łatwo reagują na inwazje patogenów, a po migracji do węzłów chłonnych aktywują limfocyty T i indukują ekspresję receptorów naprowadzających skórę na nowo wytworzonych efektorowych limfocytach T ⁵. DC odgrywają również fundamentalną rolę w regulacji homeostazy skóry. DC migrujące ze skóry właściwej do węzłów chłonnych w warunkach homeostazy transportują antygeny sekwestrowane przez skórę w celu wywołania tolerancji limfocytów T, głównie poprzez różnicowanie limfocytów T regulatorowych (Treg) specyficznych dla antygenów skóry ^6-8.

T limfocyty T reprezentują najliczniejszą populację komórek odpornościowych w skórze. Nie tylko przenikają one do skóry podczas infekcji, ale także stanowią stabilną populację wśród limfocytów rezydujących w skórze ^9,10. Zarówno limfocyty T pamięci rezydentnej CD8 ⁺, jak i CD4 ⁺ znajdują się w skórze i po zakażeniu mogą reagować na długo przed rekrutacją efektorowych limfocytów T z krwi. W skórze znajduje się również populacja rezydujących w tkankach limfocytów Treg zdolnych do utrzymania tolerancji na antygeny skórne i homeostazę tkanek. Komórki te są szybko i silnie aktywowane po ekspozycji na pokrewny im antygen i dlatego zostały zdefiniowane jako limfocyty pamięci ^11,12.

Wraz z DC i limfocytami T, wiele wrodzonych komórek odpornościowych, takich jak komórki NK, limfocyty T gamma delta, ILC grupy 2 ¹³, komórki tuczne i makrofagi, zasiedlają skórę i przyczyniają się do ochrony gospodarza. Aby przeanalizować tak złożone środowisko, konieczne jest uzyskanie zawiesin jednokomórkowych z próbek skóry z wysoką wydajnością, przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji markerów powierzchniowych do analizy cytofluorymetrycznej przepływowej lub sortowania.

Mysia skóra przedstawia zewnętrzną warstwę naskórka, składającą się głównie z keratynocytów, komórek Langerhansa i dendrytycznych komórek T naskórka; oraz warstwę skórną pod spodem. W skórze właściwej znajduje się większość komórek odpornościowych i jest wytwarzana przez macierz zewnątrzkomórkową, w której najliczniej występują włókna kolagenowe, zwłaszcza kolagen-I i kolagen-IV. W przeciwieństwie do ludzkiej skóry, skóra myszy jest pokryta futrem, a tym samym bardziej wypełniona mieszkami włosowymi. Jest również znacznie cieńszy niż ludzka skóra i zawiera warstwę mięśniową, panniculus carnosus, która wspomaga gojenie się ran ¹⁴. Te cechy utrudniają skuteczne przerwanie siatki kolagenowej skóry właściwej w celu wydostania komórek odpornościowych.

W tym artykule przedstawiamy odpowiednią metodę trawienia macierzy zewnątrzkomórkowej, która opiera się na koktajlu wysokiej czystości kolagenazy 1 i 2 oraz termolizyny. Ponadto, ponieważ analiza skóry z różnych regionów wymaga różnych procedur eksperymentalnych, pokażemy różne metody skutecznego pozyskiwania próbek skóry z poduszki stopy, ogona, ucha i tułowia. Następnie oznaczymy próbki w celu oceny obecności makrofagów DC (MHCII ⁺ CD11c ⁺ CD45 ⁺), makrofagów (CD11b ⁺ F4 / 80 ⁺ CD45 ⁺), limfocytów T CD8 ⁺ i CD4 ⁺.

Protokół

Zatwierdzenie badania: Protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Rzym, Włochy) zgodnie z Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 "Attuazione della Direttiva n. 86/609/CEE in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici."

1. Pobieranie próbek skóry

1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. ucho:
   1. Wytnij bezwłosą część uszu myszy.
   2. Oddziel stronę grzbietową i brzuszną, rozsuwając je kleszczami. Usuń wszelkie pozostałe chrząstki, delikatnie zeskrobując wewnętrzną część uszu kleszczami.
3. Skóra tułowia:
   1. Ogol całą skórę zwierzęcia zarówno elektryczną maszynką do golenia, jak i delikatnym balsamem do depilacji.
   2. Odetnij żądaną próbkę skóry (od 2^cm2 do całej skóry zwierzęcia).
      1. Jeśli odcinasz całą grzbietową i brzuszną skórę myszy, wykonaj pionowe nacięcie na środku pleców myszy, a następnie przetnij wzdłuż granic ogolonych obszarów wokół ciała myszy.
      2. Delikatnie oddziel skórę od otrzewnej i mięśni grzbietu, trzymając próbkę skóry nieruchomo kleszczami, jednocześnie oddzielając próbkę skóry zamkniętymi zaokrąglonymi końcówkami nożyczek chirurgicznych lub skalpela.
   3. Przygotować płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm zawierającą 10 ml lodowatego PBS.
   4. Usunąć podskórny tłuszcz, zanurzając próbkę skóry w PBS w płytce przygotowanej w kroku 1.3.3 i zeskrobując próbkę skóry kleszczami.
4. ogon:
   1. Odetnij ogon myszy.
   2. Wykonaj pionowe cięcie na ogonie nożyczkami chirurgicznymi lub skalpelem chirurgicznym, zaczynając od podstawy ogona i sięgając do czubka ogona.
   3. Użyj kleszczy, aby oderwać skórę od ogona. Chwyć krawędź nacięcia u podstawy ogona i delikatnie pociągnij w kierunku końcówki, trzymając ciało ogona kleszczami.
   4. Usuń nadmiar tłuszczu, delikatnie zeskrobując próbkę skóry.
5. Podnóżek
   1. Wytnij całą stopę myszy nożyczkami chirurgicznymi. Unikanie cięcia owłosionej skóry.
   2. Przetnij skórę stopy wzdłuż od kostki do początku palców.
   3. Chwyć kości skokowe kleszczami lub ręką, chwytając skórę kleszczami i pociągnij skórę w kierunku palców, tak jakby zdejmował rękawiczkę.

2. Trawienie

1. Przygotuj koktajl wytrawiający z roztworu podstawowego (przygotowanego zgodnie z wykazem materiałów) według następującego przepisu: Mieszanka enzymów (specyfikacja znajduje się w wykazie materiałów) 300 μg/ml, DNAse1 50 U/ml. Rozcieńczyć w RPMI 5% FBS.
2. Pokrój próbki skóry nożyczkami na małe kawałki na szalce Petriego o średnicy 35 mm z 2 ml koktajlu trawiennego (w przypadku skóry tułowia: 2 ml koktajlu trawiącego na każde 2 cm² skóry, łącznie do 3 ml).
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Podczas inkubacji delikatnie wstrząsnąć szalką Petriego 1-2 razy.
4. Wylać strawione próbki skóry na sitko o średnicy 70 μm na płytce Petriego o średnicy 66 mm zawierającej 1 ml RPMI1640 5% FBS.
5. Umyj sitko 5 ml RPMI 1640 5% FBS.
6. Przecisnąć próbkę przez sitko do komórek za pomocą tłoka strzykawki.
7. Tłok do płukania, szalkę Petriego i sitko z 20 ml RPMI1640 5% FBS, przenieść do probówki o pojemności 50 ml.

3. Przeciwciała i etykietowanie

1. Otrzymaną zawiesinę przemyć dwukrotnie 5 ml PBS 1% FBS (lub BSA).
2. Oznacz otrzymaną zawiesinę komórkową pożądanymi przeciwciałami.
   1. Zawiesić próbki w 100 μl/próbkę mieszaniny zawierającej 2 μg/ml aCD16/CD32 (klon 2,4G2) rozcieńczonej w PBS 1% FBS.
   2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu zablokowania nieswoistego wiązania pożądanych przeciwciał poprzez receptory Fc.
   3. Dodać przeciwciała wskazane w tabeli 1.
      1. Przygotować mieszaninę rozcieńczającą pożądane przeciwciała w 100 μl/próbkę PBS 1% FBS w stężeniu 4 μg/ml.
      2. Dodać 100 μl mieszaniny przygotowanej w kroku 3.2.3.1 do każdej próbki, tak aby w probówce znajdowała się objętość 200 μl mieszaniny przeciwciał o końcowym stężeniu 2 μg/ml.
   4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przykryć światłem.
3. Przemyć 1 ml PBS 1% FBS, odwirować przez 5 minut przy 400 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 300 μl PBS 1% FBS.
4. Dodać DAPI w końcowym stężeniu 2 μg/ml i inkubować w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem przez 10 minut.
5. Przeanalizować próbki uzyskane za pomocą FACS.
   1. Aby wyizolować leukocyty, użyj następującej strategii bramkowania:
      1. Najpierw wyeliminuj wszelkie martwe komórki poprzez bramkowanie na populacji DAPI-.
      2. Wybierz podkoszulki na wykresie FSC-A vs. FSC W, jak pokazano na rysunku 1.
      3. Bramka komórek na podstawie wielkości i ziarnistości typowych dla leukocytów będących przedmiotem zainteresowania.
      4. Wybierz komórki CD45+ na wykresie FSC-A CD45, jak pokazano na rysunku 1.
   2. Rozróżnij różne populacje leukocytów na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych w następujący sposób:
      1. Zidentyfikuj DC jako komórki CD11c⁺ MHC II⁺. Można je później przeanalizować pod kątem ekspresji CD207 w celu odróżnienia komórek Langerhansa i skórnych DC CD207 + od CD207 - skórnych DC.
      2. Zidentyfikuj makrofagi jako komórki CD64 + F4 / 80 +.
      3. Zidentyfikuj limfocyty B jako komórki MHCII + CD19 +.
      4. Zidentyfikuj limfocyty T jako komórki CD8 + lub CD4 +.

Wyniki

Skóra z różnych obszarów ciała została strawiona zgodnie z opisanym protokołem i wybarwiona wskazanymi przeciwciałami. Strategia bramkowania jest przedstawiona na rysunku 1. Najpierw wybierz żywe komórki (DAPI- komórki), a następnie bramkę na singletach (FSC-A vs. FSC-W) i na komórkach o morfologii limfocytów (FSC-A vs. SSC-A). Gdy jest to wskazane, wybiera się komórki CD45 ⁺ pochodzenia krwiotwórczego.

Dyskusja

Opisaliśmy metodę przygotowania zawiesin jednokomórkowych z różnych regionów skóry myszy. Przyjęta przez nas metoda trawienia nie tylko daje wysokie plony, ale także zachowuje ekspresję markerów powierzchniowych, co ma fundamentalne znaczenie dla późniejszej analizy FACS.

Zastosowanie koktajlu kolagenazy I i II oraz termolizyny gwarantuje minimalne różnice w aktywności enzymatycznej między partiami, dzięki czemu metoda ta jest wysoce powtarzalna. Inne opublikowane metody opierają się na różnyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynniki
Uzupełnione RPMI 1640 medium			RPMI1640 uzupełniony w/ L-glu, pen-strep bez beta merkapto etanolu
PBS
FBS
Liberase TM (Enzyme Mix)	Roche	5401119001	zawiesiny [2.5  mg/ml] w dH2O; Przechowuj podwielokrotności na poziomie -20  ° C
Dnase I	Sigma	Ponowne zawieszenie D4263-1VL	w RPMI 1640 bez surowicy [1,000  U/ml]
Materials
Nożyczki
chirurgiczne Kleszcze
Skalpel
35 mm Szalki
66 mm Szalki
Petriego 100 mm Szalki
70 &mikro; m Sitka komórkowe	BD	352350
Koktajl trawienny			Rozcieńczony w RPMI 5%
FBS LIberase TM			300 µ g/ml
DNAse1			50 U/ml
Przeciwciała
Nazwa	Firma	klon	Label
aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-CY7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-CY7
aCD207		4C7	APC