Artykuł metodologiczny

Normalny i złośliwy przeszczep komórek mięśniowych dorosłym danio pręgowanym z obniżoną odpornością

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52597

⸱

26 grudnia 2014

 ,  ,  , 
1Molecular Pathology, Cancer Center and Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3GABBA - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu komórek mięśni szkieletowych danio pręgowanego i embrionalnego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS) do dorosłego homozygotycznego mutanta rag2E450fs z obniżoną odpornością. Protokół ten pozwala na sprawną analizę regeneracji i przemian złośliwych komórek mięśniowych.

Streszczenie

Danio pręgowany stał się potężnym narzędziem do oceny rozwoju, regeneracji i raka. Niedawno opracowano protokoły przeszczepu komórek alloprzeszczepowych, które umożliwiają wszczepianie normalnych i złośliwych komórek do napromieniowanych, syngenicznych i z obniżoną odpornością dorosłych danio pręgowanego. Modele te, w połączeniu ze zoptymalizowanymi protokołami przeszczepu komórek, pozwalają na szybką ocenę funkcji komórek macierzystych, regeneracji po urazie i raku. W tym miejscu przedstawiamy metodę przeszczepu komórek dorosłego mięśnia szkieletowego danio pręgowanego i zarodkowego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS), mięsaka dziecięcego, który ma cechy wspólne z mięśniem embrionalnym, do dorosłego dorosłego rag2E450fs homozygotycznego zmutowanego danio pręgowanego. Co ważne, zwierzęta te nie mają limfocytów T i mają zmniejszoną funkcję limfocytów B, co ułatwia wszczepianie szerokiej gamy tkanek od niespokrewnionych zwierząt dawców. Nasze zoptymalizowane protokoły pokazują, że znakowane fluorescencyjnie preparaty komórek mięśniowych z transgenicznego danio pręgowanego α-aktyny-RFP szczepią się solidnie po wszczepieniu w mięśnie grzbietowe homozygotycznych zmutowanych ryb rag2. Wykazujemy również wszczepienie fluorescencyjno-transgenicznego ERMS, w którym fluorescencja jest ograniczona do komórek w oparciu o status różnicowania. W szczególności ERMS stworzono w szczepie AB myf5-GFP; mylpfa-mWiśniowe podwójnie transgeniczne zwierzęta i guzy wstrzykiwane do otrzewnej dorosłych ryb z obniżoną odpornością. Użyteczność tych protokołów rozciąga się na wszczepianie szerokiej gamy normalnych i złośliwych komórek dawcy, które można wszczepić do mięśni grzbietowych lub otrzewnej dorosłego danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Danio pręgowany są doskonałym modelem do badań regeneracyjnych, ponieważ mogą regenerować amputowane płetwy, a także uszkodzony mózg, siatkówkę, rdzeń kręgowy, serce, mięśnie szkieletowe i inne tkanki1. Badania nad komórkami macierzystymi i regeneracją u dorosłych danio pręgowanych w dużej mierze koncentrowały się na charakterystyce regeneracji w odpowiedzi na uraz, podczas gdy identyfikacja komórek macierzystych i progenitorowych z różnych tkanek za pomocą przeszczepu komórek została zbadana dopieroniedawno 2. Danio pręgowany staje się również coraz częściej wykorzystywany do badań nad rakiem poprzez generowanie transgenicznych modeli raka, które naśladują chorobę człowieka 3-10.

W przypadku raka, metody przeszczepiania komórek stały się powszechnie stosowane i pozwalają na dynamiczną ocenę ważnych procesów nowotworowych, w tym samoodnowy11, funkcjonalnej heterogeniczności12,13, neowaskularyzacji14, proliferacji, odpowiedzi terapeutycznych15 i inwazji16,17. Jednak przeszczepione komórki są często odrzucane od ryb biorców z powodu obrony immunologicznej gospodarza, która atakuje i zabija przeszczep18. Zastosowano kilka metod w celu przezwyciężenia odrzucenia przeszczepionych komórek. Na przykład, układ odpornościowy zwierzęcia biorcy może być przejściowo ablowany przez niską dawkę promieniowania gamma przed przeszczepieniem18,19. Jednak układ odpornościowy biorcy zregeneruje się do 20 dni po napromieniowaniu i zabije komórki dawcy18. Alternatywnie, leczenie deksametazonem stosuje się w celu zahamowania funkcji limfocytów T i B, zapewniając dłuższe warunkowanie immunosupresyjne i ułatwiając wszczepienie szerokiej gamy nowotworów u ludzi przez okres do 30 dni14. Eksperymenty te wymagają stałego dawkowania leków i ograniczają się do badania guzów litych. W długoterminowych testach wszczepienia wykorzystano genetycznie identyczne linie syngeniczne20–22, w których komórki dawcy i biorcy są dopasowane immunologicznie. Modele te wymagają jednak, aby interesujące nas linie transgeniczne były krzyżowane z tłem syngenicznym przez więcej niż cztery pokolenia, aby wytworzyć w pełni syngeniczne linie. Aby zapobiec problemom z odrzuceniem immunologicznym u ryb biorców, nasza grupa opracowała niedawno linię homozygotycznego mutanta rag2E450fs z obniżoną odpornością (oznaczenie allelu ZFIN rag2fb101), która ma zmniejszoną funkcję limfocytów T i B i która umożliwia wszczepienie szerokiej gamy tkanek23. Podobne modele myszy z obniżoną odpornością były szeroko stosowane do przeszczepiania komórek tkanek mysich i ludzkich24.

Tutaj prezentujemy metody przeszczepiania mięśni szkieletowych i embrionalnego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS), mięsaka dziecięcego, który ma cechy wspólne z mięśniami szkieletowymi, do nowo opisanego homozygotycznego mutanta danio pręgowanego rag2. Dostępność dorosłego danio pręgowanego z obniżoną odpornością rozszerza naszą zdolność do przeprowadzania badań przeszczepów komórek na dużą skalę w celu bezpośredniej wizualizacji i oceny samoodnawiania się komórek macierzystych w normalnych i złośliwych tkankach. Dzięki tej metodzie znakowane fluorescencyjnie preparaty komórek mięśniowych z dorosłego transgenicznego danio pręgowanego α-aktyny-RFP25 solidnie wszczepiają się w homozygotycznego zmutowanego danio pręgowanego rag2 po wstrzyknięciu do mięśni grzbietowych. Ponadto wykazujemy wszczepianie i ekspansję pierwotnego myf5-GFP; mylpfa-mTransgeniczny ERMS wiśniowy po wstrzyknięciu dootrzewnowym do homozygotycznego zmutowanego danio pręgowanego rag2E450fs. Użyteczność tych protokołów wykracza poza pokazane przykłady i można je łatwo zastosować do dodatkowych tkanek regeneracyjnych i nowotworów danio pręgowanego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Podkomitet ds. Badań nad Zwierzętami Szpitala Ogólnego w Massachusetts, zgodnie z protokołem #2011N000127.

Sekcja 1. Przeszczep komórek mięśni szkieletowych do dorosłego rag2E450fs Homozygotyczny zmutowany danio pręgowany

1. Przygotowanie komórek mięśni szkieletowych dorosłego dawcy danio pręgowanego

  1. Uzyskaj transgenicznego dorosłego danio pręgowanego, który ma fluorescencyjnie znakowane mięśnie. W tym eksperymencie wykorzystano 30 ryb dawców α-aktyny-RFP 25 do przeszczepienia 1 x 106 komórek na rybę biorcę.
  2. Danio pręgowanego dawcę należy uśmiercić w 1,6 mg/ml metanosulfonianu trikainy (MS222) przez 10 minut lub do momentu, gdy nie będzie widoczny ruch wieczka.
  3. Umieść rybę dawcy na chłonnym ręczniku papierowym i wytnij mięsień grzbietowy za pomocą czystej żyletki. Cięcie powinno być wykonane w pobliżu odbytu pod kątem 45°, aby zmaksymalizować pobranie tkanki (jak pokazano na rysunku 1A). Wypreparowaną tkankę umieścić na czystej szalce Petriego o średnicy 10 cm.
  4. Dodać 500 μl buforu zawiesiny (wstępnie schłodzony 0,9x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) uzupełniony 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS)) do wypreparowanej tkanki. W tej objętości można umieścić do 10 danio pręgowanego-dawcy
    5. .
  5. Zmiel tkankę żyletką >20 razy, aż komórki znajdą się w jednolitej zawiesinie. Cała muskulatura grzbietowa jest homogenizowana, w tym skóra, kości i płetwy. Dodać 2 ml buforu do sporządzania zawiesiny. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml rozetrzeć zawiesinę komórek ≥20 razy, aby oddzielić komórki.
  6. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o oczkach 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie.
  7. Przemyć szalkę Petriego dodatkowymi 2,5 ml buforu zawiesiny w celu zebrania pozostałej tkanki i przefiltrowania przez to samo sitko i stożkową probówkę, do końcowej objętości 5 ml (można użyć 10 ryb-dawców na izolat).
    UWAGA: Skóra, kości i płetwy zostaną wykluczone po filtracji.
  8. W stosownych przypadkach połączyć podobne zawiesiny w tej samej stożkowej rurce.
  9. Policz całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego i hemocytometru.
  10. W razie potrzeby zarezerwuj 500 μl na cytometrię przepływową (opcjonalnie, krok 2).
  11. Zawiesinę komórek wirować w temperaturze 1 000 x g, przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
  12. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w stężeniach 3,33 x 105 komórek/μl (0,9x PBS + 5% FBS). W sumie 3 μl zostaną wstrzyknięte na rybę biorcę, co daje w sumie 1 x 106 komórek na biorcę (krok 3).
    UWAGA: Mniej niż 3 μl zawiesiny komórkowej należy przesadzić do ryby biorcy. Jeśli liczba komórek jest ograniczona, zaledwie 5 x 104 komórki na biorcę mogą prowadzić do pomyślnego wszczepienia (Tabela 1).

2. Analiza cytometrii przepływowej preparatu komórek mięśni szkieletowych dawcy (opcjonalnie)

  1. Wyizoluj mięśnie od dzikiego, nietransgenicznego ryby, jak opisano w kroku 1.1. Ta próbka służy jako kontrola ujemna i jest przydatna do ustawiania bramek cytometrii przepływowej.
  2. Dodaj odpowiedni barwnik do życia. Na przykład dodaj 5 μl podstawowego roztworu DAPI (500 ng/μl) do 500 μl preparatu mięśniowego. Wir nieco przed analizą. Zdobądź 5 x 103 do 1 x 104 wydarzenia. Najpierw przeanalizuj próbki kontrolne typu dzikiego, aby umieścić bramki, a następnie analizę komórek mięśniowych wyizolowanych z ryb transgenicznych.
    UWAGA: Analiza cytometrii przepływowej jest zwykle wykonywana w ciągu 1 godziny po rozwarstwieniu tkanki mięśniowej, w tym czasie wypreparowane komórki zachowują ponad 60% żywotności (ryc. 2). Komórki powinny być przez cały czas trzymane na lodzie. Całkowitą żywotność komórek można ponownie ocenić przed przeszczepem za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru.

3. Domięśniowy przeszczep komórek mięśni szkieletowych do dorosłego homozygotycznego zmutowanego danio pręgowanego rag2

  1. Wyczyść mikrostrzykawkę o pojemności 10 μl 26S G, pobierając i usuwając 10% roztwór wybielacza (5 razy), następnie 70% etanolu (5 razy), a następnie bufor zawiesiny (0,9 x PBS + 5% FBS, 10 razy).
  2. Znieczulić 2-4-miesięczną homozygotyczną zmutowaną rybę rag2 lub rybę biorcę typu dzikiego (jako kontrolę), dodając pojedyncze krople metanosulfonianu trikainy (MS222, 4 mg/ml roztworu podstawowego) do szalki Petriego zawierającej ryby w wodzie systemowej, aż ruchy wieczka zwolnią, a ryby będą nieruchome.
    UWAGA: Dawka znieczulenia tricainowego będzie zależeć od wieku i wielkości biorcy danio pręgowanego.
  3. Umieść znieczulonego biorcę na wilgotnym ręczniku papierowym lub gąbce, lewą stroną do góry.
  4. Wprowadzić igłę strzykawki do mięśnia boczno-grzbietowego (patrz Rysunek 1A). Należy upewnić się, że wstrzyknięcia są wykonywane pod kątem 45°. Wstrzyknąć 3 μl zawiesiny komórkowej (przygotowanej w kroku 1.12) na rybę, co daje w sumie 1 x 106 komórek na biorcę.
  5. Ostrożnie przenieś wstrzykniętego danio pręgowanego do czystego zbiornika za pomocą plastikowej łyżki, aby wyzdrowieć.
  6. Oceń biorcę danio pręgowanego pod kątem szybkości wszczepienia po 10, 20, 30 dniach po przeszczepie, obrazując znieczulone ryby w jasnym polu i mikroskopii epifluorescencyjnej.

Sekcja 2. Przeszczepienie zarodkowego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS) do dorosłego homozygotycznego rag2 zmutowanego danio pręgowanego

4. Mikroiniekcja DNA zarodków danio pręgowanego

  1. Linearyzować plazmid rag2-kRASG12D 7, trawiąc 10 μg DNA za pomocą XhoI, w temperaturze 37 °C przez 6 godzin lub O/N.
  2. Oczyść DNA przez standardową ekstrakcję fenolu: chloroform i wytrącić etanolem. Zawiesić ponownie w 20 μl wody dejonizowanej (alternatywnie można użyć komercyjnych kolumn do oczyszczania fragmentów DNA).
  3. Uruchom niestrawione i strawione DNA na 1% żelu agarozowym i określ stężenie DNA za pomocą odczytu spektrometru. Alternatywnie, przeprowadź próbki w rozcieńczeniach 1:1, 1:5 i 1:10 na 1% żelu agarozowym i porównaj je z drabiną DNA.
  4. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań o końcowym stężeniu 15 ng/μl strawionego DNA rag2-kRASG12D w 0,1 M KCl i 0,5x Tris-EDTA. Ostateczna ilość DNA wstrzyknięta w 2 nl objętości wstrzyknięcia wyniesie 30 pg.
    UWAGA: Maksymalnie trzy różne konstrukty DNA mogą być skutecznie wstrzyknięte jednocześnie w maksymalnie 60 pg DNA na zarodek. Te transgeny zostają zintegrowane z genomem i ulegają koekspresji w rozwijającym się guzie26.
  5. Wstrzyknąć zlinearyzowany rag2-kRASG12D do zarodków w stadium jednokomórkowym, zasadniczo zgodnie z opisem27, do interesującego szczepu danio pręgowanego (Figura 1B). Wstrzyknięcia należy wykonywać w komórce, a nie w żółtku, aby uzyskać większą skuteczność. W tym eksperymencie podwójnie transgeniczny szczep AB; Zastosowano myf5-GFP, mylpfa-mCherry. Hoduj danio pręgowanego przy użyciu standardowych protokołów chowu28.
    UWAGA: Przeżywalność po wstrzyknięciu jest często zależna od użytego szczepu danio pręgowanego. Średnio u 30% zarodków, którym wstrzyknięto zarodki, rozwija się ERMS. W jednym eksperymencie należy wstrzyknąć 300-600 zarodków, aby zapewnić wygenerowanie wystarczającej liczby guzów pierwotnych GFP-dodatnich i mCherry-dodatnich do przeszczepu i analizy.

5. Badanie przesiewowe pod kątem pierwotnego ERMS u larw danio pręgowanego

  1. Obserwuj wstrzykiwanego danio pręgowanego od 10 do 30 dni po wstrzyknięciu pod kątem pojawienia się widocznego z zewnątrz pierwotnego ERMS.
  2. Po 30 dniach od wstrzyknięcia znieczulić biorcę danio pręgowanego, dodając pojedyncze krople metanosulfonianu trikainy (MS222 4 mg/ml roztwór podstawowy) do szalki Petriego zawierającej wodę z systemu rybnego, aż ruchy wieczka będą spowolnione, a ryby będą nieruchome.
    UWAGA: Dawka znieczulenia tricainowego będzie zależeć od wieku i wielkości danio pręgowanego. Danio pręgowany z pierwotnym nowotworem wymaga mniejszych dawek tricainy.
  3. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wybierz pierwotne ryby z ERMS, które są myf5-GFP-dodatnie i mylpfa-mCherry-dodatnie.

6. Przygotowanie do leczenia nowotworów w ERMS

  1. Wybrane pierwotne rybki pręgowane z ERMS należy umieścić w 1,6 mg/ml metanosulfonianu trikainy (MS222) przez 10 minut lub do momentu, gdy nie będzie widoczny ruch wieczka.
  2. Przetwarzaj każdego danio pręgowanego z nowotworem osobno. Umieść rybę na czystej szalce Petriego i rozprowadź sekcję wokół guza za pomocą żyletki i cienkich kleszczy (jak pokazano na rycinie 1B). Przenieś wypreparowaną tkankę nowotworową na czystą szalkę Petriego.
  3. Dodaj 100 μl wstępnie schłodzonego 0,9x roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) uzupełnionego 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Zmiel tkankę czystą żyletką >20 razy, aż komórki znajdą się w jednolitej zawiesinie.
  4. Dodać 900 μl tego samego buforu (0,9x PBS + 5% FBS), kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby zdysocjować komórki za pomocą końcówki do pipety z filtrem 1000 μl. Przefiltrować przez sitko o oczkach 40 μm do odpowiedniej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać na lodzie.
  5. Umyć szalkę Petriego dodatkowymi 2-4 ml buforu i przepuścić przez ten sam sitko siatkowe do odpowiedniej stożkowej probówki.
  6. Wirować przy 1 000 x g, przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu.
  8. Policz całkowitą liczbę żywotnych komórek za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego i hemocytometru.
  9. Rozcieńczyć komórki do pożądanego stężenia w tym samym buforze (0,9x PBS + 5% FBS). Komórki należy rozcieńczyć do 5 x 103 komórek/μl w celu przeszczepienia 5 μl na biorcę danio pręgowanego w sumie 2,5 x 104 komórki na biorcę.
  10. Analizę cytometrii przepływowej można również przeprowadzić z niewielką ilością zawiesiny z kroku 6.5 w celu ilościowego określenia względnych proporcji komórek fluorescencyjnych w próbce.
    UWAGA: Odłożyć na bok 100 μl zawiesiny komórek (po przefiltrowaniu w kroku 3.5) i rozcieńczyć 400 μl 0,9x PBS + 5% buforu zawiesinowego FBS do analizy cytometrii przepływowej. Aby zapewnić prawidłowe bramkowanie, należy przeprowadzić dodatkową analizę przy użyciu pojedynczej transgenicznej tkanki nowotworowej lub mięśnia wyizolowanego z dorosłej ryby typu dzikiego, myf5-GFP i mylpfa-mCherry. Cytometrię przepływową należy wykonać zasadniczo zgodnie z opisem w kroku 2 w sekcji 1.

7. Przeszczepienie ERMS do dorosłego rag2 homozygotycznego zmutowanego danio pręgowanego

  1. Wyczyść mikrostrzykawkę o pojemności 10 μl 26S G, pobierając i usuwając 10% roztwór wybielacza (5 razy), następnie 70% etanolu (5 razy), a następnie bufor zawiesiny (0,9 x PBS + 5% FBS, 10 razy).
  2. Znieczulić biorcę homozygotycznego zmutowanego rag2 ryby, dodając pojedyncze krople metanosulfonianu trikainy (MS222 4 mg/ml roztwór podstawowy) do szalki Petriego zawierającej ryby w wodzie systemowej, aż ruchy wieczka będą powolne, a ryby pozostaną nieruchome.
  3. Umieść znieczulonego biorcę danio pręgowanego na mokrym ręczniku papierowym lub gąbce, brzuszną stroną skierowaną do góry.
  4. Wstrzyknąć 5 μl zawiesiny komórkowej do jamy otrzewnej (2,5 x 104 komórki na biorcę).
    UWAGA: Igła do wstrzykiwań powinna być czyszczona między wstrzyknięciami różnych guzów, jak opisano w kroku 4.1. Od 5 do 10 μl można skutecznie przeszczepić dootrzewnowo, w zależności od wielkości ryb biorcy. Wszczepienie guza można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie 1 x 104 do 5 x 105 niesortowanych komórek na rybę biorcę (Tabela 1).
  5. Ostrożnie umieść danio pręgowanego w czystym zbiorniku za pomocą plastikowej łyżki.
  6. Oceń biorcę danio pręgowanego pod kątem szybkości wszczepienia po 10, 20, 30 dniach po przeszczepie, obrazując znieczulone ryby w jasnym polu i mikroskopii epifluorescencyjnej.
  7. Wykorzystaj szczepione ryby do dalszych zastosowań, w tym sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu oceny stanu różnicowania (Figura 3H), standardowej analizy histologicznej (Figura 3F), odpowiedzi na terapię obrazową15 i/lub podejść do przeszczepów seryjnych, w tym analizy rozcieńczenia ograniczającego11.

Wyniki

Procedura przygotowania i transplantacji komórek mięśni szkieletowych z $\alpha$-aktyna-RFP transgeniczne donory do homozygotycznych mutantów rag2 u ryb zebrafish z upośledzoną odpornością zostało wykazane (Sekcja 1 Protokołu, Rycina 1A i Rycina 2). Tkankę mięśnia szkieletowego przygotowano z $\alpha$-aktyna-RFP dawców transgenicznych, a otrzymana zawiesina pojedynczych komórek zawierała 84,3% żywych komórek, co oceniono metodą wykluczania DAPI w analizie cytometrii przepływowej (Rysunek 2B). Komórki RFP-dodatnie stanowiły 35,3% tej zawiesiny pojedynczych komórek (Rycina 2C). Transplantacja komórek do grzbietowego mięśnia szkieletowego rag2 ryby biorcy z homozygotyczną mutacją wykazały spójne i silne przyjęcie przeszczepu, co oceniono na podstawie różnicowania pojedynczych komórek w włókna wielojądrowe (1 x 106 liczba komórek wstrzykniętych na rybę, Tabela 1, Rycina 2D-I). Typ dziki odbiorca rybom nie udało się zintegrować włókien mięśniowych w ciągu 30-dniowego eksperymentu (n = 13). Do 10. dnia po transplantacji u 9 z 14 rag2 homozygotyczne mutantowe danio pręgowane posiadały RFP-dodatnie włókna mięśniowe w pobliżu miejsca iniekcji (64,3%, Rycina 2E,F). Co istotne, przeszczepione mięśnie RFP-dodatnie utrzymywały się do 30 dni po transplantacji (Rycina 2G-I), przy czym w podgrupie zwierząt obserwowanych przez 115 dni po przeszczepieniu stwierdzono silne i trwałe przyjęcie się tkanki mięśniowej (dane nie przedstawiono). Wyniki te są zbliżone do raportowanych wcześniej przez naszą grupę23 stosując ten sam protokół (Tabela 1).

Przedstawiliśmy również metodę generowania, przygotowania i transplantacji komórek nowotworowych ERMS do jamy otrzewnej ryb biorców będących homozygotycznymi mutantami rag2 (Sekcja 2 protokołu, Rycina 1B oraz Rycina 3). ERMS generowano u ryb podwójnie transgenicznych myf5-GFP; mylpfa-mCherry, u których wykazano możliwość wizualizacji heterogeniczności wewnątrznowotworowej oraz analizy funkcjonalnej subpopulacji komórek nowotworowych po transplantacji11. Jednak dalsza charakterystyka molekularna każdej subpopulacji jest trudna, ponieważ ryby są małe w momencie rozwoju ERMS między 10. a 30. dniem życia, a liczba komórek nowotworowych jest ograniczona dla zastosowań następczych. Jednym z rozwiązań jest zwiększenie liczby komórek nowotworowych poprzez przeszczepienie ERMS do dorosłych danio pręgowanych biorców. Do tej pory podobne eksperymenty przeprowadzano z użyciem syngenicznych ryb szczepu CG1, co wymagało ponad 4 pokoleń krzyżowania wstecznego w celu opracowania linii syngenicznych transgenicznych dla myf5-GFP; mylpfa-mCherry. Aby rozwiązać te problemy, wykazaliśmy użyteczność immunokompromitowanych homozygotycznych mutantów rag2 jako biorców dla pierwotnych ERMS pochodzących z danio pręgowanych szczepu AB. Wszystkie pierwotne ERMS przeszczepione do zwierząt z homozygotyczną mutacją rag2 przyjęły się, co ułatwiło ekspansję nowotworu (Tabela 1). Podobne wyniki zgłoszono niedawno, gdzie 24 z 27 homozygotycznych mutantów rag2 przyjęły ERMS, podczas gdy 0 z 7 rodzeństwa wild type nie przyjęło zmian chorobowych23. Reprezentatywny przykład przeszczepionego ERMS w 30. dniu po transplantacji pokazano na Rycini 3E. Przeszczepione ERMS wykazują cechy histologiczne rabdomyosarkomy zarodkowej, podobne do tych znalezionych w guzie pierwotnym (Rycina 3B i 3F). Analiza FACS potwierdziła, że ERMS zawierały funkcjonalnie odrębne komórki propagujące nowotwór oraz komórki zróżnicowane, które wykazują ekspresję myf5-GFP i/lub mylpfa-mCherry. Wskaźnik przeżywalności po procedurze wstrzyknięcia dootrzewnowego przekroczył 95%. Danio pręgowane biorcy zazwyczaj giną z powodu obciążenia nowotworowego po 30 dniach od transplantacji.

Muscle and ERMS transplantation diagram; tissue preparation, centrifuge, flow cytometry in zebrafish.
Rycina 1. Schemat protokołu dla (A) normalnego i (B) złośliwego przeszczepu komórek mięśni szkieletowych do rag2 mutant homozygotyczny danio pręgowany. Kroki opcjonalne są oznaczone gwiazdką (*).

Zebrafish transgenics with α-actin-RFP, flow cytometry results, and engraftment bar chart analysis.
Rycina 2. Przeszczepienie mięśnia szkieletowego do rag2 homozygotyczne mutantowe danio pręgowane. (A) α-aktyna-RFP transgeniczne danory danio pręgowanego. (B) Żywotność komórek w izolowanej zawiesinie komórek mięśniowych oceniona za pomocą wykluczania barwnika DAPI i cytometrii przepływowej. (C) Odsetek komórek RFP-dodatnich stwierdzonych w zawiesinie komórek mięśniowych z $\alpha$-aktyna-RFP dawcy (czerwony), w porównaniu do typ dziki kontrola (szary). (D-E) Nałożone na siebie obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne przedstawiające typ dziki zwierzęta (D) lub rag2 homozygotyczne ryby mutanty (E) w 30. dniu po transplantacji. (F) Wskaźniki przyjęcia przeszczepu w czasie. Kolor czerwony oznacza liczbę zwierząt, u których doszło do przyjęcia przeszczepu, natomiast kolor szary oznacza ryby, u których nie doszło do przyjęcia. Wskazano liczbę zwierząt analizowanych w każdym punkcie czasowym. (G-I) Obrazy powiększone obszaru zaznaczonego ramką w panelu E przedstawione w powiększeniu 10 (G), 20 (H) i 30 (I) dni po transplantacji, wykazujące utrzymywanie się zróżnicowanych włókien mięśniowych w czasie (groty strzałek). Paski skali odpowiadają 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Zebrafish ERMS analysis, histological images, flow cytometry data, tumorigenesis study chart.
Rycina 3. Transplantacja myf5-GFP; mylpfa-mCherry wprowadzenie do ERMS rag2 mutant homozygota danio pręgowany (A-D) rag2-kRASG12D indukowany pierwotny ERMS rozwijający się u szczepu AB myf5-GFP; mylpfa-mCherry danio pręgowany w 30. dniu życia. (E-H) rag2 homozygotyczne mutanty rybek danio pręgowanych z przeszczepionym ERMS, analizowane 30 dni po transplantacji. (A, E) Połączone obrazy w polu jasnym i fluorescencyjnym pierwotnego oraz przeszczepionego ERMS. Obszar guza jest obrysowany, a grot strzałki wskazuje miejsce wstrzyknięcia w E. (B, F) barwione hematoksyliną i eozyną skrawki parafiny z guza pierwotnego (B) oraz przeszczepionego ERMS (F) przedstawiające obszary zwiększonej komórkowości związane z nowotworem. (C, G) Żywotność komórek oceniana za pomocą wykluczania barwnika DAPI i cytometrii przepływowej. (D, H) Fluorescencyjne subpopulacje komórek nowotworowych, ocenione metodą cytometrii przepływowej. Paski skali odpowiadają 2 mm (A, E) i 50 μm (B, F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela danych dotyczących transplantacji: typ tkanki, wiek dawcy, miejsce wstrzyknięcia i wskaźniki przyjęcia przeszczepu.
Tabela 1. Wyniki przyjęcia przeszczepu dla transplantacji komórek mięśniowych i ERMS. (*) oznacza dane zgłoszone wcześniej z wykorzystaniem tych samych technik23. Dane przedrukowano za zgodą Nature Methods. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.

Dyskusja

Skuteczne i solidne wszczepienie dorosłego grzbietowego mięśnia szkieletowego osiągnięto za pomocą bardzo prostej metody przygotowania komórek, a następnie wstrzyknięcia komórek do mięśni grzbietowych homozygotycznych zmutowanych ryb. Ogólnie rzecz biorąc, procedury wstrzyknięć domięśniowych były bardzo solidne, z pewną towarzyszącą śmiercią bezpośrednio po zabiegu implantacji, wahającą się od 10% do 35% w zależności od eksperymentu. Dodatkowa optymalizacja będzie prawdopodobnie koncentrować się na wykorzystaniu igieł o mniejszej średnicy do iniekcji oraz opracowaniu stacjonarnej aparatury iniekcyjnej z wykorzystaniem mikroskopu i mikromanipulatora, co ułatwi wszczepianie komórek. W naszym podejściu wykorzystaliśmy również niesortowane komórki mięśniowe pochodzące od zwierząt dawców i zawierały one tylko około 30% komórek progenitorowych mięśni. Zastosowanie transgenicznych linii reporterowych, które znakują komórki macierzyste i izolację FACS, prawdopodobnie zapewni wzbogacone zawiesiny komórek, które doprowadzą do zwiększonego wszczepienia do ryb biorców. Komórki mięśni szkieletowych mogą być również wzbogacone i hodowane przed przeszczepem, jak opisano wcześniej29. Co ciekawe, nasze wyniki wskazują również, że etapy tworzenia niszy i różnicowania tkanki mięśniowej dawcy zachodzą przed 10 dniami po przeszczepie, ustanawiając ten model jako solidną i szybką platformę eksperymentalną do oceny przeszczepu i regeneracji mięśni. Co więcej, eksperymenty te wyraźnie kontrastują z tymi przeprowadzonymi na myszach, u których wymagane jest wcześniejsze uszkodzenie mięśni za pomocą kardiotoksyny lub chlorku baru na dwa dni przed wszczepieniem30,31. Jest prawdopodobne, że zranienie igły powstałe podczas procedury przeszczepu nasila wszczepienie poprzez stymulację produkcji środowiska regeneracyjnego u zwierzęcia biorcy32,33. Przewidujemy również, że nasza metoda będzie łatwo przystosowana do przeszczepiania tkanki mięśni szkieletowych od młodszego danio pręgowanego, co pozwoli na ocenę mutacji genetycznych, które wpływają na wczesny rozwój mięśni szkieletowych, ale prowadzą do śmiertelności w stadiach larwalnych.

Dostarczyliśmy również szczegółowy protokół wszczepiania ERMS danio pręgowanego przez wstrzyknięcie dootrzewnowe do niekondycjonowanych, homozygotycznych zmutowanych ryb rag2 . Podejście to było przydatne do ekspansji podwójnie transgenicznych guzów pierwotnych bez potrzeby generowania guzów w obrębie syngenicznej linii transgenicznej. Nasze ostatnie prace wykazały, że podejścia do przeszczepiania komórek dostarczają nowatorskich modeli eksperymentalnych do oceny wrażliwości leków ERMS in vivo, gdzie pojedynczy guz może zostać rozszerzony na tysiące zwierząt i oceniony pod kątem wpływu na wzrost, samoodnowę i neowaskularyzację15. Co więcej, udało nam się wszczepić szeroki zakres nowotworów do homozygotycznych zmutowanych ryb rag2 , w tym ostrą białaczkę limfoblastyczną z komórek T, czerniaka i ERMS23. Patrząc w przyszłość, przewidujemy, że linie te będą przydatne do oceny ważnych właściwości funkcjonalnych raka in vivo , w tym do oceny heterogeniczności wewnątrznowotworowej, inwazji, przerzutów, angiogenezy i oporności na terapię. Co więcej, pokolenie homozygotycznych zmutowanych ryb rag2 w optycznie czystym szczepie zebry Casper34 prawdopodobnie ułatwi bezpośrednie obrazowanie wielu z tych cech charakterystycznych raka.

W sumie zapewniamy szczegółowe protokoły udanego wszczepienia znakowanych fluorescencyjnie normalnych i złośliwych mięśni szkieletowych do dorosłego rag2 homozygotycznego zmutowanego zegmuntowanego danio pręgowanego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Alex's Lemonade Stand Foundation (D.M.L.), American Cancer Society (D.M.L.), MGH Howard Goodman Fellowship (D.M.L.) oraz granty US National Institutes of Health R24OD016761 i 1R01CA154923 (D.M.L.). CNY Flow Cytometry Core and Flow Image Analysis, grant na wspólne oprzyrządowanie numer 1S10RR023440-01A1. I.M.T. jest finansowany ze stypendium Portugalskiej Fundacji na rzecz Nauki i Technologii (Fundação para a Ciência e Tecnologia – FCT). Q.T. jest finansowany przez Chińską Radę Stypendialną. Dziękujemy Angeli Volorio za pomocne komentarze i rady.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór buforowy Tris-EDTA 1xSigma-Aldrich93283-100MLMikroiniekcja. Mieszanka wtryskowa.
Chlorek potasuFisher Science EducationS77375-1Mikroiniekcja. Mieszanka wtryskowa.
Enzym restrykcyjny XhoI NewEngland BiolabsR0146Smikroiniekcja. Linearyzacja plazmidu.
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104 (50) lub 28106 (250)Mikroiniekcja. Do oczyszczania zlinearyzowanego plazmidu do 10 kb.
Alkohol fenolowy/chloroformowy/izoamylowyFisher ScientificBP1753I-100Mikroiniekcja. Do oczyszczania zlinearyzowanego plazmidu.
Ultraczysta agaroza, 500  gInvitrogen16500-500Mikroiniekcja. Linearyzowana kwantyfikacja plazmidu.
Spektrofotometr Nanodrop 2000Thermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspxmikroiniekcją. Linearyzowana kwantyfikacja plazmidu.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Life TechnologiesD1306cytometria przepływowa/FACS
5 ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnem Probówkapobierania cytometrii przepływowej352058 BD Falcon
FACSAria IIProgrambadawczych na specjalne zamówienie (SORP)FACS
5 ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnemBD Falcon352063Probówka zbiorcza FACS
BD LSR IIBD BiosciencesSpecial Order Research Products (SORP) programcytometria przepływowa
buforowana fosforanami, pH 7,4 (1x)Life Technologies10010-023przeszczep
Surowica bydlęcapłodu Omega ScientificFB-01przeszczep
metanosulfonianu trikainy (MS-222)Western Chemical Inc.http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.htmlTransplantacja. Znieczulenia. Uwaga: Działa drażniąco. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę.
VWR Chłonne podkładki pod ławkiVWR VWR56616-018Transplantacja. Jako alternatywę można użyć zwykłych ręczników papierowych lub gąbki.
Przemysłowe żyletki Singe EdgeVWR55411-050szalka Petriego do przeszczepów
przeszczepówpolistryrenuVWR25384-302
40 i mikro; m NylonFalcon-Corning Incorporated352340transplantacja
50 ml Probówka wirówkowaCorning Incorporated 430828transplantacja
Trypan Blue Stain (0,4%)Life Technologies15250-061transplantacyjnego
 przeszczepówHausser Scientific1483
, stała igła, objętość 10 i mikro; l, rozmiar igły 26s ga (końcówka skośna)Hamilton80366transplantacja
Austin's A-1 Bleach, komercyjnyJames Austin Company. Można zastosować dowolne rozwiązanie komercyjne.
Etanol 190 ProofDecon Labs, Inc.DSP-MD.43Mikroiniekcja (linearyzacja oczyszczania plazmidu) i przeszczep. Dowolna reklama  można użyć roztworu.
Mikrowirówka szybkoobrotowa, mikrowirówka cyfrowa 300DDenville Scientific Inc.C0265-24transplantacja
Wirówka Sorvall Legend XFRThermo Scientific75004539 transplantacja. Numer katalogowy dla 120 V, 60 Hz (USA).
Pipety serologiczne 5 mlBD Falcon357529transplantacji
Corning Stripettor Plus Kontroler pipetowaniaCorning Incorporated4090Transplantation. Można użyć dowolnego automatycznego kontrolera pipetowania.
Bezpudrowe rękawiczkiWszystkie kroki. Można użyć dowolnej marki komercyjnej.
Filtruj końcówki do pipet i mikropipetyWszystkie kroki. Można użyć dowolnej marki komercyjnej.
Kleszcze Dumonta #5Fine Science Tools11205-20transplantacja
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyOlympusMVX10Punktacja. Można użyć dowolnego odpowiedniego fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego.
Aparat cyfrowy Olympus DP72mikroskop OlympusDP72Punktacja. Można użyć wielu kamer odpowiednich do wybranego systemu obrazowania.
do BD produktów Sól fizjologiczna , jednorazowe sterylne sitko do z, zestaw hememytometru Strzykawka Hamiltona do przeszczep do badań

Bibliografia

  1. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29 (11), (2013).
  2. Boatman, S., Barrett, F., Satishchandran, S., Jing, L., Shestopalov, I., Zon, L. I. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood cells, molecule., & diseases. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Langenau, D. M., Traver, D., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  4. Yang, H. W., Kutok, J. L., et al. Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish Targeted Expression of Human MYCN Selectively Causes Pancreatic Neuroendocrine Tumors in Transgenic Zebrafish. Cancer Research. , 7256-7262 (2004).
  5. Patton, E. E., Widlund, H. R., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current Biology. 15 (3), 249-254 (2005).
  6. Sabaawy, H. E., Azuma, M., Embree, L. J., Tsai, H. -J., Starost, M. F., Hickstein, D. D. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (41), 15166-15171 (2006).
  7. Langenau, D. M., Keefe, M. D., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Gene. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  8. Le, X., Langenau, D. M., Keefe, M. D., Kutok, J. L., Neuberg, D. S., Zon, L. I. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  9. Park, S. W., Davison, J. M., Rhee, J., Hruban, R. H., Maitra, A., Leach, S. D. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  10. Zhuravleva, J., Paggetti, J., et al. MOZ/TIF2-induced acute myeloid leukaemia in transgenic fish. British journal of haematology. 143 (3), 378-382 (2008).
  11. Ignatius, M. S., Chen, E. Y., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Suppl Data. Cancer cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  12. Blackburn, J. S., Liu, S., et al. Clonal Evolution Enhances Leukemia-Propagating Cell Frequency. Cancer cell. 25 (3), 366-378 (2014).
  13. Blackburn, J. S., Langenau, D. M. Zebrafish as a model to assess cancer heterogeneity, progression and relapse. Disease model. 7 (7), 755-762 (2014).
  14. Zhao, C., Wang, X., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS one. 6 (7), e21768(2011).
  15. Chen, E. Y., DeRan, M. T., et al. Glycogen synthase kinase 3 inhibitors induce the canonical WNT/β-catenin pathway to suppress growth and self-renewal in embryonal rhabdomyosarcoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5349-5354 (2014).
  16. Yang, X. -J., Cui, W., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PloS one. 8 (4), e61801(2013).
  17. Chapman, A., Fernandez del Ama, L., Ferguson, J., Kamarashev, J., Wellbrock, C., Hurlstone, A. Heterogeneous Tumor Subpopulations Cooperate to Drive Invasion. Cell Reports. 8 (8), 1-8 (2014).
  18. Smith, A. C. H., Raimondi, A. R., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
  19. Iyengar, S., Houvras, Y., Ceol, C. J. Screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model. Journal of visualized experiments JoVE. (69), e50086(2012).
  20. Mizgireuv, I., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
  21. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291, 293-296 (1981).
  22. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2790(2011).
  23. Tang, Q., Abdelfattah, N. S., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nature methods. 11, 821-824 (2014).
  24. Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. Humanized NOD-SCID IL2rg–/– mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies. Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).
  25. Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).
  26. Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).
  28. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon PRess. Eugene, OR. (2000).
  29. Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors). Muscl, & nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
  30. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).
  31. Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration. J Vis Exp. (83), e50532(2014).
  32. Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell. The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).
  33. Rowlerson, a, Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio. Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).
  34. White, R. M., Sessa, A., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transplantacja u danio pr gowanegodanio pr gowany z niedoborem odporno ciizolacja kom rek mi niowychtransplantacja fluorescencyjnych kom rek mi niowychzarodkowy rabdomiosarkomryby z mutacj Rag2iniekcja w mi ni grzbietowiniekcja do jamy otrzewnejepi mikroskopia fluorescencyjnaanaliza cytometryczna

Powiązane artykuły