Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mysich indukowanych alleli telomerazy w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52599

⸱

13 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, UT MD Anderson Cancer Center, 2Novartis Institutes for Biomedical Research, 3Sanofi US, 4Institute of Applied Cancer Science, UT MD Anderson Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Telomery i telomeraza odgrywają istotną rolę w procesie starzenia się i nowotworzenia. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób wygenerować dwa mysie indukowane allele knock-in telomerazy i jak je wykorzystać w badaniach nad degeneracją/regeneracją tkanek i rakiem.

Streszczenie

Utrata integralności genomu spowodowana dysfunkcją telomerów i związane z tym uszkodzenia DNA, sygnalizacja i reakcje punktów kontrolnych są dobrze znanymi czynnikami, które powodują degenerację tkanek podczas starzenia. Rak, którego częstość występowania znacznie wzrasta wraz z wiekiem, charakteryzuje się krótkimi długościami telomerów i wysoką aktywnością telomerazy. Aby zbadać rolę dysfunkcji telomerów i reaktywacji telomerazy w starzeniu się i nowotworach, protokół pokazuje, jak wygenerować dwa indukowane przez myszy allele knock-in telomerazy: receptor TERT-estrogenowy indukowany 4-hydroksytamoksyfenem (4-OHT) i receptorem TERT-Estrogen indukowany przez mysz (mTERT-ER) i Lox-Stopper-LoxTERT (LSL-mTERT). Protokół opisuje procedury indukowania dysfunkcji telomerów i reaktywacji aktywności telomerazy u myszy mTERT-ER i LSL-mTERT in vivo. Reprezentatywne dane pokazują, że reaktywacja aktywności telomerazy może złagodzić fenotypy zwyrodnieniowe tkanek wywołane dysfunkcją telomerów. W celu określenia wpływu reaktywacji telomerazy na nowotworzenie wygenerowaliśmy model guza prostaty G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L oraz chłoniaka z komórek T grasicy model G4 Atm-/- mTERTER/ER. Reprezentatywne dane pokazują, że reaktywacja telomerazy w kontekście niestabilności genomowej wywołanej dysfunkcją telomerów może znacznie zwiększyć nowotworzenie nowotworów. Protokół opisuje również procedury stosowane do izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) od myszy mTERT-ER i LSL-mTERT oraz reaktywacji aktywności telomerazy w NSC in vitro. Reprezentatywne dane pokazują, że reaktywacja telomerazy może zwiększyć zdolność do samoodnawiania się i neurogenezy in vitro. Wreszcie, protokół opisuje procedury wykonywania telomerów FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) zarówno na mysich tkankach mózgowych FFPE (Formalin Fixed and Paraffin Embedded), jak i chromosomach metafazowych hodowanych komórek.

Wprowadzenie

Telomeraza jest enzymem odpowiedzialnym za utrzymanie telomerów. Są to powtarzające się sekwencje na końcach chromosomów, które chronią ich integralność. Podstawowymi składnikami holoenzymu telomerazy są podjednostka katalityczna odwrotnej transkryptazy (TERT) i podjednostka RNA (TERC), która służy jako matryca do dodawania powtórzeń telomerowych1,2. Chociaż telomeraza jest na ogół tłumiona w zróżnicowanych komórkach somatycznych, wykazuje silną aktywność i odgrywa ważną rolę w komórkach rozrodczych, komórkach rakowych i komórkach macierzystych.

myszy z nokautem mTERC i mTERT dostarczają doskonałych systemów modelowych in vivo do badania funkcji telomerazy zarówno w komórkach macierzystych, jak i w raku. Myszy z nokautem mTERC i mTERT (G1) nie wykazywały żadnych oczywistych fenotypów ze względu na długą rezerwę telomerów u myszy3. Jednak seryjne krzyżowanie myszy z nokautem mTERC i mTERT do późnej generacji (G5-G6) spowodowało postępującą erozję telomerów i ostatecznie sprowokowało poważną degenerację wysoce proliferacyjnych tkanek4. Myszy mTERC-/- późnej generacji (G5-G6) są bezpłodne ze względu na wysokie wskaźniki apoptozy jąder i zubożenie komórek rozrodczych. Myszy G5-G6 mTERC-/- wykazują również fenotypy zwyrodnieniowe w wysoce proliferacyjnych tkankach, w tym szpiku kostnym, jelicie i skórze, ze względu na wysokie wskaźniki apoptozy i wadliwą zdolność do samoodnawiania się w przedziałach tkanek macierzystych / progenitorowych4. Hematopoetyczne komórki macierzyste w szpiku kostnym myszy mTERC-/- późnej generacji wykazują utratę potencjału proliferacyjnego, upośledzoną zdolność do samoodnawiania, zwiększoną apoptozę i ostatecznie wyczerpanie funkcjonalne5,6. Podobnie, stopniowo zwiększające się ciała apoptotyczne w kryptach jelitowych obserwowano w każdym kolejnym pokoleniu myszy G1-G6 mTERC-/- 7,8. Szkodliwy wpływ dysfunkcyjnych telomerów nie wydaje się ograniczać do tkanek o wysokim wybrocie, ponieważ zarówno proliferacja dorosłych nerwowych komórek macierzystych in vitro, jak i neurogeneza in vivo były poważnie upośledzone u myszy mTERC-/- późnej generacji (G4-G5) 9. Rola telomerazy w komórkach macierzystych jest dodatkowo poparta odkryciami dotyczącymi rzadkiej choroby genetycznej człowieka dyskeratozy wrodzonej (DKC), która pod pewnymi względami przypomina przedwczesne starzenie się10,11. DKC jest spowodowany mutacjami w TERC, TERT i genach kodujących dyskerynę, podstawową podjednostkę telomerazy i inne białka związane z dyskeryną12. Średnio telomery u pacjentów z DKC są krótsze niż w 99% grupy kontrolnej w tym samym wieku. Główną zachorowalnością choroby jest niedokrwistość aplastyczna, która jest spowodowana wadliwym utrzymaniem hematopoetycznych komórek macierzystych. Inne aspekty choroby, takie jak leukoplakia jamy ustnej, dystrofia paznokci, upośledzenie umysłowe, atrofia jąder i powikłania płucne sugerują upośledzone funkcje tkankowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych10, co jest ściśle zgodne z wynikami u późnej generacji myszy z nokautem telomerazy. Pacjenci z DKC są podatni na zespół mielodysplastyczny i mają zwiększoną częstość występowania złośliwych nowotworów błony śluzowej. Tak więc niedobór telomerazy u ludzi podsumowuje defekty funkcji komórek macierzystych i predyspozycji do guza, które obserwuje się u myszy z nokautem telomerazy późnej generacji.

Krótkie telomery i wysoka aktywność telomerazy to cechy charakterystyczne raka. Gdy normalne lub przednowotworowe komórki dzielą się, niska lub nieobecna aktywność telomerazy powoduje ostateczną erozję telomerów i aktywację komórkowych punktów kontrolnych podobnych do tych wywołanych przez dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB)13. Wykazano, że podobnie jak klasyczne DSB, dysfunkcja telomerów indukuje p53 i związane z nim odpowiedzi komórkowe, takie jak starzenie się i / lub apoptoza14,15. Po inaktywacji mutacji p53 cykl komórkowy i przeżycie komórki są zwiększone w komórkach z dysfunkcją telomerów, co zapewnia prorakotwórczy mechanizm mutatora charakteryzujący się translokacjami oraz regionalnymi amplifikacjami i delecjami16,17. Jednocześnie ciągła dysfunkcja telomerów i związana z nią szalejąca niestabilność chromosomalna (nawet w komórkach zerowych p53) wydają się ograniczać pełną złośliwą progresję takich nowotworów. Na przykład myszy późnej generacji G4-G5 mTERC-/- Ink4a/Arf-/- wykazywały znacznie zmniejszoną częstość występowania chłoniaka w porównaniu z myszami zerowymi Ink4a/Arf z powodu ścierania telomerów. W innym badaniu bardziej zaawansowane zmiany gruczolakowate u myszy G4 mTERT -/- APCmin były znacznie stłumione w porównaniu z myszami APC min z powodu znacznego zatrzymania wzrostu i apoptozy18,19. Obserwacja, że niestabilność genomowa wywołana dysfunkcją telomerów hamuje progresję guza, skłania do spekulacji, że aktywacja telomerazy może umożliwić złośliwą progresję częściowo poprzez stłumienie niestabilności genomu do poziomu zgodnego z żywotnością komórek rakowych i / lub neutralizację mechanizmów punktów kontrolnych zależnych lub niezależnych od p53.

Aby zbadać, czy reaktywacja telomerazy może zatrzymać lub nawet odwrócić starzenie się komórek macierzystych, oraz czy reaktywacja telomerazy może sprzyjać nowotworzeniu na tle niestabilności genomu, wygenerowaliśmy dwa indukowane mysie allele telomerazy. Pierwszym z nich jest allel knock-in indukowany przez 4-hydroksytamoksyfen (4-OHT) induplikowany receptorem TERT-estrogenowym (mTERT-ER). W przypadku braku 4-OHT, myszy homozygotyczne pod względem mTERT-ER (oznaczone mTERTER / ER) mają niedobór aktywności telomerazy i utrzymują te same fenotypy cytogenetyczne i komórkowe, co konwencjonalny model nokautu mTERT lub mTERC. Po leczeniu 4-OHT aktywność białka TERT-ER może zostać przywrócona do poziomów porównywalnych z natywnym białkiem TERT20, 21. Drugi allel jest nowym indukowalnym allelem knock-in TERT zawierającym intronową kasetę LoxP-Stopper-LoxP (LSL-mTERT); po wycięciu LSL za pośrednictwem Cre, mTERT ulega reekspresji w endogennych mechanizmach kontroli ekspresji22.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kroki w tym protokole zostały zatwierdzone przez UT MD Anderson Cancer Center.

1. Generowanie allelu mTERT-ER

  1. Wprowadzić wektor celowania knock-in zawierający ERT2-LBD (domenę wiążącą ligand) przed i w ramce z sekwencją genomową mTERT (ekson 1 do intronu 2) i fragment Lox-pgk-Neo-Lox (figura 1A) do mysich komórek ES za pomocą elektroporacji.
  2. Hoduj komórki ES w neomycynie przez 6-10 dni. Wybierz klony odporne na neomycynę i rozmnożyj się w 48 płytkach. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu i potwierdź allel knock-in za pomocą southern blot.
  3. Wstrzyknąć dwie linie ES z ponad 95% prawidłowymi kariotypami do blastocyst C57BL/6 za pomocą zestawu do mikromanipulacji pod mikroskopem odwróconym. Wszczepić blastocysty do macicy matek zastępczych23. Kryj wysokiej jakości samce chimery (70-90%) z samicami C57BL/6.
  4. Potwierdź genotypowanie heterozygotycznych zwierząt mTERT-ERneo za pomocą southern blot.
  5. Połącz heterozygotyczne zwierzęta mTERT-ERneo i zwierzęta EIIa-Cre, aby usunąć kasetę NeoR. Łącz heterozygotyczne zwierzęta ze zwierzętami C57BL/6 co najmniej trzy razy, a następnie krzyżuj heterozygotyczne zwierzęta mTERT-ER, aby uzyskać homozygotyczność.

2. Generowanie allelu LSL-mTERT

  1. Wprowadzić wektor celujący knock-in zawierający fragment LoxP-triple Stopper-Neo-LoxP i sekwencję genomową mTERT (między eksonem 1 a intronem 2, figura 1B) do mysich komórek ES z elektroporacją23.
  2. Hoduj komórki ES w neomycynie przez 6-10 dni. Wybierz klony odporne na neomycynę i rozmnożyj się w 48 płytkach. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu i potwierdź allel knock-in za pomocą southern blot23.
  3. Wstrzyknąć dwie linie ES z ponad 95% prawidłowymi kariotypami do blastocyst C57BL/6 za pomocą zestawu do mikromanipulacji pod mikroskopem odwróconym. Wszczepić blastocysty do macicy matek zastępczych23. Kryj wysokiej jakości samce chimery (70-90%) z samicami C57BL/6.
  4. Potwierdzić genotypowanie heterozygotycznych zwierząt LSL-mTERT za pomocą southern blot.
  5. Kryj heterozygotyczne zwierzęta ze zwierzętami C57BL/6 co najmniej trzy razy, a następnie krzyżuj heterozygotyczne zwierzęta LSL-mTERT w celu uzyskania homozygotyczności.

3. Reaktywacja telomerazy u myszy mTERT-ER i LSL-mTERT In Vivo

Dla mTERT-ER

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed wstrzyknięciem.
  2. Znieczulić myszy komorą izofluranową (4% do indukcji, 2% do utrzymania) w mieszaninie 50% (v/v) tlenu/50% (v/v) tlenku diazotu. Lub znieczulić myszy mieszaniną ketaminy i ksylazyny (100 mg/kg masy ciała + 10 mg/kg masy ciała).
  3. Po osiągnięciu głębokiego znieczulenia należy wyjąć znieczulone zwierzę z komory indukcyjnej i trzymać jego głowę w rurce połączonej z komorą izofluranu (2%).
  4. Uszczypnij opuszki stóp myszy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone. Nałóż maść na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Przetrzyj tył myszy roztworem jodu powidonu.
  5. Wstrzyknąć wolno uwalniający się granulat 4-OHT z precyzyjnym trocharem (10 G) pod skórę pleców i wepchnąć granulkę aż do linii środkowej między dwoma ramionami.
  6. Uszczelnij nacięcie za pomocą aplikatora do spinania ran i monitoruj myszy pod kątem powrotu do zdrowia po znieczuleniu. Usuń klipsy 10 dni później. Dodatkowe ogrzewanie nie jest konieczne, ponieważ procedura jest wkrótce zakończona.
  7. Okres leczenia granulatem 4-OHT powinien być zoptymalizowany w zależności od celu badania.

Dla LSL-mTERT

  1. Tamoksyfen (10 mg/ml, rozpuszczony w oleju kukurydzianym) wstrzykuje się dootrzewnowo dwa kolejne dni (200 ul/25 g/dobę).

4. Izolacja nerwowych komórek macierzystych i reaktywacja telomerazy in vitro

  1. Myszy są poddawane eutanazji dwutlenkiem węgla, a mózgi są usuwane. Postępuj zgodnie z protokołem dostępnego na rynku zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych zgodnie z producentem.
  2. Zawiesić liofilizowany proszek w fiolce oznaczonej Roztwór 4 z 1 ml pożywki do hodowli komórkowych dla Roztworu 4. Nie wirować. Roztwór ten należy następnie podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze –20 °C do późniejszego wykorzystania.
  3. Przed użyciem podgrzej mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  4. Przygotuj mieszankę enzymów 1: roztwór 1 (50 μl) i roztwór 2 (1,900 μl). Przygotuj mieszankę enzymów 2: roztwór 3 (20 μl) i roztwór 4 (10 μl).
  5. Przygotuj 1 950 μl mieszanki enzymów 1 na zawartość do 400 mg tkanki i wiru. Przed użyciem podgrzej mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  6. Wyjmij 1-dniowy mózg myszy i zachowaj przodomózgowie, usuwając opuszki węchowe i móżdżek. Tkanki przodomózgowia należy przechowywać w 1 ml zimnej pożywki hodowlanej od momentu wyjęcia i przechowywać w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że tkanka nerwowa została przetworzona w ciągu 1 godziny.
  7. Określ masę tkanki, aby upewnić się, że limit 400 mg na trawienie nie został przekroczony. Umieść mózg na pokrywie szalki Petriego o średnicy 35 mm i zmiażdż mózg skalpelem.
  8. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml dodać 1 ml HBSS (bez Ca/Mg) i kawałki pipet z powrotem do probówki o pojemności 15 ml. Spłukać HBSS (bez Ca/Mg). Wirować przy 300 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysać supernatant.
  9. Dodać 1,950 μl wstępnie podgrzanej mieszanki enzymów 1 (roztwory 1 i 2) na maksymalnie 400 mg tkanki. Inkubować w probówce o pojemności 15 ml przez 15 minut w temperaturze 37 °C, mieszając przez odwrócenie lub wstrząsnięcie probówki co 5 minut.
  10. Przygotować 30 μl mieszanki enzymatycznej 2 na próbkę tkanki, dodając 20 μl roztworu 3 do 10 μl roztworu 4. Następnie dodaj do próbki. Delikatnie odwróć, aby wymieszać. Nie wirować.
  11. Mechanicznie rozdziel tkankę za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura z szeroką końcówką, pipetując w górę i w dół 10 razy powoli. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  12. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, odwracając probówkę co 3 minuty.
  13. Powtórzyć kroki 4.11 i 4.12, jeśli tkanki są większe niż 200 mg.
  14. Zawiesinę komórkową nanieść na sitko o pojemności 70 μm, umieszczone w probówce o pojemności 50 ml. Nanieść 10 ml PBS przez sitko do komórek. Odrzucić sitko do komórek i zawiesinę komórek wirówki w ilości 300 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odessać supernatant.
  15. Ponownie zawiesić komórki z pożywką z komórek macierzystych do wymaganej objętości do dalszych zastosowań.
  16. Aby aktywować telomerazę w NSC LSL-mTERT, należy traktować komórki 100 μM 4-OHT przez dwa dni. Aby aktywować telomerazę w mTERT-ER NSC, należy trzymać komórki w pożywce z 100 μM 4-OHT.

5. Telomer RYBA

  1. Przygotuj chromosomy metafazy z hodowanych komórek.
  2. W przypadku odcinków tkanek FFPE (Formalin Fixed and Paraffin Embedded) należy odparafinować ksylen i ponownie uwodnić w serii etanolowej przez 5 minut każdy (100%, 90%, 70%, 50% etanolu) i PBS przez 5 minut.
  3. Po utrwaleniu w metanolu: kwas octowy (3:1) przez 1-2 godziny. Odwodnić w zimnej serii etanolu po 5 minut (70%, 90%, 100% etanolu) i wysuszyć na powietrzu. Prać w 1x PBS w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  4. Denaturować chromosomy w 4% formaldehydzie w temperaturze 37 °C przez 2 min. Odwodnić w zimnych seriach etanolowych po 5 minut (70%, 90%, 100% etanolu) i wysuszyć na powietrzu.
  5. Na każde szkiełko nanieść od 12 do 25 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej PNA. (Mieszanka hybrydyzacyjna: 70% formamidu, 0,06x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng/μl tRNA, 0,5 ng/μl telomery lub sondy centromerowe)
  6. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe cementem gumowym. Preparacje chromosomowe i skrawki tkanek po denaturacji w temperaturze 80 °C przez 4 min. Hybrydyzować w temperaturze pokojowej lub 37 °C przez 2-4 godziny w wilgotnej komorze.
  7. Prać w temperaturze pokojowej z użyciem buforu myjącego 2 x 15 min. (Bufor do mycia: 70% formamidu, 0,06x SSC, pH 7,2). Prać w temperaturze pokojowej 3 x 5 min z PBST. Szkiełka podstawowe z DAPI lub fluorescencją dalekiej czerwieni do badań mikroskopowych.

Wyniki

Strategie generowania mysich alleli knock-in mTERT-ER oraz LSL-mTERT zostały przedstawione na Rysunku 1A i 1B. W szczególności, fragment LoxP-triple Stopper-Neo-LoxP został wstawiony pomiędzy ekson 1 a ekson 2 locus mTERT w celu wygenerowania allelu LSL-mTERT. Aby wygenerować allel mTERT-ER, domena ERT2-LBD w ramce odczytu z genem mTERT została wstawiona do N-końca eksonu 1. Wykazaliśmy, że gdy telomeraza została przejściowo reaktywowana u myszy z dysfunkcją telomerów poprzez podanie pelletów z 4-OHT przez 4 tygodnie, fenotyp degeneracyjny uległ poprawie w wielu narządach, takich jak mózg (Rysunek 2A) i jądra (Rysunek 2B). Aby określić wpływ reaktywacji telomerazy na komórki hodowane in vitro, wyizolowaliśmy neuralne komórki macierzyste (NSCs) z myszy późnych generacji G4 LSL-mTERT oraz G4 mTERT-ER. Wykazaliśmy, że po reaktywacji telomerazy w dysfunkcyjnych telomerowo NSCs, zdolność NSCs do samoodnawiania znacznie wzrosła (Rysunek 3A), a neurogeneza in vitro została również istotnie nasilona (Rysunek 3B). Aby określić wpływ reaktywacji telomerazy na tumorigenezę w kontekście dysfunkcji telomerów, wygenerowaliśmy kohorty późnych generacji PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L (model nowotworu prostaty) oraz Atm-/- mTERTER/ER (model chłoniaka T-komórkowego grasicy). Gdy telomeraza została reaktywowana za pomocą tamoksyfenu w tych myszach poprzez iniekcje (Rysunek 4A) lub pellety z 4-OHT przez 8 tygodni (Rysunek 4B), tumorigeneza uległa znacznemu nasileniu zarówno w modelu nowotworu prostaty (Rysunek 4A), jak i w modelu chłoniaka T-komórkowego grasicy (Rysunek 4B). Na koniec przedstawiliśmy protokoły przeprowadzania telomerowej hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) na tkankach mózgu myszy utrwalonych w FFPE (Rysunek 5) oraz na chromosomach w metafazie (Rysunek 5, wstawka).

Schemat edycji genów pokazujący celowanie w mTERT z miejscami LoxP, Neo stop i sondami do analizy.
Rycina 1: (A) Strategia knock-in mTERT-ER. TV, wektor celujący; WT, allel typu dzikiego; KI, allel knock-in; LA, lewe ramię; RA, prawe ramię; E1, ekson 1; E2, ekson 2; neo, gen oporności na neomycynę sterowany promotorem pgk; ER, zmodyfikowana domena wiążąca ligand receptora estrogenowego (ERT2); DT, gen toksyny błoniczej. (B) Strategia knock-in LSL-mTERT. TV, wektor celujący; WT, allel typu dzikiego; KI, allel knock-in; LA, lewe ramię; RA, prawe ramię; E1, ekson 1; E2, ekson 2; neo, gen oporności na neomycynę sterowany promotorem pgk; STOPPER, trzy powtarzające się sekwencje stop transkrypcyjnego; DT, gen toksyny błoniczej.

Porównanie histologii mózgów i jąder, placebo vs. leczenie 4-OHT w etapach G0 i G4.
Rycina 2: Reprezentatywne dane wykazujące, że reaktywacja telomerazy łagodzi fenotypy degeneracyjne narządów. Reprezentatywne obrazy mózgów (po lewej) oraz jąder (po prawej) myszy mTERT-ER G0 i G4 leczonych placebo lub 4-OHT przez 4 tygodnie. Paski skali oznaczają 50 µm. Przedruk za zgodą 20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia komórkowa porównująca efekty G4 mTERT-ER i LSL-mTERT z zastosowaniem 4OHT; wyniki barwienia Tuj1/DAPI.
Rycina 3: Reprezentatywne dane wykazujące, że reaktywacja telomerazy zwiększa zdolność do samoodnowy i neurogenezę neuralnych komórek macierzystych in vitro. (A) Reprezentatywne obrazy neuralnych komórek macierzystych wyizolowanych z G4 LSL-mTERT (panel górny) oraz G4 mTERT-ER (panel dolny) hodowanych w medium dla komórek macierzystych z dodatkiem nośnika lub 4-OHT. (B) Reprezentatywne obrazy neurogenezy in vitro (Tuj1+) neuralnych komórek macierzystych wyizolowanych z G4 mTERT-ER hodowanych w medium różnicującym (z 1% FBS) z dodatkiem nośnika lub 4-OHT. Paski skali oznaczają 100 µm.

Wzrost guza w mysich modelach mTERT; porównanie tkanek; wyniki eksperymentu.
Rycina 4: Reprezentatywne dane wykazujące, że reaktywacja telomerazy nasila tumorigenezę w kontekście niestabilności genomowej. (A) Reprezentatywne obrazy guzów prostaty wyizolowanych z myszy G0 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERT+/-, G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERT-/-, oraz G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L leczonych tamoksyfenem. Przedruk za zgodą 22. (B) Reprezentatywne obrazy chłoniaków limfocytów T grasicy wyizolowanych z myszy G0 Atm-/- mTERT+/ER, G4 Atm-/- mTERTER/ER leczonych placebo oraz G4 Atm-/- mTERTER/ER leczonych 4-OHT przez 8 tygodni. Paski skali oznaczają 1 cm.

Anatomia przekroju poprzecznego mózgu, obrazowanie fluorescencyjne; szczegóły mikroskopowe na wstawce.
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy telomerowej i centromerowej metody FISH w tkance mózgu myszy utrwalonej w FFPE oraz w metafazie (wstawka). Kolor czerwony oznacza DNA, zielony oznacza barwienie telomerów, a cyjan oznacza barwienie centromerów. Paski skali oznaczają 1 mm.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy wytwarzanie dwóch indukowalnych mysich alleli telomerazy oraz sposób reaktywacji telomerazy in vivo i in vitro. Krytycznym krokiem do reaktywacji aktywności mTERT-ER jest utrzymanie ciągłego stężenia tamoksyfenu, dlatego decydujemy się na użycie granulek 4-OHT o przedłużonym uwalnianiu wyprodukowanych przez Innovative Research of America. Granulki uwalniają 4OHT przy stanie stacjonarnym 1 ng / ml we krwi przez okres do 60 dni. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że reaktywacja aktywności telomerazy za pomocą tej strategii była w stanie złagodzić fenotypy zwyrodnieniowe, takie jak wyczerpanie komórek macierzystych, upośledzenie reakcji na uszkodzenie tkanek i niewydolność narządów w wielu narządach, które zostały wywołane dysfunkcją telomerów u myszy G4mTERTER / ER 20.

Oprócz badania funkcji telomerazy w procesie starzenia się, te dwa indukowane allele telomerazy mogą być również wykorzystywane do badania raka. W poprzednich badaniach wykorzystano te allele do zbadania roli ścierania telomerów i reaktywacji telomerazy w kształtowaniu genomów i wpływaniu na biologię chłoniaka grasicy z komórek T21 i raka prostaty22. Te dwa badania wykazały, że dysfunkcja telomerów u myszy późnej generacji G4 Atm-/- mTERTER / ER i G4 PB-Cre4 PtenL / L p53L/L L/L LSL-mTERTL / L zapewnia mechanizm napędzający nabywanie wczesnych zdarzeń mutagennych w celu inicjacji guza, zapobiegając jednocześnie progresji całkowicie złośliwych guzów. Kiedy telomeraza została reaktywowana w kontekście niestabilności genomowej wywołanej dysfunkcją telomerów, punkty kontrolne uszkodzenia DNA i szalejąca niestabilność chromosomalna zostały stłumione , co umożliwiło pełną progresję nowotworów złośliwych o nowych właściwościach biologicznych, takich jak przerzuty raka prostatydo kości 21 i naciekanie mózgu chłoniaka grasicy21. Podobne zjawiska zaobserwowano również w innych typach nowotworów, w tym raku jelita grubego i raku trzustki (osobista korespondencja z doktorami Haoqiang Ying, Adamem Boutinem i Ronaldem DePinho).

Ponieważ białko TERT-ER można łatwo przełączać między stanami włączenia i wyłączenia w zależności od tego, czy zwierzęta są leczone tamoksyfenem, czy nośnikiem, modele guza wygenerowane przez allel mTERT-ER można wykorzystać do testowania terapii anty-telomerazy. W poprzednim badaniu guzy generowane u zwierząt G4 Atm-/- mTERTER / ER zostały uwolnione z 4-OHT; Po wyczerpaniu telomerazy guzy ostatecznie zmniejszyły się z powodu przywrócenia punktów kontrolnych wywołanych dysfunkcją telomerów21. Jednak niektóre nowotwory nabyły oporność w odpowiedzi na wygaszanie telomerazy poprzez aktywację mechanizmu alternatywnego wydłużania telomerów (ALT). Dalsza charakterystyka tych nowotworów opornych na ALT + wykazała, że mają one nieprawidłową transkrypcję genów zaangażowanych w biologię mitochondriów i obronę oksydacyjną, w tym główny regulator syntezy mitochondriów i obronę oksydacyjną PGC-1β. Knockdown PGC-1β lub SOD2 (inny regulator obrony oksydacyjnej) znacznie eliminuje komórki nowotworowe ALT +, podczas gdy komórki nowotworowe telomerazy + pozostają stosunkowo nienaruszone21 .

Jednym z ograniczeń tych dwóch alleli knock-in jest to, że mogą one pozwolić sobie na reaktywację telomerazy tylko na poziomie endogennym, ponieważ znajdują się w natywnym locus genu telomerazy. W większości nowotworów u ludzi telomeraza ulega nadekspresji na znacznie wyższym poziomie. W celu zwiększenia poziomu telomerazy, jedną z modyfikacji, którą możemy rozważyć, jest wstawienie konstruktu mTERT-ER z silniejszym promotorem, takim jak promotor PGK (kinaza fosfoglicerynianowa) do locus Rosa26.

Podsumowując, te dwa nowatorskie indukowalne allele mysiej telomerazy dostarczają bezprecedensowych narzędzi genetycznych do badania funkcji telomerazy w starzeniu się i homeostazie tkanek, a także progresji guza, zwłaszcza na tle wcześniej nabytej dysfunkcji telomerów niestabilności genomowej wywołanej dysfunkcją telomerów. Allel mTERT-ER może być również wykorzystany do badania terapii antytelomerazy poprzez krzyżowanie z innymi modelami myszy podatnymi na nowotwory.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

J.H. jest wspierany przez NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) oraz NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do mikromanipulacji Leica AM6000 LeicaNa wycenę
Mikroskop odwrócony Leica DMI6000 BLeicaNa wycenę
NeomycynaTechnologie życia21810031
parownik izofluranowyWeterynaryjne systemy anestezjologiczne911103
izofluranuHenrySchein 1005796
mieszanina ketaminy i ksylazynySigma-AldrichK113-10ML
4-OHT w proszkuSigma-AldrichH7904-5MG
TamoxfienSigma-AldrichT5648-1G
Granulat 4-OHTInnowacyjne badania w AmeryceCustermized
Precision Trochar (10 Gauge)Innowacyjne badania AmerykiKlips do ran MP-182
aplikacjaKlips Fischer Scientific01-804
Fischer Scientific01-804-5
Zestaw do dysocjacji tkanek nerwowychMiltenyi Biotec130-092-628
HBSSTechnologie życiowe14025092
PBSTechnologie życia10010023
ksylenFischer ScientificX3P-1GAL
metanolFischer ScientificA-433S4
kwas octowyFischer ScientificA38-500
etanolFischer Scientific22-032-104
Fischer ScientificF84-1
PNAPanageneF1001-5
Sonda centromerowa PNAPanageneF3003-5
20X SSCFischer ScientificBP1325-4
BSASigma-AldrichA2153-10G
tRNASigma-AldrichR5636-1ML
Tween 20Fischer ScientificBP337-100
cement kauczukowyWalmartElmer's
DAPISigma-AldrichD9542
formamid Sonda telomerowa

Bibliografia

  1. Bass, A. J., et al. Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet. 43, 964-968 (2011).
  2. Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
  3. Blasco, M. A., et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. 91, 25-34 (1997).
  4. Lee, H. W., et al. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature. 392, 569-574 (1998).
  5. Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, 725-729 (2007).
  6. Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing. Nature. 421, 643-648 (2003).
  7. Rudolph, K. L., et al. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell. 96, 701-712 (1999).
  8. Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation. Nat Genet. 26, 85-88 (2000).
  9. Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131, 4059-4070 (2004).
  10. Savage, S. A., Alter, B. P. Dyskeratosis congenita. Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).
  11. Armanios, M. Syndromes of telomere shortening. Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).
  12. Vulliamy, T., et al. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature. 413, 432-435 (2001).
  13. Harley, C. B., Harley, S. W. Telomerase, checkpoints and cancer. Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).
  14. Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).
  15. Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell. 92, 401-413 (1998).
  16. Chin, L., et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis. Cell. 97, 527-538 (1999).
  17. Artandi, S. E., et al. Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice. Nature. 406, 641-645 (2000).
  18. Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet. 28, 155-159 (2001).
  19. Greenberg, R. A., et al. Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse. Cell. 97, 515-525 (1999).
  20. Jaskelioff, M., et al. Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice. Nature. 469, 102-106 (2011).
  21. Hu, J., et al. Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer. Cell. 148, 651-663 (2012).
  22. Ding, Z., et al. Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases. Cell. 148, 896-907 (2012).
  23. Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reaktywacja telomerazymysie allele indukowalneanaliza FISH telomer wizolacja neuronalnych kom rek macierzystychleczenie hydroksytamoksyfenemmodel guza prostatymodel ch oniaka grasicydysfunkcja telomer wbadania nad rakiem

Powiązane artykuły