Funkcjonalna i morfologiczna ocena unerwienia przepony przez freniczne neurony ruchowe

Podsumowanie

Złożony zapis potencjału czynnościowego mięśni ilościowo ocenia funkcjonalne unerwienie przepony przez przeponowe neurony ruchowe. Immunohistochemia przepony pełnej polega na ocenie unerwienia morfologicznego w poszczególnych połączeniach nerwowo-mięśniowych. Celem tego protokołu jest pokazanie, w jaki sposób te dwie potężne metodologie mogą być wykorzystane w różnych modelach choroby rdzenia kręgowego u gryzoni.

Streszczenie

Ten protokół skupia się w szczególności na narzędziach do oceny unerwienia przepony przez przeponowy neuronu ruchowego (PhMN) zarówno na poziomie elektrofizjologicznym, jak i morfologicznym. Zapis złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) po stymulacji nerwu przeponowego można wykorzystać do ilościowej oceny funkcjonalnego unerwienia przepony przez PhMN rdzenia kręgowego szyjki macicy in vivo u znieczulonych szczurów i myszy. Ponieważ CMAP reprezentują jednoczesny zapis wszystkich włókien mięśniowych całej półmembrany, przydatne jest również zbadanie fenotypów poszczególnych aksonów ruchowych i włókien mięśniowych w przeponie NMJ w celu śledzenia zmian morfologicznych istotnych dla choroby i terapii, takich jak częściowe i całkowite odnerwienie, kiełkowanie regeneracyjne i reinerwacja. Można to osiągnąć za pomocą immunohistochemii całego mocowania (IHC) przepony, a następnie szczegółowej oceny morfologicznej poszczególnych NMJ w całym mięśniu. Połączenie CMAP i analizy NMJ zapewnia skuteczne podejście do ilościowego badania unerwienia przepony w modelach chorób OUN i PNS u gryzoni.

Wprowadzenie

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest wyniszczającą chorobą neuronu ruchowego związaną z utratą zarówno górnych, jak i dolnych neuronów ruchowych i w konsekwencji paraliżem mięśni. W momencie rozpoznania przeżycie pacjenta wynosi średnio tylko 2-5^lat1. Utrata przeponowego neuronu ruchowego (PhMN) jest krytycznym elementem patogenezy ALS. Pacjenci ostatecznie umierają z powodu utraty unerwienia przepony PhMN, głównego mięśnia wdechu^2,3. Urazowy uraz rdzenia kręgowego (SCI) jest również poważnym problemem, z towarzyszącymi trudnościami w oddychaniu. Każdego roku dochodzi do około 12 000 nowych przypadków SCI^{, 4} z powodu urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Pomimo niejednorodności choroby pod względem lokalizacji, rodzaju i ciężkości, większość przypadków SCI wiąże się z urazem rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, co często prowadzi do wyniszczającego i trwałego upośledzenia oddychania. Oprócz ALS i SCI, inne choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN) mogą być związane z dysfunkcją przeponowej^{oddychalności 5,6}.

Nerw przeponowy to odprowadzający nerw ruchowy, który unerwia półprzeponę ipsilateralną i która pochodzi z ciał komórkowych PhMN znajdujących się na poziomach C3-C5 ipsilateralnej szyjki rdzenia kręgowego. Wyjście PhMN jest kontrolowane przez zstępujący wkład opuszkowo-rdzeniowy z pnia mózgu w obszarze znanym jako rostralna brzuszna grupa oddechowa (rVRG)⁷. Obwód membranowy rVRG-PhMN ma kluczowe znaczenie dla kontroli oddychania wdechowego, a także innych niewentylacyjnych zachowań przepony. Różne urazy urazowe i zaburzenia neurodegeneracyjne, które wpływają na ten obwód, mogą prowadzić do głębokiego pogorszenia funkcji oddechowych i jakości życia pacjenta. Zstępujący dopływ do PhMN z rVRG, przeżycie PhMN, integralność nerwu przeponowego i prawidłowe unerwienie w połączeniu nerwowo-mięśniowym przepony (NMJ) są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania przepony. Dlatego ważne jest, aby zastosować techniki, które mogą ilościowo ocenić ten obwód in vivo w modelach gryzoni z ALS, SCI i innymi chorobami OUN.

Celem tego protokołu jest opisanie eksperymentalnych narzędzi do oceny unerwienia przepony PhMN zarówno na poziomie elektrofizjologicznym, jak i morfologicznym. Złożone potencjały czynnościowe mięśni (CMAP) są rejestrowane poprzez stymulację wszystkich odprowadzających aksonów neuronów ruchowych danego nerwu ruchowego, a następnie analizę wywołanej odpowiedzi depolaryzacyjnej docelowych włókien mięśniowych. Technika ta może być stosowana in vivo u znieczulonych szczurów i myszy w celu ilościowego określenia funkcjonalnego unerwienia półprzepony przez PhMN⁸. Ze względu na fakt, że CMAP reprezentują jednoczesny zapis wszystkich (lub przynajmniej wielu/większości) włókien mięśniowych całej półmembrany, przydatne jest również zbadanie fenotypów poszczególnych aksonów ruchowych i włókien mięśniowych w przeponie NMJ w celu śledzenia zmian morfologicznych istotnych dla choroby i terapii, takich jak częściowe i całkowite odnerwienie, kiełkowanie regeneracyjne i ponowne unerwienie. Można to osiągnąć za pomocą immunohistochemii całego montażu (IHC) przepony, a następnie szczegółowej oceny morfologicznej poszczególnych NMJ w całym mięśniu⁹. Połączenie CMAP i analizy NMJ zapewnia skuteczne podejście do ilościowego badania unerwienia przepony w modelach chorób OUN i PNS u gryzoni.

Protokół

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt na Uniwersytecie Thomasa Jeffersona i przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich (2010/63/UE, 86/609/EWG i 87-848/EWG), Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz Polityką Towarzystwa Neuronauki dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach neurologicznych.

1. Złożone potencjały czynnościowe mięśni (CMAPs)

1. Przygotowanie zwierzęcia:
   1. Znieczulić szczura za pomocą środka wziewnego (izofluranu) w dawce 1-2% dostarczanego do efektu lub we wstrzyknięciu (ketamina, ksylazyna, acepromazyna). Dawkowanie znieczulenia iniekcyjnego jest następujące: 95,0 mg/kg ketaminy, 10,0 mg/kg ksylazyny, 0,075 mg/kg acepromazyny.
      UWAGA: Podczas przeprowadzania tego protokołu nagrywania CMAP z powodzeniem stosujemy zarówno metody znieczulające wziewne, jak i iniekcyjne, bez żadnych preferencji.
   2. Zwierzę musi być utrzymywane na odpowiedniej głębokości znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegu, do zakończenia operacji i do momentu zadziałania buprenorfiny po operacji. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przez krótkie uszczypnięcie palca u nogi, aby ustalić, czy nie wywołuje reakcji odstawienia. Dodatkowo przetestuj odruch rogówkowy wacikiem. Podczas zabiegu chirurgicznego należy stwierdzić, że częstość akcji serca i częstość oddechów nie wzrosły, co sugeruje, że głębokość znieczulenia stała się zbyt mała.
   3. Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
   4. Chirurg powinien umyć ręce środkiem dezynfekującym (peeling z chlorheksydyną) przed rozpoczęciem operacji. Chirurg powinien nosić sterylne rękawice, maskę na twarz i fartuch lub czysty fartuch laboratoryjny. Wszystkie narzędzia powinny być umyte i autoklawowane przed zabiegiem. Dodaj pasek wskaźnika sterylizacji do zestawu narzędzi przed autoklawowaniem na poziomie narzędzi, aby sprawdzić, czy sterylizacja została zakończona. Chirurg powinien sprawdzić, czy cała linia na pasku jest przed rozpoczęciem operacji. Zaklej również zewnętrzną część pudełka taśmą wskazującą do autoklawu. Jeśli operacja ma być przeprowadzona na kilku zwierzętach tego samego dnia, wyczyść narzędzia między operacjami i wysterylizuj w sterylizatorze z kulkami szklanymi. W razie potrzeby należy wysterylizować oba końce instrumentu w sterylizatorze z kulkami szklanymi, umieszczając uchwyt narzędzia w sterylizatorze na odpowiedni czas, wyjmując instrument sterylnym hemostatem, schładzając go w sterylnym polu, a następnie umieszczając funkcjonalną końcówkę instrumentu w sterylizatorze z kulkami szklanymi na odpowiedni okres czasu.
   5. Po znieczuleniu zwierzęcia umieść je na desce operacyjnej powierzchnią grzbietową do dołu i brzuchem skierowanym do góry, tak aby można było użyć taśmy do przymocowania przednich kończyn zwierzęcia do deski chirurgicznej.
   6. Ogolić powierzchnię brzuszną doogonowo, zaczynając od podstawy czaszki i upewnij się, że obszar wokół brzucha po obu stronach linii środkowej jest ogolony w zależności od tego, która półprzepona przepona jest rejestrowana. Nałóż powidon-jod na ogoloną powierzchnię skóry.
2. Przygotowanie do nagrań CMAP:
   1. Po przygotowaniu zwierzęcia umieść elektrodę uziemiającą podskórnie w ogonie (ryc. 1).
   2. Umieścić elektrodę odniesienia podskórnie w przeciwległym dolnym odcinku brzucha.
   3. Umieść żel przewodzący na samoprzylepnym pasku powierzchniowym lub elektrodzie rejestrującej dysk (wymiary powierzchniowej elektrody taśmowej: 0,5 x 3 cm), a następnie umieść elektrodę powierzchniową poprzecznie wzdłuż jednostronnego brzegu żebrowego.
   4. Elektrody stymulujące należy umieścić przezskórnie w odległości 0,5 cm od tchawicy i powyżej obojczyka. Wprowadzić elektrody na głębokość około 1,0 cm przez skórę. Zabezpiecz elektrody ręcznie, aby ich położenie nie zmieniało się wraz z kolejnymi stymulacjami.
      UWAGA: Elektrody stymulujące kąt 90° względem skóry w miejscu wprowadzenia.
3. Zapisy złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP):
   1. Uzyskanie zapisów elektrofizjologicznych za pomocą stymulatora/wzmacniacza, a następnie komputerowa analiza danych.
   2. Parametry bodźca stymulacji pojedynczym pociągnięciem powinny wynosić 0,5 ms, impulsy supramaksymalne 1,0 Hz. Amplituda bodźca powinna wynosić od 6,0 do 8,0 V (rysunek 2A).
      UWAGA: W eksperymencie użyj intensywności bodźca o tej samej amplitudzie u zwierząt. Celem jest maksymalizacja amplitudy odpowiedzi poprzez zastosowanie minimalnej amplitudy stymulacji. Ważne jest, aby pamiętać, że początkowa reakcja, która występuje w momencie stymulacji, jest artefaktem stymulacji. Ponadto należy zadbać o uzyskanie odpowiedzi CMAP, która jest poprzedzona stabilną/płaską linią wyjściową po artefakcie stymulacji, po której następuje szybka odpowiedź CMAP. W celu uzyskania takiej odpowiedzi może być konieczna zmiana położenia elektrod stymulacyjnych i/lub rejestrujących.
   3. Odczekaj 30 sekund między stymulacjami i powtórz 10 stymulacji z rzędu, aby uzyskać średnią odpowiedź (Rysunek 2B-C). Zmierz amplitudę od linii podstawowej do wartości szczytowej (rysunek 2A). Przeprowadzić stymulację nerwu przeponowego w fazie cyklu oddechowego zwierzęcia, kiedy nerw przeponowy/przepona nie jest aktywowany. Procedurę można powtórzyć na tym samym zwierzęciu w przypadku przeciwległej półmembrany.
   4. Po ostatniej sesji nagrania CMAP należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia, jeśli ma być przeprowadzone barwienie NMJ. Przeprowadzaj zapisy CMAP wielokrotnie na tym samym zwierzęciu mniej więcej raz w tygodniu (lub w wybranych odstępach czasu).
   5. Po nagraniach CMAP dotyczących przeżycia, pozwól zwierzęciu dojść do siebie na podkładce grzewczej z ciepłą wodą w krążącej ciepłej wodzie i stale monitoruj podczas rekonwalescencji, aż się obudzi i znajdzie się w pozycji rufowej. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
   6. Po położeniu na rufie należy monitorować zwierzę co 12 godzin przez pierwsze 48 godzin (następnie raz dziennie). Jeśli zwierzę wydaje się być odwodnione (wiotka skóra, apatia), należy podawać płyny (roztwór Ringera z mleczanami; podskórnie; 1-2 ml na wstrzyknięcie, z obróconymi miejscami; 2 razy dziennie) do momentu ustabilizowania się masy ciała i utraty płynów po operacji. W ostrym okresie pooperacyjnym należy podawać zwierzętom zmiękczony pokarm w małych naczyniach, jeśli to konieczne, aby zachęcić do jedzenia, jeśli nie mogą dosięgnąć karmnika z drucianą pokrywą.
   7. Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,05 mg/kg mc. przed zakończeniem zabiegu, a następnie w odstępach 12-godzinnych przez pierwsze 24 godziny (i w zależności od objawów bólu/stresu po zabiegu) we wstrzyknięciu podskórnym (obrócenie miejsca). Jeśli później zauważy się oznaki bólu lub niepokoju, należy leczyć zwierzęta buprenorfiną. Objawy wskazujące na ból/niepokój obejmują brak aktywności, wokalizacje, brak jedzenia lub picia (odwodnienie), nadmierną utratę masy ciała, pilnowanie, nadmierne gryzienie lub drapanie w miejscu nacięcia. Dodatkowe kryteria stosowane w określaniu bólu i dystresu obejmują brak reakcji na bodźce zewnętrzne, przejściową lub niesprowokowaną wokalizację, ciężki lub nieprawidłowy oddech, uporczywą czerwono-brązową wydzielinę z nosa i oka, wyraźną piloerekcję. Monitoruj również dowody złej higieny, które sugerowałyby chore zwierzęta. Jeśli po 72 godzinach leczenia zaobserwuje się, że zwierzę nadal znajduje się w niebezpieczeństwie, (zgodnie z kryteriami bólu/stresu opisanymi powyżej i po otrzymaniu opisanego powyżej protokołu przeciwbólowego), należy je poddać eutanazji.

2. Analiza połączenia nerwowo-mięśniowego przepony (NMJ)

1. Sekcja zwierząt:
   1. Podać zwierzęciu przedawkowanie znieczulenia iniekcyjnego (3-krotność dawki użytej powyżej: ketamina w dawce 285,0 mg/kg, ksylazyna w dawce 30,0 mg/kg, acepromazyna w dawce 0,225 mg/kg; podawana dootrzewnowo). Po przedawkowaniu wszystkie zwierzęta powinny zostać poddane drugiej metodzie eutanazji (torakotomii) w celu zapewnienia śmierci. Zgon powinien być potwierdzony poprzez obserwację zatrzymania akcji serca i oddechu oraz poprzez odnotowanie stałych i rozszerzonych źrenic zwierzęcia.
   2. Przeprowadź laparotomię skalpelem lub nożyczkami preparacyjnymi, przedłużając wycięcie z wyrostka zyfusowego doogonowo wzdłuż linii środkowej. Ostrożnie oddziel skórę i tkankę łączną od leżących pod nią mięśni za pomocą skalpela i kleszczy.
   3. Ciągnąc za wyrostek zyfusowy, użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć całą przeponę, upewniając się, że przepona pozostaje przyczepiona do otaczającej kości. Jest to ważne, ponieważ zapobiegnie uszkodzeniom mięśnia przepony, pozwoli na pomyślne rozwarstwienie całej przepony i pomoże w oczyszczeniu mięśni przed późniejszym barwieniem.
      UWAGA: W tym momencie zwierzę może być perfranowane, jeśli to konieczne.
2. Czyszczenie i barwienie membrany:
   1. Przypnij całą rozciętą membranę, górną powierzchnią skierowaną do góry, do kauczuku silikonowego na szklanej szalce Petriego o średnicy 100 mm w 4% paraformaldehydzie (wykonanym z 1% soli fizjologicznej buforowanej fosforanem - PBS) przez 20 minut za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Rozciągnij przeponę, aby ją napiąć, a następnie za pomocą szpilek przeciw owadom przygwoźdź otaczającą tkankę, aby uniknąć przygwożdżenia samego mięśnia przepony (ryc. 3).
   2. Ostrożnie oczyść tkankę łączną tylko z górnej powierzchni mięśni za pomocą kleszczy #5 i małych nożyczek.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki tego protokołu barwienia należy wykonywać powoli, kołysząc się w temperaturze pokojowej osłoniętej od światła, chyba że określono inaczej. Upewnij się, że mięsień przepony jest zawsze całkowicie zanurzony w płynie, aby uniknąć wysuszenia.
   3. Przed barwieniem przygotuj wszystkie niezbędne odczynniki: 1x PBS, 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS, 0,1 M glicyny wykonanej w 2% BSA/PBS, 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS i 0,2% TBP (0,2% Triton X100 w 2% BSA/PBS). Należy pamiętać o wstępnym schłodzeniu metanolu w temperaturze -20 °C.
   4. Prać 3x przez 10 min w 1x PBS.
   5. Inkubować w 0,1 M glicynie (wytworzonej w 2% BSA/PBS) przez 30 min.
   6. Inkubować w roztworze RBTX (α-bungarotoksyny sprzężonej z rodaminą) przez 15 minut. Roztwór dla RBTX jest następujący: Sprzężona z rodaminą alfa bungarotoksyna rozcieńczenie 1:400 w 1x PBS.
      UWAGA: W tym protokole stosuje się rodaminę, ale do barwienia można użyć dowolnego fluoroforu.
   7. Prać 3x przez 10 min w 1x PBS.
   8. W zamrażarce o temperaturze -20 °C inkubować z MeOH przez 5 min.
      UWAGA: Nie dodawaj MeOH przed umieszczeniem mięśni w zamrażarce i natychmiast usuń roztwór po okresie inkubacji.
   9. Prać 3x przez 10 min w 1x PBS.
   10. Blokuj 0,2% TBP przez 1 godzinę (0,2% Triton wykonany w 2% BSA/PBS).
   11. Inkubować z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (w 0,2% TBP) w temperaturze 4 °C przez noc podczas kołysania. Rozcieńczenia przeciwciał w następujący sposób: SV2 (1:10) i SMI-312 (1:1,000).
   12. Prać 3x przez 10 min z 0,2% TBP.
   13. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym, stosując rozcieńczenie 1:100 FGM1 (anty-mysia IgG1 kozy sprzężona z FITC; wykonana w 0,2% TBP) podczas kołysania przez 1 godz.
       UWAGA: Chronić przed światłem przez pozostałą część protokołu barwienia.
   14. Myć 3x przez 10 min z 1x PBS.
   15. Ponownie oczyść otaczającą tkankę łączną na górnej (patrz wyżej) powierzchni mięśnia przed montażem i założeniem ślizgu nakrywkowego.
       UWAGA: Zaleca się oczyszczenie, a następnie zamontowanie próbki natychmiast po zabarwieniu. Jednakże, w razie konieczności, próbka może być pokryta 1 PBS, owinięta w parafilm w celu zapobieżenia parowaniu i przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, z codzienną wymianą PBS.
   16. Po zamontowaniu na szkiełku nakrywkowym z nietwardą powłoką Vectashield. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu. Szkiełka można przechowywać przez długi czas w pozycji leżącej płasko w kartonowych teczkach na prowadnice w temperaturze -20 °C.
3. Analiza i obrazowanie konfokalne:
   1. Przeanalizuj ilościowo morfologię barwionej i zamontowanej półmembrany pod 20-krotnym i 40-krotnym powiększeniem za pomocą pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego.
      UWAGA: Ponieważ przepona jest barwiona i analizowana w sposób całościowy, mięsień jest dość gruby. W związku z tym większość barwień fluorescencyjnych jest całkowicie nieostra, gdy obraz statyczny jest wykonywany przy użyciu niekonfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Z tego powodu najlepiej jest przeprowadzać analizę NMJ w czasie rzeczywistym pod mikroskopem, ponieważ pozwala to na ciągłe skupianie się "w górę" i "w dół" przez mięsień, aby prawidłowo zidentyfikować morfologię każdego z poszczególnych NMJ. Korzystając z tego podejścia, można łatwo śledzić trajektorię poszczególnych aksonów ruchowych, gdy poruszają się one w tkance w relacji przestrzennej do klastrów receptorów postsynaptycznych.
   2. Mierząc długość mięśnia od brzusznej do grzbietowej, podziel mięsień na 3 oddzielne sekcje do analizy w oparciu o topograficzne wzorce unerwienia z określonych poziomów rdzenia kręgowego (ryc. 4H).
   3. Zaczynając od brzusznego obszaru mięśnia i poruszając się grzbietowo, przeanalizuj wszystkie en face NMJ zlokalizowane na powierzchniowych włóknach mięśniowych. Nie należy analizować włókien mięśniowych głębiej niż pierwsze 3-4 włókna od powierzchni, ponieważ interpretacja może być trudna ze względu na gorszą penetrację przeciwciał (RBTX wnika znacznie głębiej w mięsień ze względu na mały rozmiar toksyny w porównaniu z większymi przeciwciałami używanymi do znakowania neuronów).
   4. Zidentyfikuj każdy NMJ jako nienaruszony, jeśli przedkońcowy akson neuronu ma grubą średnicę, a wszystkie obszary zakończenia nerwowego całkowicie pokrywają się z leżącymi poniżej receptorami acetylocholiny mięśniowej (AChR).
   5. Zidentyfikuj każdy NMJ jako częściowo odnerwiony, jeśli jakikolwiek obszar leżącego poniżej mięśnia AChR nie jest zajęty odpowiednim zakończeniem nerwowym.
   6. Zidentyfikuj każdy NMJ jako całkowicie odnerwiony, jeśli mięśniowe AChR nie mają odpowiadającego mu zakończenia nerwowego (ważne jest również, aby inne NMJ z oznakowanymi neuronami znajdowały się w tym samym polu ostrości, aby można było mieć pewność, że brak zakończenia nerwowego nie jest po prostu spowodowany słabą penetracją przeciwciał w tym obszarze mięśni).
   7. Zidentyfikuj każdy NMJ jako unerwiony wielokrotnie, jeśli istnieje więcej niż jeden akson przedkońcowy unerwiający pojedynczy NMJ (oznacza to, że nastąpił pewien poziom denerwacji i prawdopodobne próby reinervacji w tym połączeniu).
   8. Zidentyfikuj każdy NMJ jako cienko unerwiony, jeśli NMJ całkowicie nakłada się na zakończenie nerwowe i leżące poniżej AChR, ale ma cienki akson przedkońcowy (wskazuje to również na pewien poziom denerwacji i prób reinerwacji).
   9. Przeprowadź analizę dla każdego z 3 zidentyfikowanych regionów dla wszystkich powyższych kategorii NMJ dla każdego zwierzęcia. Uśrednić dane z każdego zwierzęcia z wynikami uzyskanymi od innych zwierząt z tej samej grupy doświadczalnej. Około 200-300 połączeń w mięśniu półprzepony szczura i 150-200 w mięśniu półprzepony myszy należy określić ilościowo u co najmniej 3 (najlepiej 5-6 lub więcej) zwierząt na grupę doświadczalną.
   10. Uzyskanie obrazów konfokalnych o wysokiej rozdzielczości, wykorzystywanych do publikacji, za pomocą mikroskopu konfokalnego.
   11. Uzyskaj stosy Z w krokach co 0,3 μm dla głębokości 20-40 μm i zbierz dodatkowe sekcje optyczne powyżej i poniżej każdego złącza, aby upewnić się, że uwzględniony jest cały profil synaptyczny.
   12. Użyj oprogramowania do akwizycji, aby zrekonstruować obrazy z serii Z w celu uzyskania projekcji o maksymalnej intensywności.

Wyniki

Dorosłe szczury Sprague-Dawley otrzymały albo tylko laminektomię (nieuszkodzona kontrola), albo jednostronne stłuczenie połowicze SCI na poziomie rdzenia kręgowego C4^10-12. Po 5 tygodniach od operacji szczytowa amplituda CMAP zarejestrowana od półmembrany ipsilateralnej do miejsca laminektomii/urazu była znacznie zmniejszona u szczurów SCI (ryc. 2C) w porównaniu z kontrolą tylko z laminektomią (ryc. 2B). Wszystkie NMJ w półprzeponie były całkowicie nienaruszone u kontrolnych, ...

Dyskusja

Ponieważ funkcja oddechowa jest upośledzona zarówno w urazowym SCI, jak i ALS, opracowanie terapii ukierunkowanych na oddychanie, a konkretnie unerwienie przepony, jest klinicznie istotne^5,6. W celu kompleksowego zbadania funkcji układu oddechowego należy zastosować metodę podejścia łączonego. CMAP mierzą stopień funkcjonalnego unerwienia przepony za pomocą zewnętrznej stymulacji nerwu przeponowego, ale nie endogennego opuszkowo-rdzeniowego napędu oddechowego⁸. Ponadto zapisy te nie pozwalają na bad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Paraformaldehyd	Fisher	T353-500	Najpierw przygotować 10% roztwór w dejonizowanej wodzie destylowanej; zrobić 4% za pomocą 1x PBS, dostosować pH do 7,4
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4	Invitrogen	10010049
2% albumina surowicy bydlęcej (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Rozpuścić 2 g BSA w 100 ml 1x PBS
0,2% Triton X100 w 2% BSA/PBS (bufor blokujący)	Sigma-Aldrich	T9284-100mL	Rozpuścić 0,2 ml/100 ml 2% BSA/PBS
0,1 M Glicyna	Sigma-Aldrich	G-7126	Dodać 0,185 g do 25 ml 2% BSA/
PBSα-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Stężenie 1:400
SMI-312	Sternberger Monoklonale	SMI312	Stężenie 1:1,000
SV2	Badania rozwojowe Bank hybrydoma	SV2-Supernatant	Stężenie 1:10
FITC koza anty-mysie IgG1	Roche		3117731001 Stężenie 1:100
Kauczuk silikonowy	Sylgard, Dow Corning	Część # 184	Postępuj zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu: można używać różnych rozmiarów naczyń hodowlanych (30 mm, 60 mm, 100 mm) w zależności od potrzeb
Fluorescencyjne medium montażowe Vectashield	Laboratoria wektorowe	H-1000	Nie jest to sztywny nośnik. Szkiełko nakrywkowe należy zabezpieczyć przezroczystym lakierem do paznokci.
Małe nożyczki sprężynowe	Fine Science Tools	15002-08
Kleszcze preparacyjne	Fine Science Tools	11295-51
Oprogramowanie do nagrań CMAP	Zakres 3.5.6; ADI
Elektrody powierzchniowe dysku	Natus neurology	019-409000
Podskórne elektrody igłowe	Natus neurologia	019-453100
Żel przewodzący	Aquasonic	122-73720
Stymulator/system rejestracji do zapisów CMAP	Stymulator
Wzmacniacz do nagrań	CMAPWzmacniacz biologiczny (BioAMP