Artykuł metodologiczny

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

DOI:

10.3791/52607

⸱

24 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine III, RWTH University-Hospital Aachen, 2IZKF Aachen Core Facility "Two-Photon Imaging", RWTH University-Hospital Aachen, 3Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery, RWTH Aachen University, 4Institute for Pharmacology, RWTH University-Hospital Aachen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapalenie wątroby jako odpowiedź na uraz jest wysoce dynamicznym procesem obejmującym infiltrację różnych podtypów leukocytów, w tym monocytów, neutrofili, podzbiorów limfocytów T, limfocytów B, komórek NK i komórek NKT. Mikroskopia przyżyteczna wątroby do monitorowania migracji komórek odpornościowych jest szczególnie trudna ze względu na wysokie wymagania dotyczące przygotowania i utrwalenia próbki, rozdzielczości optycznej i długoterminowej przeżywalności zwierząt. Jednak dynamika procesów zapalnych, a także badania interakcji komórkowych mogą dostarczyć kluczowych informacji, aby lepiej zrozumieć inicjację, progresję i regresję zapalnej choroby wątroby. W związku z tym opracowano wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji międzykomórkowych różnych komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą przyżyciowej dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej (TPLSM) w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Dostarczona metoda obejmuje delikatne przygotowanie i stabilne unieruchomienie wątroby przy minimalnych zakłóceniach narządu; długoterminowe obrazowanie przyżyciowe przy użyciu wielokolorowej mikroskopii wielofotonowej praktycznie bez fotowybielania lub efektów fototoksycznych przez okres do 6 godzin, umożliwiając śledzenie określonych podzbiorów leukocytów; i stabilne warunki obrazowania dzięki intensywnemu monitorowaniu parametrów życiowych myszy i stabilizacji krążenia, temperatura i wymiana gazowa.

Aby zbadać migrację limfocytów po zapaleniu wątroby, myszy knock-in CXCR6.gfp zostały poddane obrazowaniu wątroby w warunkach wyjściowych oraz po ostrym i przewlekłym uszkodzeniu wątroby wywołanym dootrzewnowym wstrzyknięciem (wstrzyknięciami) czterochlorku węgla (CCl4).

CXCR6 to receptor chemokiny wyrażany na limfocytach, głównie na Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- i podzbiorach limfocytów T, takich jak limfocyty T CD4, ale także niezmienne limfocyty T związane z błoną śluzową (MAIT)1. Śledzenie wzorca migracji i umiejscowienia komórek odpornościowych CXCR6.gfp+ pozwoliło na szczegółowy wgląd w ich zmienione zachowanie po uszkodzeniu wątroby, a tym samym ich potencjalny udział w postępie choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja komórek i funkcji komórkowych w całych organach, a nawet całych organizmach, cieszy się dużym zainteresowaniem od ponad 50 lat, obejmując praktycznie wszystkie części ciała2. Dlatego już w niektórych wczesnych badaniach stosowano obrazowanie przyżyciowe wątroby3,4. Jednak do tej pory istnieje kilka ograniczeń dotyczących długoterminowego, stabilnego obrazowania tkanki wątroby w wysokiej rozdzielczości.

Ze względu na anatomiczne położenie wątroby w bliskim kontakcie z przeponą i przewodem pokarmowym5, najczęstszym problemem w mikroskopowym obrazowaniu przyżyciowym jest ruch spowodowany oddychaniem i, w mniejszym stopniu, perystaltyką przewodu pokarmowego6. W porównaniu z innymi narządami litymi, operacja wątroby jest szczególnie trudna. Ze względu na gęstą strukturę mikronaczyniową, manipulacja chirurgiczna może prowadzić do masywnych zmian krwotocznych, upośledzenia mikrokrążenia7, a także aktywacji rezydentnych komórek odpornościowych, takich jak komórki Kupffera8. W związku z tym mechaniczne unieruchomienie tkanki, jak opublikowano w innym miejscu6,9, może zakłócać obrazowanie w mikroskopii przyżyciowej.

W zdrowej wątrobie, 10-15% całkowitej objętości krwi znajduje się w unaczynieniu wątroby, a narząd otrzymuje około 25% całkowitego rzutu serca10, co czyni narząd wysoce podatnym na zmiany w krążeniu (np. wahania ciśnienia krwi). W związku z tym zakłócenia w przepływie krwi w wątrobie spowodowane np. naprężeniem ścinającym, przemieszczeniem, uszkodzeniem spowodowanym nadmiernym obchodzeniem się z tkankami lub scentralizowanym krążeniem doprowadzą do sztucznych zmian w zachowaniu migracyjnym leukocytów, upośledzenia natlenienia wątroby, a tym samym dalszego uszkodzenia wątroby, wpływając na odpowiedź immunologiczną wątroby, a także na zachowanie narządów i ogólny czas życia zwierzęcia.

Wczesne badania mikroskopowe opierały się na mikroskopii epifluorescencyjnej w trybie przyżyciowym, ale kilka ograniczeń technicznych, takich jak wybielanie zdjęć i niska głębokość penetracji, ogranicza użycie tej techniki do długoterminowego obrazowania wątroby4,11,12. Wraz z rozwojem mikroskopii wielofotonowej w latach dziewięćdziesiątych XX wieku ograniczenia związane z wybielaniem zdjęć lub głębokością penetracji zostały w dużej mierze rozwiązane, ponieważ ta nowa metoda była technicznie zdolna do wykonywania badań obrazowych w praktycznie wszystkich narządach w rzeczywistych sytuacjach13-15. Jednak głównymi pozostałymi wyzwaniami w odniesieniu do obrazowania wątroby były: ruchy oddechowe, autofluorescencja tkanki wątroby, zapewnienie niezmienionego przepływu krwi w sinusoidach wątroby, a przede wszystkim stabilne obrazowanie przez dłuższe okresy trwające kilka godzin.

Chociaż kilka badań dotyczyło funkcji i migracji różnych leukocytów w wątrobie17, np. komórek NKT18-20, limfocytów T21,22, makrofagów wątrobowych23,24 lub neutrofili25, długoterminowe obrazowanie mikroskopem wielofotonowym nie zostało jeszcze pomyślnie ustalone, co jest jeszcze trudniejsze u zwierząt z ostrą lub przewlekłą chorobą wątroby ze względu na istniejące uszkodzenia, a tym samym większą podatność na dalsze Szkoda26. Jednak monitorowanie zachowań migracyjnych i funkcji komórkowych leukocytów w wątrobie w czasie rzeczywistym pozwala na uzyskanie nowych informacji na temat ich szczególnej roli w homeostazie i chorobie wątroby27.

Receptor chemokiny CXCR6 ulega ekspresji na kilku podzbiorach limfocytów, w tym na komórkach NK (natural killer), komórkach NKT i niektórych populacjach limfocytów T18,28. Wcześniejsze badania na myszach wykazały, że CXCR6 i jego pokrewny ligand CXCL16 mogą kontrolować patrolowanie komórek NKT na sinusoidach wątroby podczas homeostazy. W związku z tym opisano zastosowanie myszy CXCR6.gfp (przenoszących knock-in białka zielonej fluorescencji [gfp] w locus CXCR6) w celu zbadania migracji limfocytów w różnych narządach, takich jak mózg29, a także wątroba18,20, wykazując zwiększoną infiltrację komórek CXCR6.gfp po zapaleniu.

Dzięki metodzie przedstawionej w tym badaniu możliwe było śledzenie tych procesów przez długi okres czasu w ustabilizowanych warunkach. Procedura oparta na wielofotonowych funkcjach przyżyciowych pozwoliła na obrazowanie, które było wysoce powtarzalne przy minimalnych zaburzeniach zwierzęcia i narządu; zoptymalizowany pod kątem długoterminowej przeżywalności zwierząt dzięki szeroko zakrojonemu monitorowaniu, a następnie ścisłej kontroli oddychania i krążenia; oraz bardzo elastyczny i łatwy do adaptacji również do innych narządów miąższowych, takich jak nerki czy śledziona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem regulującym badania na zwierzętach, zgodnie z "Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" (publikacja NIH, wydanie 8, 2011) oraz Dyrektywą 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej, 2010). Oficjalne pozwolenie zostało wydane przez Państwowy Urząd ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Niemcy).

UWAGA: Kroki, które można pominąć przy krótkotrwałym obrazowaniu (np. zdjęcia z migawki, stosy 3D lub również krótkotrwała mikroskopia poklatkowa) są oznaczone gwiazdkami (*), aby skrócić czas przygotowania i uprościć protokół chirurgiczny. Obrazowanie można również wykonać bez szczegółowego monitorowania i kontroli krążenia, jeśli to konieczne, jednak czas przeżycia zostanie znacznie skrócony.

1. Ustawienie mikroskopu i przygotowanie przed operacją (5-10 min)

  1. Włącz system (mikroskop, power Lab, laser, poduszka grzewcza, komora klimatyczna, kamera internetowa, pompa strzykawkowa, respirator).
  2. Podłączyć zasilanieO2 do oparów izofluranu i ustawić poziom izofluranu na 1,5% obj. (v/v), podłączyć do respiratora dla małych zwierząt.
    1. W przypadku krótkotrwałego obrazowania należy utrzymać znieczulenie za pomocą izofluranu dopiero po początkowej indukcji znieczulenia dożylnego (patrz krok 2.2). Następnie należy użyć izofluranu o stężeniu 2% obj. (v/v) i utrzymać czas obrazowania poniżej 2 godzin, aby zagwarantować stabilne mikrokrążenie wątrobowe.
  3. Ustaw oddychanie na 120-140 cykli oddechowych/min przy objętości 150-200 μl.
  4. Ustaw scenę agarozy myszy. Przygotuj 100 ml 3% (w/v) agarozy, rozlewając ją do naczynia (około 10 cm x 15 cm podstawy) pod kątem 40°.
  5. Przygotuj miejsce pracy chirurgicznej, w którym zbierzesz wymagane oprzyrządowanie. Aby zapobiec infekcji mikrobiologicznej, należy zdezynfekować narzędzia za pomocą 1% roztworu Sekusept Forte S (9,9% w/v), Glutaral 9,8% w/v, Formaldehyd przez 5 minut przed eksperymentem (Rysunek 1A).
  6. Zaopatrz się w pozostałe składniki: środek do dezynfekcji skóry (np. 10% roztwór jodu powidonu), faza wątrobowa (stosy i mostek), roztwór agarozy (3% (w/v) w PBS), pompka strzykawkowa z 5% (w/v) roztworem glukozy (G-5), pompka strzykawkowa z roztworem znieczulającym I (Ketamina 0,1 mg/ml, Ksylazyna 0,5 mg/ml, Fentanyl 5 μg/ml), waciki, n-butylo-2-cyjanoakrylan i 1x PBS. Umieść naczynie etapowe agarozy w komorze inkubacyjnej w celu wstępnego podgrzania.

2. Tracheotomia (10-15 min)

  1. Myszy C57BL/6 należy stosować w hodowli inwentarskiej o wadze 25-28 g. Myszy należy trzymać w określonych warunkach wolnych od patogenów, zgodnie z wytycznymi FELASA, w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z 12-godzinnym cyklem światła i 12-godzinnym ciemnym cyklem. Pozwól zwierzętom na swobodny dostęp do standardowej diety myszy (Sniff Standard Rodent Diet) i wody ad libitum.
  2. Znieczulić mysz przez wstępne dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie 250 μl roztworu znieczulającego II (ketamina 0,1 mg/ml, ksylazyna 1 mg/ml, buprenorfina 10 μg/ml).
    1. * W celu utrzymania podczas obrazowania przyżyciowego, należy w sposób ciągły podawać roztwór znieczulający I przez ciągłe wstrzyknięcie i.p. (ketamina 0,1 mg/ml, ksylazyna 0,5 mg/ml, fentanyl 5 μg/ml) za pomocą pompki strzykawkowej o natężeniu przepływu 0,2 ml/h w połączeniu z wziewnym izofluranem 0,5 vol% (v/v).
    2. Sprawdź odruchy po 5 minutach (np. uszczypnij opuszkę pod stopę kleszczami), zdezynfekuj skórę do tracheotomii, rozpocznij przygotowania, jeśli mysz jest w stanie znieczulenia tolerancyjnego chirurgicznego.
    3. Zastosuj krem ochronny pod oczy (np. dekspantenol 50 mg/g), aby zapobiec wysuszeniu rogówki (ryc. 1B).
  3. Unieruchamiamy mysz na stole przygotowawczym, odsłaniając stronę brzuszną za pomocą taśmy klejącej na kończyny; delikatnie nadmiernie rozciągamy szyję, mocujemy w tej pozycji, np. za pomocą gumki recepturki zaczepionej o siekacze.
    1. Zdezynfekuj skórę i sierść za pomocą roztworu jodu powidonu, nakładając środek dezynfekujący za pomocą wacika.
  4. Wykonaj wstępne nacięcie skóry (0,5-1 cm długości) bezpośrednio pod brodą (Rysunek 1C)
    1. Ostrożnie wypreparuj tkankę łączną między gruczołami ślinowymi (ryc. 1D).
    2. Ostrożnie rozerwij rurkę mięśniową otaczającą tchawicę (ryc. 1E,F).
  5. Umieść nić chirurgiczną pod tchawicą w celu późniejszego zamocowania rurki wentylacyjnej (ryc. 1G).
    1. Otwórz tchawicę za pomocą mikronożyczek między pierścieniami chrząstki, wykonując nacięcie w kształcie litery T (ryc. 1H)
  6. Umieścić rurkę wentylacyjną w tchawicy przez nacięcie (~0,5 cm). Aby popchnąć rurkę do przodu, chwyć koniec ogonowy małymi anatomicznymi kleszczami i delikatnie wsuń rurkę do tchawicy (ryc. 1I)
  7. Przymocuj rurkę za pomocą nici chirurgicznej (np. 5-0) za pomocą gwintu umieszczonego w kroku 2.5, zawiązując węzeł wokół rurki wewnątrz tchawicy; wykonaj drugie mocowanie rurki czaszkowo do skóry, aby uniknąć przypadkowego osadzenia (ryc. 1J, K).
  8. Uszczelnić cięcie za pomocą kleju tkankowego (np. n-butylo-2-cyjanoakrylowa) (rysunek 1L).
  9. Przymocuj rurkę do głowy za pomocą taśmy klejącej.

3. Laparatomia (15-20 min)

  1. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii. Ogol brzuch, ostrożnie usuń włosy ze skóry. Zdezynfekuj ogoloną skórę i sierść za pomocą roztworu jodu powidonu.
  2. Wykonaj małe nacięcie skóry poniżej mostka za pomocą nożyczek chirurgicznych (ryc. 2A). Rozciągnij nacięcie na boki poniżej żeber po obu stronach, kauteryzując wszystkie widoczne naczynia krwionośne, aby zapobiec krwawieniu.
  3. Ostrożnie wykonaj małe nacięcie na kresie białej poniżej mostka, otwierając otrzewną (ryc. 2B). Rozciągnij cięcie na obie strony, stosując kauteryzację, aby zapobiec krwawieniu (Rysunek 2C, D).
  4. Umieść mysz w naczyniu z agarozą (ryc. 2E). Umieść stosy o odpowiedniej wysokości po obu stronach myszy (zwykle 12-14 szkiełek nakrywkowych) (Rysunek 2F).
  5. Umieść czujnik spustowy oddechu pod górną częścią pleców, aby zsynchronizować mikroskop z oddychaniem. Aktywuj jednostkę spustową (Rysunek 2G).
  6. Umieść nić chirurgiczną (5-0) przez mostek, aby cofnąć żebra (ryc. 2I).
  7. Ostrożnie przeciąć więzadło łączące wątrobę i przeponę (więzadło falciform), a także wątrobę i przewód pokarmowy za pomocą zakrzywionych nożyczek chirurgicznych. Przeciąć więzadło sierpowe aż do aorty (ryc. 2J).

4. Przykładowa konfiguracja (10-15 min)

  1. Umieść mysz po prawej stronie pod kątem 45°, aby uzyskać łatwy dostęp do dużego płata wątroby.
  2. Dodaj mostek stopniowy poniżej żeber, zakrywający jamę brzuszną. Wykonać most, używając standardowego szkiełka nakrywkowego z powłoką z taśmą samoprzylepną do zakrycia ostrych krawędzi (Rysunek 2K).
  3. Umieść duży płat wątroby na scenie. Ostrożnie wsuń sondę z podwójną kulką lub wyściełaną szpatułkę poniżej wątroby i przytrzymaj górną część narządu za pomocą wilgotnego bawełnianego wacika lub mokrej chusteczki. Podnieś listek na zjeżdżalnię i delikatnie przeciągnij. Płat może być zgięty lub złożony. Zachowaj szczególną ostrożność tylko podczas delikatnej manipulacji wątrobą (ryc. 2L).
  4. Umieścić obok nich boczne kołki podtrzymujące, np. stosy małych szkiełek nakrywkowych (20 mm x 20 mm) o mniej więcej tej samej wysokości płata wątroby, aby podeprzeć szkiełko nakrywkowe.
  5. Umieść duże szkiełko nakrywkowe (24 mm x 50 mm) na płatku wątroby. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest ustawione jak najbardziej poziomo (Rysunek 2M).
    UWAGA: Szkiełko nakrywkowe powinno stykać się z tkanką, nie ściskając jej. Sprawdź, czy nie ma widocznych oznak upośledzonego przepływu krwi (biała tkanka). Jeśli mikrokrążenie zostanie zakłócone, dodaj kolejne kołki podtrzymujące.
  6. * Umieścić dwa niezależne cewniki dootrzewnowe (ryc. 2N) do długotrwałego znieczulenia i aplikacji G-5. Zainstaluj cewniki bocznie w dolnej części brzucha obok kończyn tylnych.
    UWAGA: Cewniki dootrzewnowe można wykonać samodzielnie, łącząc igły 27 G z elastyczną silikonową rurką (ryc. 3).
  7. * Przymocuj igłę za pomocą pętli z nici chirurgicznej 5-0 do skóry, aby uniknąć przypadkowego przemieszczenia.
  8. * Podłącz pompę strzykawkową z roztworem znieczulającym I do cewnika 1, ustaw szybkość przepływu na 0,2 ml / h; podłącz pompę strzykawkową z G-5 do cewnika 2, ustaw natężenie przepływu na 0,1 ml / h.

5. Monitorowanie myszy

  1. * Umieść elektrody EKG w kończynach przednich i tylnych (ryc. 4A).
  2. * Podłącz rurkę wydechową do czujnika poziomu CO2.
  3. Dodaj zewnętrzny czujnik temperatury podłączony do poduszki grzewczej (Rysunek 4C).

6. Osadzanie i utrwalanie tkanek (5-10 min)

  1. Przygotuj 100 ml 3% (w/v) agarozy w 1X PBS. Zanurzyć wątrobę, gdy temperatura wynosi 41 °C, za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły 18 G (ryc. 5A).
  2. Wlej pozostałą agarozę na szkiełko nakrywkowe i wokół myszy (Ryc. 5B, C). Poczekaj, aż agaroza zostanie całkowicie zżelowana.
  3. Usuń nadmiar agarozy za pomocą szpatułki Heimemanna, przygotowując pole widzenia wystarczająco duże, aby zeskanować przygotowany płat wątroby (ryc. 5D, E).

7. Obrazowanie

  1. Przenieś mysz do komory klimatycznej mikroskopu.
  2. Dodać 50-100 ml 1x PBS (podgrzanego w temperaturze 37 °C).
  3. Przykryj naczynie na próbkę, aby zapobiec parowaniu (Rysunek 5F).
  4. * Zmniejszyć wziewny izofluran do 0,5% obj. (v/v).
  5. * Uruchom oprogramowanie monitorujące, rejestrujące EKG, tętno i wydechowy CO2 .
  6. Rozpocznij obrazowanie: otwórz migawki laserowe, zidentyfikuj pola zainteresowania widoku, zdefiniuj górną i dolną granicę dla stosów Z i rozpocznij nagrywanie poklatkowe. W razie potrzeby wyreguluj stosy Z, aby skorygować dryft Z (np. z powodu zmian ciśnienia krwi lub wahań temperatury, Rysunek (5G).
    UWAGA: Po zakończeniu okresu obrazowania lub jeśli krążenie lub znieczulenie zwierząt staje się niestabilne, należy złożyć ofiary myszy przez zwichnięcie szyjki macicy (bez budzenia się ze znieczulenia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby potwierdzić nasze podejście do TPLSM, poddaliśmy myszy CXCR6gfp/+ dożylnemu obrazowaniu TPLSM. Myszy pozostawiono nieleczone jako wyjściową grupę kontrolną lub poddano pojedynczemu wstrzyknięciu dootrzewnowemu czterochlorku węgla (CCl4) w celu wywołania ostrego uszkodzenia wątroby20.

Sekwencje wideo były wykonywane przez okres 2-5 godzin, a komórki były śledzone w czasie ze względu na ich zieloną fluorescencję. Aby pokazać ogólną ruchliwość komórkową, wszys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem naszego badania było opracowanie wysoce standaryzowanej, stabilnej i powtarzalnej metody obrazowania wątroby w celu dożytkowego obrazowania TPLSM. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie przyżyciowe dostarczyło cennych informacji na temat zachowania komórek w rzeczywistych warunkach życia po naprowadzaniu i interakcji różnych populacji leukocytów w rozwoju, homeostazie i chorobie. Jednak nieco trudna pozycja anatomiczna wątroby, dzięki której ruchy oddechowe i perystaltyczne jelit są bezpośrednio przenoszone do wątroby, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Centralnemu Ośrodku dla Zwierząt Szpitala Uniwersyteckiego w Akwizgranie za wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) oraz przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) w Akwizgranie. Prace te były dodatkowo wspierane przez Core Facility "Two-Photon Imaging", Core Facility Interdyscyplinarnego Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Aachen w ramach Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Środki znieczulające
BuprenorfinaEssex Pharma997.00.00Analgeticum, 0,1 mg/kg
FentanylRotex Medicaopłata: 30819
System anestezjologiczny FluovacAparat Harvarda34-1030
Parownik
ISOFLO (Isoflurane Vapor)Eickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Izotoniczny (0,9%) roztwór NaClDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10%cevaOpłata: 36217/09
Xylazin 2%medistarŁadunek: 04-03-9338/23
Materiały
20 ml StrzykawkaBD Plastipak
250 ml Kolba ErlenmeyeraSchott Duran21 226 36
25 ml Zlewka 2xSchott Duran50-1150
2 ml StrzykawkaBD Plastipak
4-0 VicrylEthiconV7980
Agarozadostępna
Bepanthen Eye i Maść do nosaBayer Vital GmbH6029009.00.00
Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej Change-A-Tip DeluxeFine Science Tools Inc.18010-00
Waciki z gazy bawełnianejFuhrmann GmbH32014
Szkiełko nakrywkowe 24x50 mmROTH1871
Taśma jedwabna Durapore3M1538-1
Skalpel jednorazowyzFeather 02.001.30.011
Rurka polietylenowa o drobnym otworze 0,58 mm IDSmiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525x 0,5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
Szkiełka mikroskopoweROTH1879
Poly-Alcohol Haut… farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
Igła Sterican 18 G x 1B. Igła Braun304622
Sterican 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
Bibułkadostępna
Narzędzia
Amalgamat Burnisher 3PLGatz0110?
Retraktory Blair (4-zębne ()) x2Storz& KleinS-01134
Kleszcze Dumont No.7Fine Science Tools Inc.91197-00
Kleszcze Graefe zakrzywione x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Kleszcze Graefe proste x2Fine Science Tools Inc.11050-10
Szpatułka Heidemann HD2Stomia2030.00
Uchwyt na igłę MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
NożyczkiFine Science Tools Inc.14074-11
Kleszcze SemkenFine Science Tools Inc.11008-13
Małe nożyczki chirurgiczne zakrzywioneFine Science Tools Inc.14029-10
Małe nożyczki chirurgiczne prosteFine Science Tools Inc.14028-10
Kleszcze standardoweFine Science Tools Inc.11000-12
Nożyczki sprężynowe VannasFine Science Tools Inc.15000-08
Sprzęt
Jednostka wyzwalająca EKG3000003686biomedyczny
MICROCAPSTAR Analizator dwutlenku węgla końca pływu InstrumentyAD Minivent
Typ 845Aparat Harvard73-0043
Mikroskop wielofotonowy Trimskop ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8-kanałowy rejestratorAD InstrumentsPL3508
Poduszka grzewcza z regulacją temperaturySygonix26857617
Czujnik temperaturydostępny
System kontroli temperatury do mikroskopów -Cube& obrazowania Box Life
Glucose 5% Braun eksploatacyjnew handlu piór w handluchirurgiczne Szybki na rynku Usługi

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955(1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Intravital MicroscopyMultiphoton MicroscopyLiver ImagingCXCR6 Gfp MiceLeukocyte MigrationCell Cell InteractionsLong Term ImagingTissue StabilizationVital Parameter MonitoringLaser Scanning Microscopy

Powiązane artykuły