Artykuł metodologiczny

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52654

⸱

31 stycznia 2015

 ,  , 
1Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Streszczenie

Płetwa ogonowa larwy danio pręgowanego jest idealna do badania regeneracji tkanek ze względu na prostą architekturę fałdu płetwy larwalnej, która składa się z dwóch warstw skóry, które otaczają niezróżnicowaną mezenchymę, oraz dlatego, że płetwa ogonowa larwy szybko się regeneruje w ciągu 2-3 dni. Korzystając z tego systemu, demonstrujemy metodę uchwycenia dynamiki naprawy amputowanej płetwy ogonowej za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu. Wykazaliśmy, że amputacja płetwy wywołuje skurcz rany po amputacji i ekstruzję komórek wokół brzegu rany, co prowadzi do ich późniejszego usunięcia. Regeneracja płetw przebiega od kierunku bliższego do dystalnego po krótkim opóźnieniu. Ponadto na wszystkich etapach można zaobserwować wzrost rozwojowy larwy. Przedstawiona metoda daje możliwość obserwacji i analizy zachowań w całej skali tkankowej, takich jak rozwój i wzrost płetw, w prostym ustawieniu mikroskopowym, który można łatwo dostosować do dowolnego mikroskopu stereoskopowego z możliwością wyświetlania filmów poklatkowych.

Wprowadzenie

Zdolność organizmu do organizowania procesów naprawy tkanek po urazie jest kluczowa dla jego przetrwania 1. Chociaż wszystkie zwierzęta mają zdolność gojenia się ran, stopień, w jakim tkanki się regenerują, różni się znacznie u poszczególnych gatunków. Gatunki kręgowców, takie jak danio pręgowany, salamandry i kijanki żab, mają niezwykłą zdolność do regeneracji utraconych tkanek, w tym przydatków, części oczu, serca i ośrodkowego układu nerwowego 2-4. Gatunki ssaków, takie jak afrykańska mysz kolczasta i króliki, są zdolne do regeneracji otworów w małżowinach usznych 5-7, a ludzie i myszy regenerują części wątroby, a także końcówki palców w stadiach płodowych i młodocianych 8-12. Chociaż nie jest jeszcze dobrze zrozumiałe, dlaczego i w jaki sposób niektóre gatunki regenerują tkanki skuteczniej niż inne, obecność podobnych szlaków genetycznych sugeruje, że mechanizmy te mogą być uśpione u gatunków bez dużego potencjału regeneracyjnego 13,14. W ten sposób wyjaśnienie mechanizmów naprawy i regeneracji tkanek u gatunków z zadowalającymi wynikami regeneracji przyniesie korzyści w regeneracji u ludzi.

Wybraliśmy płetwę ogonową larwy danio pręgowanego jako paradygmat, aby zademonstrować jej regenerację za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu. Płetwa ogonowa larwy danio pręgowanego jest anatomicznie prosta w porównaniu z bardziej złożonymi strukturami dorosłymi, składającymi się z dwuwarstwowego, pofałdowanego nabłonka z somatosensorycznymi aksonami unerwiającymi skórę otaczającą przyśrodkowo położone komórki mezenchymalne 15. Pomimo różnic anatomicznych, regeneracja płetwy ogonowej larw jest w pewnym stopniu porównywalna z regeneracją płetw dorosłych pod względem sygnatur molekularnych i reakcji na wzrost 16,17. W porównaniu z płetwą dorosłą, obrazowa regeneracja płetwy ogonowej larw ma jednak kilka zalet: 1) regeneracja płetwy larwalnej kończy się w ciągu zaledwie 2-3 dni 16, 2) larwy mogą być montowane w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, oraz 3) larwy nie wymagają karmienia do ~ 5 dni po zapłodnieniu (DPF) ze względu na obecność woreczka żółtkowego. To sprawia, że larwy danio pręgowanego idealnie nadają się do obserwacji dynamiki naprawy tkanek in vivo.

Przedstawiona metoda umożliwia uchwycenie szczegółowej dynamiki leżącej u podstaw wczesnych procesów regeneracji płetw. W wielu badaniach wykorzystano mikroskopię konfokalną opartą na fluorescencji do badania komórkowych i subkomórkowych procesów biologicznych u embrionalnych i larwalnych danio pręgowanych. Zaawansowane koncentracje obrazowania konfokalnego nie są jednak często dostępne dla wszystkich i bardzo drogie w porównaniu z innymi technikami obrazowania. Natomiast prezentowana metodologia wykorzystuje mikroskop stereoskopowy Discovery V12 wyposażony w oprogramowanie Axiovision i moduł poklatkowy, zapewniając tym samym bardziej przystępną cenowo alternatywę dla drogiego sprzętu do obrazowania do badania zachowań tkanek. Pokazujemy, że metoda ta może być wykorzystana do obrazowania regeneracji tkanek z wysoką rozdzielczością czasową przy minimalnych kosztach. Implikacje tej metody mogą wykraczać poza podstawową biologię, aby przyspieszyć badania nad regeneracją ssaków z wykorzystaniem kultur narządowych, do rozwoju terapeutycznego poprzez farmakologiczne i genetyczne badania przesiewowe, a także może służyć jako narzędzie dydaktyczne w klasie.

Protokół

Danio pręgowany (szczep masy perłowej) był hodowany i hodowany zgodnie z ustalonymi protokołami. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie, stosując 0,4 mM Trikainy do znieczulenia i 1 mM Trikainy do eutanazji. Z zarodkami i larwami danio pręgowanego obchodzono się ściśle zgodnie z dobrą praktyką zwierzęcą, zatwierdzoną przez odpowiedni komitet (MDI Biological Laboratory, rdzeń zwierzęcy IACUC nr 13-20). Badanie to zostało zatwierdzone przez National Human Genome Research Institute Animal Care and Use Committee, MDIBL Institutional Assurance # A-3562-01 na podstawie protokołu # 14-09.

Uwaga: Procedura obrazowania, która rejestruje regenerację płetw u larw danio pręgowanego, podsumowuje się w następujących krokach:

1. Hodowla danio pręgowanego do stadium larwalnego

  1. Zbierz jaja i umieść około 50 jaj na szalce Petriego o wymiarach 100 x 25 mm zawierającej 0,03% soli oceanicznej instant w wodzie dejonizowanej uzupełnionej 0,00004% błękitu metylenowego. Inkubować O/N w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
  2. Następnego ranka usuń martwe zarodki szklaną pipetą i opłucz jaja na sitku z 0,03% solą oceaniczną instant w wodzie dejonizowanej (zwanej pożywką zarodkową).
    Uwaga: Preferowane mogą być średnie, takie jak Ringers 18, Hanks 18, E2 19, E3 20 i Danieau 21.
  3. sup>Dodaj świeżą pożywkę z zarodków do potrawy. W przypadku stosowania szczepów barwnikowych opcjonalnie należy dodać 0,2 mM 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU), ponieważ PTU zapobiegnie melanogenezie, a tym samym pigmentacji larw. Pozwól zarodkom rozwijać się dalej w inkubatorze do 2 dni po zapłodnieniu lub innym pożądanym stadium larwalnym.

2. Przygotowanie komory obrazowania

  1. Metoda 1: Komory obrazowania wykonane z rurki PVC lub teflonowej (rysunek 1)
    Uwaga: Ta metoda jest podobna do Concha i Adams (1998) 22.
    1. Kup plastikowe lub teflonowe rurki do wody pitnej w sklepie z narzędziami o średnicy zewnętrznej 25 mm i wewnętrznej 20 mm. Przytnij rurkę, aby utworzyć pierścienie o grubości około 10 mm z równą powierzchnią z każdej strony. Użyj papieru ściernego o ziarnistości > 200, aby wygładzić krawędzie.
    2. Wyczyść pierścienie ciepłą wodą i 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    3. Za pomocą końcówki do pipet nałóż smar silikonowy na jedną połowę pierścienia i przymocuj pierścień do szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 75 mm x 25 mm. Alternatywnie, zamiast końcówki do pipety, należy użyć strzykawki o pojemności 3 ml wypełnionej smarem silikonowym.
      Uwaga: Ponieważ wprowadzenie smaru silikonowego do strzykawki o pojemności 3 ml jest trudne, należy najpierw dodać smar silikonowy do strzykawki o pojemności 30 ml i użyć go do napełnienia strzykawki o pojemności 3 ml.
  2. Metoda 2: Przygotowanie szalki Petriego jako komory obrazowania.
    1. Zaopatrzyć się w szalki Petriego o średnicy 35 lub 60 mm ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym przymocowanym do pokrywki (Rysunek 2A). Alternatywnie, jak pokazano na rysunku 3 w Distel & Koester (2007) 23, wywierć otwór wystarczająco mały, aby pomieścić szkiełko nakrywkowe w pokrywie małej szalki Petriego i nałóż smar silikonowy na zewnątrz za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml. Używając czystej końcówki do pipety, ostrożnie przymocuj okrągłe lub kwadratowe szkiełko nakrywkowe o żądanej grubości na zewnątrz (Rysunek 2B).
  3. Aby upewnić się, że agaroza używana do montażu pozostaje mocno przymocowana podczas procedury obrazowania, przymocuj cienką siatkę z tworzywa sztucznego wewnątrz pierścienia. Najpierw przytnij siatkę wykonaną z ekranu okiennego uzyskanego ze sklepu z narzędziami na rozmiar średnicy pierścienia wewnętrznego za pomocą cienkich nożyczek z kątownikiem. Następnie wytnij mały prostokąt > dwa razy większy od larwy na środku siatki (ryc. 1, 2).
  4. Nałóż cztery małe kropki nietoksycznego smaru silikonowego na powierzchnię styku szkiełka nakrywkowego z pierścieniem komory (rysunek 1A).
  5. Użyj kleszczyków, aby mocno przymocować siatkę do dna szklanego szkiełka nakrywkowego.

3. Montaż i obrazowanie wstępnie uszkodzonej larwy (ten krok jest opcjonalny)

Uwaga: Ten krok jest odpowiedni do porównania długości płetwy amputowanej i zregenerowanej, ponieważ płaszczyzna amputacji po regeneracji płetwy nie jest rozpoznawalna u larw danio pręgowanego.

  1. Przygotować 0,5-1,2% niskotopliwy roztwór agarozy w pożywce zarodkowej w celu unieruchomienia próbki.
  2. Podgrzej agarozę w kuchence mikrofalowej i przenieś płynną agarozę do probówek o pojemności 1,5 ml, które są wstępnie podgrzane do 42 °C w bloku grzewczym.
  3. Pozwól, aby gorąca agaroza ostygła do 42 °C, którą można utrzymać w tej temperaturze przez kilka tygodni. Należy unikać pipetowania larw do agarozy w temperaturze powyżej 42 °C, ponieważ może to być szkodliwe dla zwierząt.
  4. Znieczulić kilka larw za pomocą 10 ml 0,4 mM trikainy (pH 7) w pożywce zarodkowej na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Przygotuj Trikainę zgodnie z przepisami z książki danio pręgowanego 18.
    1. Alternatywnie należy użyć 10 ml rozcieńczonego 99% 2-fenoksyetanolu w stosunku 1:1000 na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Szturchnij larwy zaślepioną końcówką pipety do mikroładowania, aby ocenić ich reakcję na dotyk przed kontynuowaniem. Używaj tylko larw, które nie reagują.
  5. Przenieść jedną larwę do roztworu agarozy o temperaturze 42 °C za pomocą szklanej pipety Pasteura. Nie przenoś nadmiaru płynu do agarozy, w przeciwnym razie agaroza będzie zbyt rozcieńczona i nie zestali się.
  6. Wylać pozostały płyn z pipety i przenieść larwę wraz z jedną kroplą agarozy na małą szalkę Petriego (o średnicy 35 lub 60 mm). Umieść larwę na boku, aby zobrazować płetwę ogonową.
  7. Pozwól agarozie stężyć. Oceń agarozę za pomocą plastikowej końcówki pipety; Końcówka zanurzy się w agarozie, jeśli jest zbyt płynna. Gdy agaroza zastygnie, po dotknięciu końcówką pipety widoczne będzie małe wgłębienie. Po zestaleniu dodaj roztwór trikainy i przejdź do mikroskopu stereoskopowego, który będzie później używany do obrazowania poklatkowego.
    Uwaga: Ten etap można również wykonać, umieszczając znieczuloną larwę na szalce Petriego pokrytej 1,5% agarozą w pożywce zarodkowej.
  8. Użyj mikroskopu stereoskopowego z oprogramowaniem poklatkowym. Wybierz odpowiedni obiektyw i powiększenie, które będzie później wykorzystywane do wykonywania zdjęć poklatkowych. W tym przypadku użyj obiektywu o wymiarach 3,5 x i odległości roboczej 16 mm w mikroskopie stereoskopowym. W razie potrzeby należy użyć alternatywnych mikroskopów i soczewek obiektywowych, ale wybrać odpowiednie powiększenie, aby uwzględnić potencjalny dryf xy i wzrost płetwy podczas procedury obrazowania.
  9. Wybierz tryb wykrywania kamery w mikroskopie.
  10. W oprogramowaniu wybierz tryb "na żywo", aby wyświetlić larwę na ekranie.
  11. Otwórz okno "Właściwości", aby automatycznie wykryć jasność.
  12. Ręcznie wyreguluj kontrast w podstawie transoświetlenia mikroskopu.
  13. Odsuń larwę poza pole widzenia i wybierz funkcję Korekcja cieniowania, aby zminimalizować szumy tła.
  14. Ustaw larwę z powrotem w polu widzenia i zrób zdjęcie. Zapisz obraz.
  15. Usuń agarozę z larwy, najpierw zeskrobując agarozę z głowy. W ten sposób larwę można wysunąć z agarozy, delikatnie odciągając głowę od pozostałej agarozy za pomocą zakrytej końcówki pipety do mikroładowarki lub szpilki do owadów.
  16. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś larwę do świeżego roztworu Trikainy.

4. Test amputacji

  1. Przygotuj 1,5% roztwór agarozy za pomocą pożywki z zarodków i wlej cienką warstwę na szalkę Petriego. Niech agaroza stężeje.
  2. Pod mikroskopem stereoskopowym umieścić larwę bokiem na zestalonej agarozie i amputować płetwę ogonową za pomocą igły strzykawkowej 23 G z lekkim naciskiem (ryc. 3A).

5. Montaż larwy do obrazowania poklatkowego

  1. Postępuj zgodnie z opisem w krokach 3.1 – 3.5 (Rysunek 3B).
  2. Przenieść kroplę 0,5-1,2% ciekłej agarozy o temperaturze 42 °C zawierającą larwę do pierścienia komory obrazowania (krok 2.1), ustawić larwę i pozwolić agarozie zastygnąć. Napełnij pierścień roztworem trikainy. Alternatywnie, jeśli używana jest komora na szalkę Petriego (krok 2.2), zamontuj larwę na szkiełku nakrywkowym i napełnij pokrywkę roztworem trikainy.
  3. Aby umożliwić prawidłowe gojenie się ran lub regenerację tkanek, ostrożnie zeskrob agarozę otaczającą dystalną płetwę ogonową za pomocą zaślepionej końcówki pipety do mikroładowarki lub szpilki do owadów. Staraj się nie uszkadzać płetwy wielokrotnie (Rysunek 3C).
  4. Zdekantować roztwór trikainy zawierający usuniętą agarozę i napełnić pierścień komory świeżym roztworem trikainy.
  5. Nałóż smar silikonowy na górną część pierścienia komory i zamocuj szkiełko o wymiarach 75 mm x 25 mm. Staraj się unikać kieszeni powietrznych w komorze, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie w jasnym polu i z czasem wysuszać larwę.
  6. Jeśli używasz szalki Petriego jako komory obrazowania, nałóż smar silikonowy na górną krawędź dolnej komory i napełnij dolną komorę roztworem trikainy. Ostrożnie zdekantować roztwór Tricaine do pokrywki i odwrócić pokrywkę, aby zanurzyć larwę w roztworze Tricaine w dolnej komorze pod niewielkim kątem, aby uniknąć kieszeni powietrznych. Komora zostanie uszczelniona ze względu na smar silikonowy.

6. Obrazowanie poklatkowe

  1. Zmontować podgrzewaną komorę inkubacyjną zgodnie z opisem w 23,24 (rysunek 4). Umieść komorę inkubacyjną wokół mikroskopu i włącz ogrzewanie. Ustaw temperaturę na 28 °C na około 10 - 20 minut lub do momentu, gdy temperatura się ustabilizuje.
  2. Otwórz przód podgrzewanej komory inkubacyjnej i umieść komorę obrazowania na statywie mikroskopu ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym do góry w kierunku obiektywu.
  3. Ustawić płetwę larwalną w taki sposób, aby 2/3 pola widzenia pozostało niezajęte. Zapewnia to uchwycenie wzrostu i regeneracji płetwy w trakcie procedury obrazowania bez konieczności zmiany położenia larwy.
    1. Ustaw zamontowaną larwę na 28 °C na ~ 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania poklatkowego, aby uniknąć zmian intensywności jasnego pola lub potencjalnych przesunięć agarozy. Alternatywnie użyj wstępnie podgrzanego bufora, aby rozpocząć obrazowanie po krótszym czasie regulacji.
  4. Aby skonfigurować nagrywanie poklatkowe, otwórz okno 6D Multidimensional Acquisition w oprogramowaniu Axiovision i wybierz opcję z-stack i time-lapse.
  5. Opcjonalnie) Na karcie z-stack i Slice Mode (Tryb cięcia) wybierz grubość plasterka, a następnie wybierz tryb Start/Stop.
  6. Określ górną i dolną pozycję stosu.
  7. Na karcie poklatkowej wybierz interwał i czas trwania filmu, a następnie rozpocznij film, naciskając przycisk start. Stwierdziliśmy, że 30-minutowe interwały są wystarczające i ten interwał nie generuje nadmiernych danych; Można jednak stosować krótsze interwały.
  8. Sprawdź pozycję i wymiary stosu z w ciągu pierwszej godziny, jeśli larwa nie została wstępnie wyregulowana. W razie potrzeby po dniu należy ponownie zmienić położenie larwy, ponieważ larwa mogła się przesunąć.
  9. Zapisz plik na końcu nagrania poklatkowego i kontynuuj obróbkę końcową i kwantyfikację za pomocą dostępnego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Imaris 25 lub pakietów oprogramowania open source Image J 26 i Fiji 27.

7. Analiza danych

  1. Określanie długości żeber.
    1. Otwórz film poklatkowy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu i zapisz pliki w zastrzeżonym formacie plików, aby zwiększyć wydajność oprogramowania.
    2. Wybierz widok ortogonalny, aby wyświetlić poszczególne sekcje jako rzutowane stosy. Aby uzyskać korekcję dryfu, w menu Fidżi wybierz Wtyczki, następnie Rejestracja i "Popraw dryf 3D". Spowoduje to otwarcie okna Fidżi i wykonanie korekt dryfu. Prawidłowy dryft obrotowy w funkcji Imaris Spots. Alternatywnie zainstaluj wtyczki StackReg i TurboReg w Image J i zaimportuj na Fidżi. Wybierz żądany algorytm transformacji we wtyczce StackReg.
    3. Aby zmierzyć odległości (np. średnicę nawinięcia lub długość żeber), wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiarowe" na lewym górnym pasku narzędzi.
      1. W sekcji "Konfiguruj listę widocznych wartości statystyk" w lewym dolnym menu wybierz wartości statystyk, które mają być wyświetlane.
      2. W 'Trybie liniowym' w zakładce ustawień wybierz 'Pary (AB, CD ...)Wizyta
        3. w Nowym Jorku.
      3. W "Właściwościach etykiet" wybierz "Nazwa" i "Odległość", aby wyświetlić odległość między punktami A i B obok linii pomiaru.
      4. Przełącz się na tryb "Edycja" i przytrzymaj przycisk Shift, aby wybrać pierwszy punkt na końcu struny grzbietowej. Następnie użyj tej samej konfiguracji, aby wybrać drugi punkt na dystalnym brzegu płetwy.
      5. W zakładce "Statystyki" wybierz przycisk dysku (Eksportuj wszystko) w prawym dolnym rogu, aby wyświetlić i wyeksportować odległość na obrazie.
      6. Powtórz pomiary w wybranych momentach, przesuwając suwak pod obrazem w prawo. Zamiast tworzyć nowe punkty pomiarowe, poprzednie można przesunąć, najpierw zaznaczając punkt lewym przyciskiem myszy, a następnie jednocześnie naciskając shift i lewy przycisk myszy w nowej pozycji.
    4. Alternatywnie do opcji Punkty pomiaru, użyj przeglądarki przekrojów do pomiaru odległości. W trybie widoku plasterków przewiń do żądanej pozycji i kliknij pierwszą i drugą pozycję lewym przyciskiem myszy. Zostanie wyświetlona odległość. Opcja ta nie pozwala jednak na eksport danych.
  2. Określanie długości i powierzchni żeber w ImageJ.
    1. Otwórz film poklatkowy w ImageJ za pomocą wtyczki, która rozpoznaje format pliku .zvi. Alternatywnie można załadować plik QuickTime lub tiff sequence.
      Uwaga: W przypadku korzystania z nieskompresowanego formatu pliku TIFF nie trzeba określać wymiarów obrazu.
    2. Jeśli otwierasz plik w innym formacie bez informacji o pliku, wybierz opcję "Ustaw skalę" w menu "Analizuj", aby najpierw zdefiniować odległość i jednostkę obrazu. W menu "Ustaw skalę" wpisz "Odległość w pikselach", poniżej wpisz "Znana odległość" jako wartość pikseli (można ją uzyskać, mierząc liczbę pikseli na pasku skali, który został dodany do obrazu, a następnie kliknij Zmierz, aby uzyskać wynik) i "Jednostka długości" (zwykle "μm"). Następnie kliknij przycisk OK.
    3. Aby zmierzyć obszar żeber, wybierz narzędzie "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi i obrysuj obszar żeber, przytrzymując lewy przycisk myszy podczas rysowania wzdłuż konturu płetwy. Aby zmierzyć długość żeber, wybierz narzędzie "Linia prosta" i narysuj linię między żądanymi punktami, które mają być mierzone.
    4. Kliknij opcję "Zmierz" w sekcji "Analizuj", aby wyświetlić obszar i długość płetwy. Powtarzaj ten krok tak często, jak to konieczne dla wielu punktów czasowych filmu.
  3. Za pomocą oprogramowania statystycznego dane mogą być wyświetlane graficznie.

Wyniki

Przedstawiona technika jest odpowiednia do wyjaśnienia dynamiki naprawy tkanek w odpowiedzi na amputację. Film obrazuje, że amputacja płetwy początkowo wywołuje efekt sznurka uciskowego, charakteryzujący się skurczami poprzez cable aktyno-miozynowe obecne w fałdzie płetwy 28 (Rycina 5 A,B). Jednocześnie z rany wydostają się komórki (patrz. film). Skurcz ten może zatem być sposobem na usunięcie komórek, które prawdopodobnie są przeznaczone do śmierci komórkowej. Nasze wyniki pokazują ponadto, że wzrost rozwojowy larwy zachodzi niezależnie od regeneracji (film), podczas gdy regeneracja płetwy nie rozpoczyna się aż do około 14 h po amputacji, co zmierzono na podstawie długości i powierzchni płetwy w czasie 36 h po amputacji (Rycina 5C, D). Całkowity regeneracyjny wzrost płetwy po 1,5 dnia wyniósł około 60% pierwotnej długości płetwy (Rycina 5E). Podsumowując, wyniki te wykazują, że amputacja wywołuje skurcz płetwy, wydostawanie się komórek z rany oraz opóźnioną w czasie odpowiedź regeneracyjną. Chociaż wydostające się komórki są prawdopodobnie przeznaczone do śmierci komórkowej, charakter tych komórek wymaga dalszego wyjaśnienia.

Eksperyment równowagi statycznej; układ filtracji na szkiełkach, inspekcja siatki pod mikroskopem.
Rycina 1. Zespół pierścienia komory obrazowania

(A) Przedstawiono plastikowy pierścień przymocowany do szkiełka nakrywki za pomocą smaru silikonowego. Plastikowa siatka jest przytwierdzona do wnętrza komory za pomocą czterech małych kropel smaru silikonowego. (B) Komora zawierająca zamocowaną larvę jest wypełniona roztworem trikainy, a od góry przymocowano szkiełko przedmiotowe. (C) Pokazano zamocowaną 2-dniową larvę (strzałka) przy większym powiększeniu, aby zobrazować jej rozmiar w odniesieniu do siatki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Układ mikroskopowy do analizy próbek; widok siatki i obiektywu do obserwacji i pomiaru.
Rycina 2. Zespół komory obrazowej wykonany z szalek Petriego. (A) Przedstawiono komercyjną szalkę Petriego z szklanym dnem i pokrywką, z plastikową siatką przymocowaną do szklanego nakrycia. (B) Przedstawiono własnoręcznie wykonaną komorę w szalce Petriego z nawierconym otworem w pokrywce i nakryciem przytwierdzonym od zewnątrz za pomocą smaru silikonowego. Siatka i larwa są zamontowane wewnątrz komory zawierającej roztwór Tricaine. Aby uszczelnić komorę, na górną, zewnętrzną krawędź dolnej części szalki nakłada się smar silikonowy, a następnie mocuje pokrywę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces amputacji płetwy ogonowej; schemat; montowanie zarodka w agarozie; konfiguracja obrazowania poklatkowego.
Rysunek 3. Schemat amputacji i montowania larwy do obrazowania. (A) W celu amputacji należy umieścić znieczuloną larwę na pokrytej agarozą szalce Petriego i odciąć płetwę ogonową za pomocą igły strzykawki. (B) W celu montowania należy przenieść larwę za pomocą pipety transferowej do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej płynną agarozą o temperaturze 42 °C, nanieść kroplę zawierającą larwę do komory obrazowania, ustawić rybę w odpowiedniej pozycji i przykryć zestaloną agarozę medium dla zarodków. (C) Usunąć agarozę z płetwy ogonowej za pomocą zakrytego końcówki pipety mikro-loader lub podobnego narzędzia i zastąpić medium dla zarodków świeżym medium. (D) Wykonać obrazowanie płetwy ogonowej pod stereomikroskopem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ mikroskopu kriogenicznego do badań wzbudzenia optycznego; owinięcie izolacyjne, układ soczewek, kamera.
Rysunek 4. Własnoręcznie wykonana podgrzewana komora inkubacyjna. (A-C) Przedstawiono podgrzewaną komorę inkubacyjną wykonaną z tektury, folii bąbelkowej i rzepów. Przewodowy grzejnik kopułowy (pierwotnie zaprojektowany do inkubacji jaj kurzych) jest przymocowany do komory za pomocą taśmy aluminiowej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Badanie regeneracji płetwy ryby danio-ostrobramca; schemat amputacji, obrazy mikroskopowe, wykresy wzrostu, analiza danych.
Rycina 5. Dynamika regeneracji płetwy. (A) Schemat zastosowanego testu amputacji płetwy ogonowej oraz metody ilościowej służącej do wyznaczania długości płetwy (czerwona strzałka) i jej powierzchni (czerwony obrys płetwy). (B) Amputacja płetwy ogonowej początkowo wywołuje skurcz płetwy, po którym następuje rozrost tkanki regeneracyjnej. Płetwa podlega również wzrostowi rozwojowemu, o czym świadczy zwiększenie jej rozmiaru w płaszczyźnie bocznej. (C) Przedstawiono długość płetwy w funkcji czasu, co wykazuje liniowy wzrost regeneracyjny rozpoczynający się w ~14 hpa. (D) Ilościowe oznaczenie powierzchni płetwy wykazuje początkowy spadek rozmiaru, który można przypisać skurczowi płetwy. Po ~ 14 hr rozmiar płetwy zwiększa się w tempie liniowym. (E) Porównanie długości płetwy przed amputacją i po 36 hr wykazuje ~ 60% odrostu. Pasek skali: 100 µm Skróty: pre-amp, przed amputacją; hours post amputation, godziny po amputacji, hpa; regen, regeneracja; amp, amputacja Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Film. Regeneracja płetwy w czasie 36 hr. Przedstawiono płetwę ogonową 2,5-dniowej larwy podczas procesu regeneracji. Rozpocząwszy od 30 min po amputacji, wzrost regeneracyjny obrazowano w odstępach 30 min za pomocą stereomikroskopu z obiektywem 3,5x.

Dyskusja

Przedstawiona metoda pozwala na obserwację gojenia się ran i regeneracji tkanek u żywych larw danio pręgowanego za pomocą obrazowania poklatkowego in vivo na stereomikroskopie jasnego pola, przy użyciu stosunkowo prostego układu. Ta procedura wymaga pewnych ważnych aspektów, które przetestowaliśmy, które zoptymalizują wynik: 1) Niskie stężenia agarozy (~0,5%) zminimalizują przeszkody wzrostu stale rosnących larw danio pręgowanego, 2) Usunięcie agarozy wokół płetwy jest ważne, aby nie zaciemniać procesu gojenia, 3) Uwięzienie agarozy w plastikowej siatce utrzymuje agarozę i zwierzę w stabilnej pozycji przez cały zabieg, oraz 4) Odpowiednie środowisko o kontrolowanej temperaturze, które jest niezbędne dla żywotności larw. Dostosowaliśmy podgrzewaną komorę inkubacyjną 23,24, która wykorzystuje folię bąbelkową przyklejoną do kartonu oraz przewodową grzałkę kopułkową do kontrolowania temperatury i prawidłowej cyrkulacji powietrza przy minimalnych wahaniach podczas procedury obrazowania. Ta prosta i ekonomiczna komora może być przygotowana tak, aby pasowała do każdego mikroskopu. Podobna podgrzewana komora inkubacyjna została również wykorzystana do obrazowania rozwoju myszy i piskląt 24,29.

Sugerujemy, aby larwy przed amputacją były montowane w celu uzyskania obrazu sprzed amputacji, demontowane w celu amputacji i ponownie montowane w celu obrazowania poklatkowego. Chociaż możliwe jest wykonanie tych kroków w jednym kroku w końcowej komorze obrazowania, z naszego doświadczenia wynika, że amputacja płetwy ogonowej na szklanym szkiełku nakrywkowym nie jest optymalna, ponieważ rozrywa tkankę i nie powoduje czystego cięcia. Metoda amputacji oparta na agarozie przy użyciu igły strzykawkowej została pierwotnie opisana przez Kawakamiego i współpracowników (2004) 16 i jest również, z naszego doświadczenia, idealna do wykonywania amputacji. Tak więc dość skomplikowana seria kroków, którą przedstawiliśmy, jest dobrze uzasadniona i zapewnia optymalny efekt regeneracji.

Wykazaliśmy, że larwy danio pręgowanego przy 2 dpf można obrazować do 1,5 dnia w roztworze agarozy i trikainy. Zastosowaliśmy zoptymalizowany pod kątem pH roztwór Trikainy (pH7) przygotowany z soli oceanicznej instant, który nie wpływa na zdrowie próbki w prezentowanym okresie obrazowania. Wcześniej jednak wykazaliśmy również, że użycie trikainy w pożywce Danieau pozwala na obrazowanie poklatkowe larw danio pręgowanego o wartości 2,5 dpf pod mikroskopem konfokalnym przez co najmniej 2 dni 30. W ten sposób optymalne warunki buforowe mogą wydłużyć zdrowie larw i czas trwania obrazowania. Alternatywnie, niższe stężenia trikainy mogą być użyte do znieczulenia lub 2-fenoksyetanol, który, jak stwierdziliśmy, jest dobrze tolerowany w stadiach larwalnych i dorosłych w temperaturze 28 °C przez co najmniej 60 godzin.

Aby uniknąć wad w regeneracji płetwy, usunęliśmy agarozę z płetwy ogonowej przed obrazowaniem. Z naszych danych wynika, że w ciągu 1,5 dnia płetwa zregenerowała się do około 60%. To tempo regeneracji jest zgodne z poprzednim badaniem, w którym zdefiniowano 3 dni jako średni czas regeneracji płetwy ogonowej u larw danio pręgowanego do 6 dpf 16. Alternatywne metody dla agarozy mogą być jednak wykorzystane do zamontowania ryb w celu obrazowania. Na przykład cienkie skrzepy plazmowe 31 lub probówki z fluorowanym etylenem propylenem (FEP) pokryte metylocelulozą i wypełnione bardzo niskimi stężeniami agarozy (0,1%) zostały zalecone do mikroskopii na jasnych arkuszach 32 i mogą być odpowiednie dla przedstawionej przez nas metody. Nie zalecamy jednak metylocelulozy i 0,1% agarozy, ponieważ wymagają one zamontowania próbki na dnie komory ze względu na brak krzepnięcia tych mediów. Z naszego doświadczenia wynika, że bardzo wysokie stężenia metylocelulozy będą ponadto generować kieszenie powietrzne, które mogą zakłócać procedurę obrazowania. Jeśli te media są preferowane przy użyciu dolnej komory, ważne jest, aby zapewniona była odpowiednia odległość robocza między soczewką obiektywu a preparatem. Należy zauważyć, że metyloceluloza jako podłoże montażowe jest zalecana tylko przez okres do 1 dnia, ponieważ może wpływać na zdrowie larw 32.

Zamontowanie próbki w pokrywie może spowodować powolny dryf grawitacyjny w dół. Dlatego zaleca się obrazowanie wielu sekcji w każdym punkcie czasowym, które mogą być rzutowane na jedną płaszczyznę lub tylko obrazy znajdujące się w płaszczyźnie ogniskowej mogą być wyodrębnione w celu złożenia końcowego filmu. Obrazowanie próbki w dolnej komorze może być alternatywną metodologią pozwalającą uniknąć potencjalnego dryfu w dół. Skrzepy plazmowe mogą być przydatne w celu uniknięcia dryfu, ponieważ plazma przykleja się do zewnętrznej warstwy otaczającej (EVL, peryderma) 31 , a zatem może stabilizować próbkę. To jednak musi zostać przetestowane, a także to, jak długo larwy danio pręgowanego mogą być utrzymywane w skrzepach osocza bez ingerencji w zdrowie larw lub regenerację płetw.

Nasz film został zmontowany przy użyciu pojedynczych sekcji (26 μm) zarejestrowanego stosu z, który obejmował pełną grubość żeberka (~10 μm) i który uwzględniał potencjalny dryf z-żeberka podczas procedury obrazowania. Aby zachować informacje 3D, możliwe jest również rzutowanie stosów z na pojedyncze obrazy. Ponieważ może to spowodować rozmycie obrazu, może być pożądana dekonwolucja w jasnym polu. Do tego celu można wykorzystać oprogramowanie, takie jak Deconvolve lub Autoquant X3. Alternatywnie, algorytmy matematyczne (opisane w Tadrous33) mogą być zastosowane do uzyskania funkcji rozrzutu punktowego o wysokim stosunku sygnału do szumu (SNR). Uzyskanie wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR) stanowi jedną z głównych przeszkód w dekonwolucji jasnego pola. Chociaż metoda ta wymaga wysokiego kontrastu i cienkiej grubości próbki, byłaby odpowiednia do obrazowania płetwy ogonowej ze względu na jej zmniejszoną szerokość.

Niewątpliwą zaletą prezentowanej metody obrazowania jest to, że można ją szybko dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie poklatkowe oraz stanowi tanią alternatywę dla droższych systemów obrazowania konfokalnego. Chociaż metoda ta nie wykorzystuje fluorescencji do wykrywania komórek, można ją rozszerzyć o takie zastosowania, wykorzystując zautomatyzowany system sterowania migawką i oprogramowanie do dekonwolucji po obrazowaniu 34. Umożliwiłoby to użytkownikom dalszą obserwację procesów gojenia i regeneracji ran z rozdzielczością jednokomórkową lub subkomórkową w dłuższych okresach czasu.

Przejrzystość optyczna i łatwość, z jaką można obchodzić się z embrionalnymi i larwalnymi danio pręgowanymi, a także możliwość dostosowania tej metody do dowolnego mikroskopu stereoskopowego sprawiają, że nadaje się ona do nauczania podstawowej biologii kręgowców w klasie. Metoda ta może zapewnić uczniom lepsze zrozumienie podstawowych procesów biologicznych leżących u podstaw naprawy i regeneracji tkanek. Inne procesy biologiczne, które zostały uchwycone za pomocą podobnej metody, to rozwój embrionalny danio pręgowanego 23,34 i funkcja serca (niepublikowana). Metoda ta daje również możliwość monitorowania gojenia się i regeneracji ran u larw, które zostały poddane manipulacji genetycznej i farmakologicznej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Laboratorium Biologicznemu MDI za utrzymanie ryb pręgowanych. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Institutional Development Awards (IDeA) z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantów o numerach P20GM104318 (dla COBRE) i P20GM103423 (INBRE) oraz grantu Departamentu Obrony – USAMRAA (W81XWH-BAA-1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Bullseye AgarozaMidSciBE-GCA500
Agaroza niskotopliwaFisher BioReagentsBP1360-100
1-fenylo-2-tiomocznikAlfa AesarL06690
Instant Ocean Aquarium SaltSklep zoologiczny
Błękit metylenowy (0,1% roztwór)SigmaM9140
Trikaina (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu)Sigma-AldrichE10505
2-fenoksyetanolSigma-Aldrich77699
szalka Petriego 35 x 15 mmBD Falcon351008
szalka Petriego 60 x 15 mmBD Falcon351007
szalka Petriego 100 x 25 mmBD Falcon351013
Pipety ze szkła boroschillate 5,75 calaFisher
35 mm Szklana górna szklana miska dolna (szkło: 0,085-0,115 mm)MatTek CorporationD35-20-0-TOP
Szkiełka mikroskopowe Superfrost/PlusFisherbrand12-550-15
Szkiełka nakrywkowe szklaneUsługi mikroskopii elektronowej72191-75
Szkiełka nakrywkoweWarner InstrumentsCS-18R15
Phifer Phiferglass Siatka przeciw owadom Węgiel drzewny - 48 "Home Depot
Smar wysokopróżniowyDow Corning
Microloader końcówki do pipet 20 i mikro; lEppendorf930001007
Fine Scissors - ostro wygiętenarzędzia naukowe14037-10
3 ml Luer-Lok™ jednorazowa strzykawka BD309657
60 ml Luer-Lok™ jednorazowa strzykawkaIgły do
23 GBD305145
Dumont #5 KleszczeNarzędzia do nauki11295-00
Equipment
LabDoctor Mini sucha kąpielMidSci
Discovery.V12 Mikroskop złożony Obiektyw Zeiss
Plan Apo S 3.5XZeiss
AxioCam MRm Oprogramowanie Zeiss
Axiovision, wydanie 4.8.2SP1 (12-2011)Zeiss
strzykawek BD 309653

Bibliografia

  1. San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115(2007).
  2. Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
  3. Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
  4. Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
  5. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  6. Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
  7. Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
  8. Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
  9. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  10. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
  11. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
  12. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  13. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
  14. Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
  15. Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
  16. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
  17. Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
  18. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
  19. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
  20. Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , reprint, Oxford University Press. 303(2002).
  21. The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).
  22. Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
  23. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  24. Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
  26. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  28. Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766(2012).
  29. Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  30. Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240(2009).
  31. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
  32. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  33. Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
  34. Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regeneracja p etwy ogonowejobrazowanie time lapsegojenie ranamputacja p etwyanaliza obrazustereomikroskopiarozw j larwalny

Powiązane artykuły