Artykuł metodologiczny

Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

DOI:

10.3791/52801

⸱

20 czerwca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cells & Cancer Group, Molecular Pathology Program, Spanish National Cancer Research Center, 2Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona), 3Center for Stem Cells in Cancer & Ageing, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste raka trzustki (CSC) mogą być namnażane in vitro za pomocą techniki hodowli sferycznej niezależnej od zakotwiczenia, która stanowi potężne narzędzie do badania biologii CSC i może służyć jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na CSC. W tym miejscu przedstawiono metodologię rozszerzania, analizowania i celowania w CSC trzustki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) zawiera podzbiór wyłącznie rakotwórczych komórek macierzystych raka (CSC), które, jak wykazano, napędzają inicjację nowotworu, przerzuty i odporność na radio- i chemioterapię. W tym miejscu opisujemy specyficzną metodologię hodowli pierwotnych CSC ludzkiej trzustki jako kul nowotworowych w warunkach niezależnych od zakotwiczenia. Komórki są hodowane w warunkach pozbawionych surowicy, nieprzylegających, w celu wzbogacenia w CSC, podczas gdy ich bardziej zróżnicowane potomstwo nie przeżywa i nie namnaża się w początkowej fazie po wysiewie pojedynczych komórek. Test ten można wykorzystać do oszacowania procentu CSC obecnych w populacji komórek nowotworowych. Zarówno wielkość (która może wynosić od 35 do 250 mikrometrów), jak i liczba utworzonych kulek nowotworowych reprezentują aktywność CSC ukrytą w masowych populacjach hodowanych komórek rakowych lub świeżo zebranych i strawionych guzach 1,2. Korzystając z tego testu, odkryliśmy niedawno, że metformina selektywnie abluje CSC trzustki; Odkrycie to zostało następnie potwierdzone poprzez wykazanie zmniejszonej ekspresji genów/markerów powierzchniowych związanych z pluripotencją oraz zmniejszonej rakotwórczości in vivo komórek leczonych metforminą. Ostatnim krokiem w rozwoju przedklinicznym było leczenie myszy z ustalonymi nowotworami za pomocą metforminy i stwierdzono znacznie wydłużone przeżycie. Obecnie trwają badania kliniczne oceniające stosowanie metforminy u pacjentów z PDAC (np. NCT01210911, NCT01167738 i NCT01488552). Mechanistycznie odkryliśmy, że metformina wywołuje śmiertelny kryzys energetyczny w CSC poprzez zwiększenie produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) i zmniejszenie potencjału transbłonowego mitochondriów. W przeciwieństwie do tego, nie-CSC nie były eliminowane przez leczenie metforminą, ale raczej ulegały odwracalnemu zatrzymaniu cyklu komórkowego. Dlatego nasze badanie służy jako udany przykład potencjału tworzenia sfer in vitro jako narzędzia przesiewowego do identyfikacji związków, które potencjalnie celują w CSC, ale technika ta będzie wymagała dalszej walidacji in vitro i in vivo w celu wyeliminowania fałszywych odkryć.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej agresywnych guzów litych. Jest to obecnie 4. najczęstszy zgon związany z rakiem w społeczeństwie zachodnim i przewiduje się, że w ciągu następnej dekady wzrośnie do 2. najczęstszej przyczyny (~400 000 zgonów rocznie na całym świecie) 3. W momencie rozpoznania u 90% pacjentów występuje zaawansowana choroba, której 5-letnie przeżycie wynosi mniej niż 5%. Wskaźnik przeżywalności pozostał niestety niezmieniony w ciągu ostatnich 50 lat, pomimo coraz intensywniejszych działań badawczych 4. Z pozostałych 10% pacjentów, u których choroba jest potencjalnie "uleczalna" poprzez resekcję chirurgiczną, 80% umrze z powodu nawrotu w ciągu 5 lat. Przez wiele lat standardem opieki nad pacjentami z zaawansowaną chorobą była monoterapia gemcytabiną, ale daje to jedynie marginalną przewagę w zakresie przeżycia5. Niewielką poprawę przeżycia krótkoterminowego osiągnięto po dodaniu erlotynibu 6 lub kapecytabiny 7, jednak korzyść w zakresie przeżycia jest rzędu tygodni, przy czym mediana przeżycia całkowitego nadal wynosi ~ 6 miesięcy. Ostatnio pojawiły się bardziej zachęcające wyniki dla gemcytabiny/nab-paklitakselu 8 i schematu skojarzonego FOLFIRINOX 9,10. Terapie te poprawiają medianę przeżycia odpowiednio o skromne 2 i 4 miesiące, ale są wysoce toksyczne, a osoby, które przeżyły przez długi czas, są nadal rzadkim wyjątkiem. Chociaż leczenie oferuje możliwość poprawy, są to toksyczne schematy, na które wielu pacjentów nie reaguje lub wykazuje jedynie stopniową poprawę całkowitego przeżycia. W związku z tym istnieje pilna potrzeba uzupełnienia obecnych terapii i opracowania nowatorskich, najprawdopodobniej multimodalnych podejść terapeutycznych.

Niejednorodność guza

Staje się coraz bardziej oczywiste, że heterogeniczność nowotworów nie ogranicza się tylko do odrębnych ewolucyjnych subklonów w obrębie każdego guza 11, ale także wynika z fenotypowej i funkcjonalnej heterogeniczności i plastyczności w obrębie każdego subklonu 12. Tak zwane rakowe komórki macierzyste (CSC) lub komórki promujące nowotwór są odpowiedzialne za heterogeniczność wewnątrzczaszkową 13-16. W szczególności CSC reprezentują podzbiór komórek rakowych, dla których my i inni dostarczyliśmy rozstrzygających dowodów, aż do pojedynczej komórki, że reprezentują one korzeń choroby, powodując powstanie wszystkich zróżnicowanych progenii w każdym subklonie raka 17. Co ważniejsze, komórki te są niezbędne do zachowania przerzutowego, a także stanowią ważne źródło nawrotu choroby po leczeniu, nawet przy stosunkowo skutecznych lekach zdolnych do wywołania początkowej regresji guza (np. nab-paklitaksel) 15,18-20. Należy zauważyć, że CSC niekoniecznie reprezentują komórki macierzyste w dobrej wierze, ani w wielu przypadkach nie powstają z tkankowych komórek macierzystych, ale raczej nabyły pewne cechy komórek macierzystych. Większość z nich jest zdefiniowana funkcjonalnie, na przykład CSC są wyposażone w nieograniczoną zdolność do samoodnawiania, co czyni je odpornymi na konwencjonalną chemioterapię i wykazują zwiększoną inwazyjność, co sprzyja aktywności przerzutowej.

Funkcjonalne fenotypy komórek macierzystych raka

Funkcjonalny fenotyp CSC opiera się na ich zdolności do samoodnawiania się, co można przetestować in vitro za pomocą testów tworzenia szeregowych kulek i tworzenia kolonii. Co ważniejsze, CSC zdolne do samoodnawiania się wykazują rakotwórczą aktywność in vivo, którą można przetestować, ograniczając rozcieńczanie w testach in vivo jako ostateczny odczyt funkcjonalny, najlepiej podczas seryjnego przeszczepu, co wskazuje na wyłączną długoterminową rakotwórczościę. Ponadto w obrębie kompartmentu CSC występuje niejednorodność, przy czym wyraźna subpopulacja CSC ma wyłączną zdolność do powodowania przerzutów, co nie jest jedynie bezpośrednią konsekwencją ich wyłącznej rakotwórczości in vivo. Rzeczywiście, przerzutowe CSC nabywają zdolność unikania guza pierwotnego, przeżywania anoikis i ostatecznie translokacji i zasiewania miejsc wtórnych. Te zaawansowane zdolności funkcjonalne można testować in vitro przy użyciu zmodyfikowanych testów inwazji oraz in vivo przy użyciu testów przerzutów.

Celowanie w rakowe komórki macierzyste

My i inni dostarczyliśmy przekonujących dowodów, że terapie skupiające się na guzie o dużej objętości zróżnicowanych komórek PDAC, nawet w połączeniu ze środkami celującymi w zręb, nie mają większego wpływu na progresję guza i późniejsze wyniki, chyba że są połączone ze strategią ukierunkowaną na CSC 21,22. W związku z tym, w oparciu o kluczowe funkcje CSC w progresji choroby i oporności na terapię, komórki te powinny stanowić niezbędny składnik każdego nowego podejścia do leczenia 18,20, ale będą wymagały znacznie dokładniejszego zrozumienia mechanizmu regulacyjnego CSC. Chociaż CSC i ich bardziej zróżnicowane potomstwo mają identyczne genetyczne stany podstawowe w odniesieniu do zmian genetycznych, CSC wykazują odrębne, a tym samym epigenetycznie określone profile ekspresji genów, które dzielą moduły z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Większość genów zaangażowanych w wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Nanog, Oct3/4, Klf4, Sox2) nie tylko została powiązana z rakiem, ale ich ekspresja jest w większości ograniczona do przedziału CSC. Co więcej, funkcjonalne znaczenie CSC poprzez eksperymenty z utratą funkcji z wykorzystaniem narzędzi genetycznych do celowania w CSC ugruntowało obecnie koncepcję CSC dla kilku typów nowotworów 23-25. Chociaż większość z tych podejść opiera się na modelach mysich, a zatem nie można ich łatwo przenieść do praktyki klinicznej, dostarczają one dowodu na potencjalne znaczenie kliniczne celowania w CSC w połączeniu z masowymi komórkami nowotworowymi.

Badanie komórek macierzystych raka in vitro w celu zidentyfikowania ich pięty achillesowej

W celu zidentyfikowania nowych i klinicznie stosowanych sposobów celowania w CSC, ich cechy są regularnie badane in vitro, a tworzenie kul jest szeroko stosowane w tym kontekście. Pierwotnie opracowany do badania prawidłowej biologii komórek macierzystych, w tym zdolności do samoodnawiania się i różnicowania, test ten został później zaadaptowany do badania CSC in vitro i został wykorzystany do badania CSC wyizolowanych z PDAC 20. Odkryliśmy, że sfery nowotworowe utworzone z pierwotnych ludzkich komórek PDAC mają wszystkie wyraźne cechy CSC, co wskazuje, że zawierają CSC trzustki w dobrej wierze 21. W związku z tym test sfery nowotworowej stanowi potężne narzędzie do badań przesiewowych w celu uzyskania bardziej skutecznych terapii in vitro, ale wyniki muszą być dalej oceniane w bardziej rygorystycznych testach in vivo. Rzeczywiście, dane uzyskane za pomocą tego testu in vitro należy traktować z dużą ostrożnością, ponieważ test może być obarczony znacznym błędem. Należy ustanowić wysoce ustandaryzowane protokoły, w tym automatyczne zliczanie uformowanych kulek, aby zapewnić powtarzalne i predykcyjne dane.

W tym kontekście, niedawno użyliśmy tego testu do badania przesiewowego CSC trzustki pochodzących z różnorodnego zestawu pierwotnych ludzkich PDAC i wykazaliśmy, że te komórki są bardzo podatne na przeprogramowanie metaboliczne przez przeciwcukrzycowy związek metforminę. Wcześniej wykazano, że metformina hamuje ekspansję komórek rakowych poprzez pośrednią aktywację sygnalizacji kinazy białkowej aktywowanej przez AMP (AMPK), a następnie hamowanie mTOR 26, co skutkuje zmniejszoną syntezą białek i proliferacją komórek 27. Oprócz tych skutków dla populacji guzów masowych, my i inni odkryliśmy, że metformina jest w stanie celować i faktycznie eliminować subpopulację CSCs w wielu guzach litych, takich jak rak piersi, rak przełyku, glejak i rak trzustki 28-31. Metformina stanowi zatem obiecującą i bezpieczną nową strategię terapeutyczną dla kilku nowotworów, których potrzeby medyczne są obecnie niezaspokojone. Co więcej, wykorzystując tworzenie kulek jako sposób na wzbogacenie CSC, wykazaliśmy, że główny wpływ metforminy na CSC trzustki był niezależny od aktywacji AMPK i opierał się głównie na jej umiarkowanej toksyczności mitochondrialnej (poprzez hamowanie kompleksu I), która najwyraźniej była śmiertelna tylko dla podgrupy CSC. W przypadku tych ostatnich byliśmy w stanie ocenić ich komórkowe zużycie tlenu i mitochondrialną produkcję ROS jako wskaźniki toksyczności leku na poziomie komórkowym. Następnie te dane in vitro mogły zostać zweryfikowane w przedklinicznych modelach mysich i rzeczywiście doprowadziły do znacznego wydłużenia przeżycia 31. Przedstawiona w niniejszym artykule metodologia pozwala na szybkie generowanie profili wrażliwości na leki CSC, w tym badań nad ich wpływem na metabolizm CSC. Udostępniamy teraz rozszerzone szczegóły eksperymentalne na temat stosowanych komplementarnych procedur in vitro i in vivo.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie guzy PDAC uzyskano za pisemną świadomą zgodą (Comunidad de Madrid, Hiszpania (C.P. CNIO-CTC-11 - C.I. 11/103-E). Wszczepianie ludzkich guzów trzustki myszom z niedoborem odporności wymaga zgody Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC). Procedury ksenoprzeszczepu mysich modeli guza trzustki muszą być przeprowadzane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i krajowymi (tutaj Komisja Etyki Instituto de Salud Carlos III; Madryt, Hiszpania; Protokół PA 34_2012).

1. Pożywki hodowlane

  1. Przygotować kompletne podłoże.
    1. Uzupełnij pożywkę RPMI o 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny. Na 500 ml RPMI dodać 55 ml inaktywowanego termicznie FBS i 6 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 U/ml, 100X).
    2. Przechowywać całe podłoże w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj pożywkę CSC.
    1. Uzupełnij bezsurowicową pożywkę DMEM/F12 o 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM glutaminy.
    2. Przechowywać pożywkę CSC w temperaturze 4 °C. B27 (1:50) i 20 ng/ml bFGF są świeżo dodawane do pożywki przed każdym doświadczeniem.
      UWAGA: Wykazano, że dodanie witaminy B27 zwiększa tworzenie się sfery guza i podtrzymuje kilka pasaży kultur sferycznych 32. Skład pożywki jest kluczowym krokiem i musi być testowany dla każdego typu komórek w hodowli. Zalecamy przetestowanie zdolności kulek do samoodnawiania się i różnicowania oraz analizę ekspresji markerów CSC za pomocą cytometrii przepływowej (tj. CD133+ i CD44+).
  3. Przygotować pożywkę do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego.
    1. To specyficzne podłoże to podstawowy DMEM 5030 zawierający witaminy, aminokwasy i inne suplementy, ale pozbawiony glutaminy, glukozy, pirogronianu i wodorowęglanu.
    2. W obecnym teście należy uzupełnić pożywkę o 2 mM glutaminy, 8 mM glukozy i 2 mM pirogronianu sodu, aby uzyskać pełną mitochondrialną aktywność metaboliczną.
      UWAGA: Brak wodorowęglanu sodu jest niezbędny do dokładnego pomiaru zewnątrzkomórkowego zakwaszenia komórek rosnących w hodowli, ponieważ zwykła pożywka zawierająca wodorowęglan będzie buforować zmiany pH podczas testu. Ponadto zastosowanie podłoża podstawowego pozwala na ścisłą kontrolę stężenia L-glutaminy (jako L-alanyloglutaminy), glukozy lub pirogronianu sodu niezbędnego w różnych warunkach i/lub zastosowaniach.

2. Test i analiza formowania kul

UWAGA: Wszystkie protokoły hodowli tkankowej i manipulacje muszą być wykonywane przy użyciu sterylnych technik z dużą uwagą, przy użyciu czystego, wolnego od detergentów, sterylnego szkła. Przed użyciem podgrzej wszystkie podłoża i roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (alternatywnie można użyć podłoża i roztworów podgrzanych w temperaturze pokojowej). Uzyskaj ludzkie guzy PDAC, jak opisano wcześniej 21.

  1. Izolacja CSC od ludzkiego PDAC (ryc. 1)
    1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś ludzką tkankę PDAC do naczynia hodowlanego o wymiarach 60 x 15 mm zawierającego 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS). Zmiel guz na małe kawałki (1 - 5 mm) za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy.
    2. Dodaj 1 ml sterylnego 1X PBS do naczynia hodowlanego i powtarzaj etap rozcierania, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana, zwykle wymaga to 3-4 rund. Przenieść zawiesinę tkankową (uzupełnić do końcowej objętości 5 ml za pomocą 1X PBS) do sterylnej probówki i mechanicznie homogenizować za pomocą dysocjatora, takiego jak gentleMACS.
    3. Inkubować homogenizowaną tkankę z kolagenazą (użyć 2,5 mg/ml kolagenazy w 1X PBS) przez 60 minut w temperaturze 37 °C, a następnie wirować przez 5 minut przy 900 x g. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml kompletnej pożywki. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 40 μm i odwirować przez 5 minut przy 900 x g.
    4. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad z 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (chlorek amonu i potasu, ACK), a następnie inkubować
    5. Zawiesić osad w podłożu CSC, ułożyć go na naczyniu pokrytym żelatyną i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Ten krok usunie większość komórek fibroblastów, które szybko przyczepiają się do płytki.
    6. Wyjąć płytkę z inkubatora i ostrożnie odzyskać zawiesinę komórek oraz określić ilościowo liczbę żywotnych (trypanowo-niebieskoujemnych) komórek za pomocą hemocytometru. W tym celu delikatnie wymieszać zawiesinę i odpipetować 20 μl zawiesiny do probówki Eppendorfa. Dodać 20 μl (stosunek 1:1) błękitu trypanowego do komórek w probówce do mikrowirówki i dobrze wymieszać. Pobrać pipetą około 10 μl mieszaniny na hemocytometr.
    7. Policz wszystkie czyste komórki w czterech rogach kwadrantów komory liczącej, aby zliczyć żywotne komórki. Uwaga: Żywotność i wydajność komórek mogą się znacznie różnić między próbkami guza. W przypadku próbek PDAC żywotność regularnie waha się między 45-70%, a fragmenty tkanki z makroskopowej próbki guza o średnicy 3 - 5 mm powinny dać około 5x106 żywotnych komórek.
  2. Test tworzenia kulek i leczenie metforminą
    1. Pobrać wymaganą liczbę komórek i dodać odpowiednią objętość pożywki CSC, aby uzyskać stężenie komórek 2 000 komórek/ml. Nie przechowywać zawiesiny komórek na lodzie nie dłużej niż 1 godzinę i dobrze wymieszać przed posiewem.
    2. Dodaj 500 μl 1X PBS do pierwszego i ostatniego rzędu 24-dołkowej płytki w celu nawilżenia, aby zminimalizować parowanie medium. Zasiej komórki na płytki komórek o bardzo niskim przyczepie o gęstości 2,000 komórek na studzienkę w 1 ml pożywki z kuli nowotworowej (2,000 komórek/ml).
      UWAGA: Liczba komórek używanych do testów tworzenia sfery nowotworowej może się różnić w zależności od typu guza.
    3. Poddać działaniu co najmniej 4 studzienki nośnik (kontrola ujemna) i 4 studzienki każdemu przydzielonemu zabiegowi, np. 3 mM metforminy. Umieścić komórki w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C i dostarczać do komórek 5% CO2 przez tydzień.
      UWAGA: Pożywki nie należy zmieniać, aby umożliwić niezakłócone tworzenie się kulek nowotworowych, ale można ją codziennie uzupełniać czynnikami wzrostu, ponieważ nie są one stabilne w pożywce hodowlanej.
    4. Co drugi dzień dodawać leczenie, np. 3 mM metforminy lub nośnika do każdej ze studzienek. Oceń liczbę utworzonych kul guza po 5 i/lub 7 dniach za pomocą automatycznego licznika komórek, który pozwala na zliczanie większych struktur (ryc. 2).
      UWAGA: Należy brać pod uwagę tylko sfery nowotworowe o wielkości co najmniej 40 μm, które można sklasyfikować odpowiednio jako małe (40 - 80 μm) lub duże (80 - 120 μm). Wyniki można zilustrować jako procent sfer nowotworowych podzielony przez początkową liczbę zasianych komórek (np. 2000 komórek).
  3. Seryjne pasażowanie kul nowotworowych pierwszej generacji
    1. Po 7 dniach inkubacji należy zebrać kule nowotworowe za pomocą sitka do komórek 40 μm i odwirować je przez 5 minut przy 900 x g w temperaturze pokojowej.
    2. Dysocjować osad sfer nowotworowych na pojedyncze komórki za pomocą trypsyny, a następnie ponownie rozprężyć otrzymaną zawiesinę komórek jednokomórkowych przez kolejne 7 dni, jak opisano powyżej (patrz 2.2).

3. Analiza metabolizmu (produkcja ROS i zużycie tlenu)

  1. Produkcja ROS
    1. W tym protokole użyliśmy karboksy-DCFDA jako przykładu do pomiaru produkcji ROS, ponieważ jest to niedroga, szybka i szeroko stosowana sonda do wykrywania ROS. Istnieje jednak kilka innych sond i metodologii, które można wykorzystać do tego testu.
    2. Kule nowotworowe należy leczyć metforminą zgodnie z opisem w punkcie 2.2 przez wyznaczony czas. Pod koniec leczenia należy pobrać kule nowotworowe za pomocą sitka do komórek o wielkości 40 μm, odwirować komórki przy 900 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 1 ml trypsyny. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Po wyizolowaniu komórek odwirować przy 900 x g i ponownie zawiesić komórki w HBSS zawierającym 2,5 μM karboksy-DCFDA. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
    4. Przed analizą cytometrii przepływowej należy chronić barwione komórki przed światłem, ponieważ karboksy-DCFDA może być fotooksydowany, dając fałszywie dodatnie wyniki. Umieść probówki na lodzie do czasu analizy.
      UWAGA: karboksy-DCFDA jest fluorescencyjny po reakcji z różnymi reaktywnymi formami tlenu i azotu, wykrywany w FL1 (np. 488nm, em. 520nm).
  2. Pomiar zużycia tlenu
    1. W przypadku tego protokołu jako przykładu użyjemy systemu Extracellular Flux Analyzer firmy Seahorse Biosciences. Pokryj żądaną płytkę do hodowli komórkowej roztworem 22,4 μg/ml kleju komórkowego i tkankowego przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz studzienki wodą 2 - 3 razy przed wysiewem komórek.
    2. Pod koniec leczenia należy pobrać kule nowotworowe za pomocą sitka do komórek o wielkości 40 μm, odwirować komórki przy 900 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 1 ml trypsyny. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Płytki pojedyncze komórki na płytce do hodowli komórkowej o gęstości 30 000 komórek/dołek dla płytki 96-dołkowej (końcowa objętość: 150 μl). Ponownie zawiesić komórki w pożywce do oznaczania zużycia tlenu zawierającej 8 mM glukozy i 2 mM pirogronianu sodu.
    4. Odwirować komórki do dna studzienki przez wirowanie studzienek wirowo aż do osiągnięcia 100 x g, a następnie pozostawić wirówkę do zatrzymania się przy wyłączonym hamulcu. Odwróć orientację płytki i powtórz proces. Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C bez dodatku CO2 na 30 minut.
    5. W międzyczasie należy przygotować wkład do testu. Każda studzienka ma 4 różne wtryskiwacze do załadowania (25 μl/port):
      1. Port A: metformina. Aby uzyskać końcowe stężenie 3 mM w studzience, należy przygotować 8x roztwór (24 mM), ponieważ końcowa objętość będzie wynosić 175 μl po wstrzyknięciu portu A.
      2. Port B: metformina. Aby dodać 3 mM i uzyskać końcowe stężenie 6 mM w studzince, należy przygotować 9x roztwór (27 mM), ponieważ końcowa objętość będzie wynosić 200 μl po wstrzyknięciu portu B.
      3. Port C: metformina. Aby dodać 3 mM i uzyskać końcowe stężenie 9 mM w studzince, należy przygotować 10x roztwór (30 mM), ponieważ końcowa objętość będzie wynosić 225 μl po wstrzyknięciu portu C.
      4. Port D: rotenon 11 μM, w celu uzyskania 1 μM jako stężenia końcowego w studni (11x). Uwaga: rotenon całkowicie hamuje wszelką resztkową aktywność mitochondriów.
    6. Skalibruj wkład i załaduj płytkę do hodowli komórek. Wykonaj test ze standardowym protokołem mieszania i pomiaru.
    7. Obliczyć procent zahamowania całkowitego oddychania mitochondrialnego osiągnięty przez metforminę jako procent zahamowania uzyskany za pomocą rotenonu (ustalony jako 100%).

4. Model ksenoprzeszczepu dla ludzkiego raka trzustki u myszy z obniżoną odpornością

UWAGA: Zamów wystarczającą liczbę samic atymicznych nagich lub innych, bardziej obniżonych immunologicznie modeli myszy, takich jak NOD-SCID, SCID-Beige lub NSG do eksperymentów 33. Przed eksperymentem należy autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne i pozwolić im ostygnąć do temperatury RT przed użyciem. W przypadku guzów podskórnych użyliśmy co najmniej 4 myszy na stan z jednym guzem na bok, co daje w sumie 8 guzów.

  1. Przeszczep ksenoprzeszczepu
    1. Przygotuj fragmenty guza z próbek tkanki ludzkiego raka trzustki. Przenieś guz na szalkę Petriego i rozetnij tkankę na małe kawałki (o średnicy 2 mm, ~8 mm3) za pomocą skalpela i kleszczy do przytrzymania tkanki. Zanurz otrzymane kawałki w galaretowatym roztworze mieszaniny białek trzymanym na lodzie.
    2. Znieczulenie myszy za pomocą 1 - 3% izofluoranu lub innych środków znieczulających wziewnych lub iniekcyjnych.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek zabiegu chirurgicznego upewnij się, że myszy całkowicie straciły przytomność, stymulując skórę brzucha lub pakując je parą kleszczy odłamkowych. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.
    3. Gdy znieczulenie zacznie działać, przetrzyj plecy myszy środkiem antyseptycznym zawierającym etanol. Buprenorfinę (0,05 mg/kg m.c.) należy podawać przed zabiegiem chirurgicznym, aby zapewnić pooperacyjną analgezję.
    4. Podnieś skórę pleców za pomocą kleszczy, wykonaj nacięcie o długości 0,7 - 1,0 cm sterylnymi mikronożyczkami, a następnie tępo przygotuj małą kieszonkę podskórną, do której wprowadza się fragment tkanki raka trzustki pochodzącej od pacjenta (~8 mm3).
    5. Zamknij ranę za pomocą 1-2 zszywek do skóry. Usuń je po 7 dniach. Umieść myszy z powrotem w klatkach i trzymaj je na poduszce grzewczej lub pod lampą grzewczą, aż znów będą w pełni aktywne.
    6. Po implantacji guza monitoruj myszy co najmniej dwa razy w tygodniu pod kątem wzrostu guza i ogólnych objawów pojawiającej się zachorowalności, takich jak potargana sierść, zgarbiona postawa i bezruch.
    7. Gdy guzy osiągną średnią wielkość 200 mm3, myszy są losowo przydzielane do odpowiednich metod leczenia. Podawanie podłoża lub metforminy należy podawać codziennie we wstrzyknięciach dożylnych (150 mg/kg m.c.) lub w wodzie do picia (150 mg/kg m.c.) o porównywalnych efektach leczenia.
    8. Monitoruj obciążenie guza za pomocą suwmiarki i obliczaj objętość guza raz w tygodniu (pomiar objętości guza = 1/2 długości × oddechu × szerokości).
    9. Poświęć myszy, gdy guzy osiągną średnicę 1 cm lub myszy zaczną wykazywać jakiekolwiek oznaki silnego bólu lub choroby, jak określono powyżej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metformina selektywnie atakuje CSC trzustki

Najpierw zbadaliśmy funkcjonalny wpływ leczenia metforminą na zdolność CSC do samoodnawiania in vitro. W tym celu przeprowadziliśmy testy tworzenia kuli z wykorzystaniem pierwotnych komórek ludzkiego raka trzustki wyizolowanych z tkanek PDAC wyciętych podczas operacji. Zaobserwowaliśmy, że metformina znacznie zmniejszała rozmiar formowanych kulek (ryc. 1A). Było to najprawdopodobniej poprzez zahamowanie ekspansji potomstwa CSC, które nadal stanowi większość komórek znajdujących się w kulach, ponieważ są one wzbogacone tylko o CSC. Rzeczywiście, im dłuższe sfery są hodowane bez przechodzenia, tym bardziej rozległa będzie ekspansja bardziej zróżnicowanych przodków. W związku z tym stwierdziliśmy, że metformina znacznie zmniejsza liczbę faktycznie utworzonych kulek, niezależnie od ich wielkości, występując w sposób zależny od dawki, co sugeruje silne hamowanie zdolności samoodnawiania się CSC (dane nie pokazane). Odkryliśmy, że metformina w stężeniu 3 mM znacznie zmniejszyła liczbę tworzonych kulek (Figura 1B). W celu bardziej rygorystycznego zbadania długoterminowego wpływu metforminy na zdolność samoodnawiania się CSC, następnie przeszliśmy uformowane sfery pierwotne do sfer drugorzędowych i trzeciorzędowych. Chociaż metforminą leczono tylko sfery pierwotne, tworzenie się kulek w drugim i trzecim pasażu było drastycznie i coraz bardziej zmniejszone, co sugeruje, że leczenie metforminą rzeczywiście nieodwracalnie wyeliminowało większość CSC (Figura 1C). W związku z tym nasze dane wykazały znaczący wpływ leczenia metforminą na zdolność do samoodnawiania się pierwotnych CSC trzustki, a tym samym zachęciły nas do przeprowadzenia dalszych badań mechanistycznych, a także in vivo.

Metformina hamuje zużycie tlenu w mitochondriach i indukuje produkcję ROS

Ponieważ wykazano, że metformina działa jak trucizna mitochondrialna poprzez częściowe hamowanie aktywności kompleksu I, następnie zbadaliśmy ostry wpływ metforminy na zużycie tlenu przez komórki komórkowe w komórkach pochodzących z kuli. W tym celu wybraliśmy komórki pochodzące z dwóch reprezentatywnych pierwotnych guzów PDAC i zmierzyliśmy zużycie tlenu w czasie po sekwencyjnym wstrzyknięciu 3 mM metforminy (trzy wstrzyknięcia) i 1 μM rotenonu (jedno wstrzyknięcie). Jak pokazano na rycinie 2A, wstrzyknięcie metforminy spowodowało szybki i zależny od dawki spadek zużycia tlenu, który różnił się znacznie w zależności od różnych nowotworów. Obliczyliśmy resztkową aktywność mitochondriów po leczeniu metforminą, wstrzykując rotenon, silny inhibitor kompleksu I, który jest w stanie całkowicie zahamować zużycie tlenu w mitochondriach. Wrażliwość na metforminę pod względem zużycia tlenu w mitochondriach korelowała z jej zdolnością do indukowania produkcji ROS zdefiniowanej jako przemieszczenie średniej populacji po leczeniu metforminą (ryc. 2B, lewy panel), co można łatwo określić ilościowo (ryc. 2B, prawy panel). Zgodnie z oczekiwaniami, komórki pierwotne, które były najbardziej wrażliwe na hamowanie zużycia tlenu, wykazały również najsilniejszy wzrost produkcji ROS po leczeniu metforminą. Tak więc te metaboliczne eksperymenty in vitro pokazują, że metformina celuje w CSC poprzez hamowanie ich zależności od funkcji mitochondriów, co skutkuje późniejszym wzrostem produkcji mitochondriów ROS i ostatecznie indukcją apoptozy.

Metformina hamuje postęp PDAC in vivo

W końcu zbadaliśmy efekty działania metforminy in vivo, używając ksenoprzeszczepów tkankowych pochodzących od różnych pacjentów z PDAC. Zaobserwowaliśmy znaczne zmniejszenie progresji guza u myszy leczonych metforminą w porównaniu z grupą kontrolną, ale guzy nigdy nie zniknęły całkowicie (ryc. 3). Następnie, podczas długotrwałej obserwacji, wszystkie nowotwory ostatecznie powróciły do nawrotu, co sugeruje oporność komórek na metforminę, które przeżyły wczesną fazę leczenia. Niemniej jednak leczenie metforminą, nawet gdy było stosowane w monoterapii, znacznie wydłużyło przeżycie u wszystkich myszy.

figure-results-1
Rysunek 1.Metformina selektywnie oddziałuje na CSC. (a) Metformina zmniejszyła rozmiar kulek. Reprezentatywne obrazy kulek uzyskane po leczeniu wskazanymi dawkami metforminy przez 7 dni (prawy panel). Kwantyfikacja wielkości kuli (n≥6) (lewy panel), wskazane liczby na osi odciętych reprezentują pojedynczy guz. (B) Zdolność do tworzenia kulek w obecności lub braku metforminy przez 7 dni (n≥6), liczby wskazane na osi odciętych reprezentują pojedynczy guz. (C) Reprezentatywny wykres zdolności samoodnawiania się CSC w sferach drugorzędowych i trzeciorzędowych komórek pierwotnego raka trzustki. Kule były traktowane tylko podczas formowania się sfery pierwszej generacji przez łącznie 7 dni (n = 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2.Leczenie metforminą hamuje zużycie tlenu i indukuje produkcję ROS. (A) Ponadto metformina hamuje zużycie tlenu (OCR) przez komórki pochodzące z kuli. Dwie różne sfery drugorzędowe PDAC potraktowano metforminą, a zmiany OCR mierzono za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Iniekcja rotenonu była stosowana jako kontrola całkowitego zużycia mitochondrialnego OCR. Oś X reprezentuje wskaźnik zużycia tlenu w pmol tlenu/godz. znormalizowany przez zawartość białka w każdym dołku. (B) Kulki PDAC używane w A traktowano metforminą przez 8 godzin, a produkcję ROS oceniano za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu karboksy-DCFDA. Po lewej, reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej. No właśnie, podsumowanie danych z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3.Metformina hamuje progresję PDAC in vivo. Dwie różne tkanki ksenoprzeszczepu PDAC wszczepiono myszom z obniżoną odpornością, a leczenie przydzielono po zweryfikowaniu początkowego pobrania guza. Myszy leczono metforminą (Met) dodawaną do wody pitnej (150 mg/kg masy ciała; na podstawie spożycia 5 ml wody dziennie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się i późniejszą walidacją koncepcji CSC dla wielu nowotworów, dziedzina opracowywania leków nabrała nowego rozpędu, z potencjałem do opracowania skuteczniejszych metod leczenia raka, a następnie zmniejszenia ryzyka nawrotu choroby. Jednak dziedzina CSC jest wciąż na wczesnym etapie i należy osiągnąć więcej w zakresie zrozumienia pochodzenia i propagacji CSC oraz ich roli w kształtowaniu architektury guza i promowaniu przerzutów.

W tym kontekście, zastosowanie powtarzalnych i miarodajnych testów CSC, jak również świadoma interpretacja uzyskanych danych stanowi kluczowy element pogłębienia naszego zrozumienia biologii CSC. Z wielu perspektyw biologicznych formowanie się sfer okazało się niezwykle cennym testem; Niemniej jednak użytkownicy powinni zdawać sobie sprawę z jego ograniczeń, aby prawidłowo zinterpretować swoje wyniki eksperymentalne. Ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę jeszcze przed oceną danych dotyczących tworzenia się sfer, jest pochodzenie badanej próbki, ponieważ wyniki uzyskane ze świeżych próbek pobranych od pacjentów mogą znacznie różnić się od tych uzyskanych z ustalonych linii komórek nowotworowych.

Klasyczne testy tworzenia kulek polegają na wysiewaniu komórek o gęstości klonalnej na płytkach o bardzo niskim przyczepie i ocenie tworzenia kulek w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i/lub podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (b-FGF) wzbogaconego, ale wolnego od surowicy 21,34. Ważną kwestią do rozważenia jest również skład pożywki hodowlanej. Z naszego doświadczenia wynika, że DMEM/F12 uzupełniony witaminą B27, bFGF i glutaminą przy braku surowicy był optymalnym podłożem do wzrostu, ekspansji i utrzymania CSC w niezróżnicowanych warunkach. Stwierdziliśmy, że w tych warunkach hodowli (pożywka i zawiesina) komórki wyrażają duże ilości markerów rakowych komórek macierzystych (w tym CD133 +, CD44 + i CD24 +) i nie wykazują ekspresji białek związanych z różnicowaniem (CK-20 i CK-19).

Jednym z podstawowych założeń tych testów jest to, że każda kula jest klonalna , tj. jedna sfera powstaje w wyniku ekspansji pojedynczej komórki macierzystej. Jednak kule są z natury dynamicznymi strukturami, które są podatne na łączenie się nawet przy niskiej gęstości wysiewu 35. Posiewanie komórek jest krytycznym krokiem w protokole, a gęstość jednej komórki/studzienki z pewnością może obejść problem agregacji. Ale nawet w przypadku prospektywnie posortowanych przodków regularnie powoduje to bardzo niskie tworzenie kul z powodu niskiej wewnętrznej aktywności tworzenia sfer i może być również przypisane ograniczonej stymulacji autokrynnej spowodowanej efektami rozcieńczenia. Z naszego doświadczenia wynika, że tylko 30% posianych komórek jest w stanie tworzyć kule. Zalecamy użycie co najmniej 100 komórek/studzienkę, aby uzyskać spójne i powtarzalne wyniki.

Inne metody hodowli CSC opierają się na stałych lub półstałych kulturach 3D (np. na bazie matrigelu, kolagenu lub metylocelulozy). Metody te zostały wykorzystane do ograniczenia mobilności komórek i późniejszej agregacji komórek 36. Jednak każda z tych matryc ma swoje ograniczenia. Na przykład matrigel jest rozpuszczalną błoną podstawną wyizolowaną z guza Engelbretha-Holma-Swana (EHS) i chociaż ekstrakt przypomina złożone zewnątrzkomórkowe środowisko nowotworowe znajdujące się w wielu tkankach, zawiera wiele mniej lub bardziej zdefiniowanych czynników wzrostu, co często sprawia, że badania mechanistyczne dla określonych elementów regulatorowych są bardzo trudne. Kolejną kwestią, którą należy rozważyć, jest to, że zdolność do tworzenia kul i funkcje komórek macierzystych nie są terminami zamiennymi 34. Podczas gdy wykazano, że niektóre komórki macierzyste i progenitorowe wykazują zdolność do tworzenia kul 37, brak generowania kulek in vitro nie wyklucza funkcji pnia/progenitora in vivo . Na przykład komórki macierzyste w stanie spoczynku mogą po prostu nie reagować na sygnały zewnątrzkomórkowe dostarczane przez wybrane warunki hodowli in vitro . W związku z tym należy ocenić długoterminową zdolność oczyszczonych populacji komórek do samoodnawiania się in vitro i in vivo , w szczególności podczas seryjnego pasażu, w celu udowodnienia lub obalenia funkcji komórek macierzystych. W tym kontekście zdolność do prospektywnego i jednoczesnego rozmnażania różnych populacji komórek macierzystych i progenitorowych jest kluczowym aspektem testu formowania kuli i czyni ten test bardzo cennym dla dziedziny CSC; o ile pamięta się o jego ograniczeniach przy interpretacji uzyskanych danych.

Testy formowania kul są szeroko stosowane do retrospektywnej identyfikacji komórek macierzystych na podstawie ich zdolności do samoodnawiania i różnicowania na poziomie pojedynczej komórki in vitro. Odkrycie markerów, które pozwalają na prospektywną izolację komórek macierzystych i ich potomstwa z ich niszy in vivo , pozwala na określenie właściwości funkcjonalnych oczyszczonych populacji. Połączenie testu tworzenia kuli i FACS jest skuteczną strategią izolowania komórek z tkanek stałych lub wzbogacania określonych subpopulacji PDAC w hodowli. Na przykład jednoczesna ekspresja EpCAM, CD24 i CD44 definiuje subpopulację CSC zdolnych do: samoodnowy, różnicowania i inicjowania guza, odzwierciedlając heterogeniczność pierwotnego guza. Hermann i wsp. wykazały, że komórki CD133 + miały zwiększoną zdolność proliferacyjną, a CSC ma cechy 15. Inne markery zostały również wykorzystane do scharakteryzowania CSC: ekspresja ALDH-1 (dehydrogenaza ALdehydowa-1) jest związana z wysoce rakotwórczymi komórkami w raku trzustki 38; Komórki zdolne do wykluczenia barwnika DNA Hoechst 33342, nazwane komórkami populacji bocznej (SP), mają udowodnioną zdolność do inicjowania nowotworów 39. Niedawno wykazaliśmy, że subkomórkowy przedział autofluorescencji charakteryzuje odrębną populację komórek ludzkich z wyjątkowymi cechami CSC w różnych typach nowotworów 40. Chociaż żaden z tych markerów nie wydaje się selektywnie charakteryzować czystej populacji CSC, coraz bardziej złożone kombinacje markerów muszą być stosowane do oczyszczania bardziej wyrafinowanych populacji komórek za pomocą FACS.

Nadal pozostaje wiele pytań dotyczących dokładnej roli CSC w powstawaniu, progresji i oporności nowotworów na leki. Na przykład, jednym ze sposobów rozwiązania kwestii ewolucji klonalnej w celu określenia, czy i w jaki sposób pojedynczy CSC inicjuje nowotwór, może być analiza próbek pacjentów na różnych etapach choroby, a w szczególności śledzenie liczby CSC w trakcie i po leczeniu. Odpowiadając na te pytania, możemy poczynić znaczący postęp w naszej wiedzy na temat CSC w guzach litych i opracować terapie lekowe, aby ostatecznie zapobiec progresji guza i nawrotom.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opłaty za otwarty dostęp zostały zapewnione przez Seahorse Bioscience

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne badania były wspierane przez ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233460), Siódmy Program Ramowy Wspólnoty Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 256974 (EPC-TM-NET) i nr 602783 (CAM-PaC), Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09/02129 & PI12/02643), oraz Programa Nacional de Internacionalización de la I+D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Hiszpania). E. Lonardo był wspierany przez Roche Fellowship. M. Cioffi otrzymał wsparcie w ramach programu stypendiów przeddoktoranckich La Caixa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora zliczająca/hemocytometr Hausser Scientific Co3200
CASY Licznik i analizator komórek do pomiaru proliferacji i żywotnościRoche InnovatisAG CASY Model TTC 45,60,150 μ m
Dysocjator GentleMACS Miltenyi Co130-093-235
Rurki GentleMACS C Miltenyi Co130-093-237
24-dołkowe płytki mocujące o bardzo niskim poziomie Corning3474
100-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych Sitko do komórek BD Falcon353803
 BD Falcon352350
Probówka stożkowa polipropylenowa 15 ml BD Falcon352097
50-ml polipropylenowa tuba stożkowa BD Falcon352070
Sterylne probówki 1,5 ml Eppendorf0030 120.086
Probówki wirówkowe 50 ml Corning430828
Sterylne szalki Petriego, szalki 10 cm Igły Corning353003
26 G BD Falcon300600
100 ul Strzykawka Hamilton Hamilton Strzykawka Co81075
Kolagenaza typ IV Technologie komórek macierzystych7909
RPMI Medium 1640 Life technologies11875-085
Penicylina/Streptomycyna roztwór 100X Technologie życioweSV30010
metformina SigmaD150959-5G
L-glutamina, 200 mM, 100X Technologie życiowe25030-081
D-Glukoza SigmaG8270
100mM roztwór pirogronianu sodu Technologie życiowe11360-070
Medium do oznaczania konika morskiego Seahorse Bioscience100965-000
BD Cell-TAK Klej do komórek i tkanek BD Biosciences354240
Roztwór trypsyny, 0,05% Technologie życiowe25300054
B27 Suplement 50x Technologie życiowe17504-044
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów SigmaF0291
Albumina surowicy bydlęcej SigmaA9576
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Średni/F12 SigmaD8437
Sterylne 1x Dulbecco' s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami SigmaD8537
Trypan Niebieski Technologie życiowe15250-061
Karboksyl-DCFDA(5-(i-6)-Karboksyl-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetan) Technologie życioweC-369
RotenonSigmaR8875
Etanol 70% (vol/vol) Sigma459844
IsofluoraneIsoVet, Braun571105.8
MatrigelBD Biosciences35620
Sterylny aplikator z bawełnianą końcówką  Puritan medical
XF96e FluxPak z płytkami komórkowymi, kalibrem i wkładamiSeahorse Bioscience102416-100
XF96e Zewnątrzkomórkowy analizator strumieniaSeahorse Bioscience Inkubator Seahorse Bioscience
z wejściem CO2 
Mikro
Zakrzywione kleszcze
Kleszcze
Suwmiarka
nożyczkido odłamków

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis. Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).
  2. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  3. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  4. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
  5. Burris, H. A. 3rd, et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).
  6. Moore, M. J., et al. Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).
  7. Cunningham, D., et al. Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer. J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).
  8. Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).
  9. Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).
  10. Gourgou-Bourgade, S., et al. Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial. J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).
  11. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  12. Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. Stem cells & pancreatic cancer. Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).
  13. Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives. Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).
  14. Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy. Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).
  15. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  16. Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).
  17. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  18. Gallmeier, E., et al. Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction. Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).
  19. Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. Cancer stem cells in solid tumors. Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).
  20. Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
  21. Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
  22. Li, C., et al. c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target. Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).
  23. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  24. Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
  25. Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
  26. Shaw, R. J., et al. The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin. Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).
  27. Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena. Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).
  28. Honjo, S., et al. Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer. Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).
  29. Wurth, R., et al. Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt. Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).
  30. Cufi, S., et al. Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts. Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).
  31. Lonardo, E., et al. Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells. PLoS One. 8 (10), e76518(2013).
  32. Gu, Y., et al. The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres. J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).
  33. Ishizawa, K., et al. Tumor-initiating cells are rare in many human tumors. Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).
  34. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  35. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
  36. Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).
  37. Seaberg, R. M., van der Kooy, D. Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors. J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).
  38. Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).
  39. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  40. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rakotw rcze kom rki macierzyste trzustkihodowla rakotw rczych kom rek macierzystychtworzenie sfer nowotworowychhodowla niezale na od pod o aleczenie metforminreaktywne formy tlenutest zu ycia tlenuanaliza cytometrycznaksenoprzeszczepy pochodz ce od pacjent wmarkery rakotw rczych kom rek macierzystych

Powiązane artykuły