Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Śródbłonek naczyniowy jest niezbędny do utrzymania prawidłowej homeostazy naczyń krwionośnych. Jego dysfunkcja uczestniczy w różnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. Mysz jest ważnym modelem w badaniach nad chorobami sercowo-naczyniowymi. Badanie to demonstruje prostą metodę izolowania i hodowli komórek śródbłonka z aorty myszy bez specjalnego sprzętu. Aby wyizolować komórki śródbłonka, aorta piersiowa jest szybko usuwana z ciała myszy, a przyczepiona tkanka tłuszczowa i tkanka łączna są usuwane z aorty. Aorta jest cięta na pierścienie o średnicy 1 mm. Każdy pierścień aorty jest otwierany i umieszczany na matrycy o obniżonym czynniku wzrostu ze śródbłonkiem skierowanym w dół. Segmenty są hodowane w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka przez około 4 dni. Kiełkowanie śródbłonka rozpoczyna się już w 2 dniu. Segmenty są następnie usuwane, a komórki są hodowane w sposób ciągły, aż osiągną zbieg. Komórki śródbłonka są zbierane przy użyciu neutralnej proteinazy i hodowane w pożywce wzrostu komórek śródbłonka przez kolejne dwa pasaże, zanim zostaną wykorzystane do eksperymentów. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że po drugim pasażu większość komórek była podwójnie dodatnia pod względem wychwytu Dil-ac-LDL, wiązania lektyny i barwienia CD31, typowych cech komórek śródbłonka. Sugeruje się, że komórki w pasażach od drugiego do trzeciego nadają się do eksperymentów in vitro i in vivo w celu zbadania biologii śródbłonka. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji określonych mechanizmów komórkowych i molekularnych w fizjopatologii komórek śródbłonka.
Wprowadzenie
Śródbłonek naczyniowy to nie tylko warstwa barierowa, która oddziela krew od tkanki, jest uważany za rozległy gruczoł dokrewny, który rozciąga się na całym drzewie naczyniowym o powierzchni 400 metrów kwadratowych1. Dobre samopoczucie śródbłonka jest niezbędne dla homeostazy naczyń krwionośnych. Dysfunkcyjny śródbłonek uczestniczy w różnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych, w tym miażdżycy, zapaleniu naczyń i urazach niedokrwiennych/reperfuzyjnych itp. 2-4. Do tej pory specyficzne mechanizmy komórkowe i molekularne związane z tymi chorobami nie są dobrze poznane ze względu na rozlany anatomiczny charakter śródbłonka.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Izolacja aorty od myszy
Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Wayne.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej aparatu do znieczulenia. Ustawić przepływ izofluranu na 4% w połączeniu z 25% świeżego powietrza i 75%O2. Znieczulić mysz poprzez inhalację izofluranu (4% do indukcji, ± 1,0% do konserwacji) w połączeniu z 25% świeżym powietrzem i 75%O2 przez komorę indukcyjną, a następnie dedykowany stożek nosowy. UWAGA: Znieczulenie izofluranem może być podawane w 75% tlenu/25% powietrza lub....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wypuszczanie wypustek przez komórki śródbłonka
Spontaniczne pączkowanie komórek śródbłonka rozpoczęte z segmentu aorty mysiej. Segment aorty mysiej inkubowano na macierzy z obniżoną zawartością czynników wzrostu, a następnie w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka przez 4 dni. Pączkowanie komórek śródbłonka pojawia się zazwyczaj w ciągu 2 – 4 dni. Mikrofotografie wykonano w 4. dniu (Rysunek 1). Jak pokazano na zdjęciach, liczne komórki śródbłonka migrują z seg.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to demonstruje prostą metodę izolowania i hodowli komórek śródbłonka z aorty myszy bez specjalnego sprzętu. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że większość komórek była komórkami śródbłonka po drugim pasażu. Sugeruje się, że komórki w okresie od drugiego do trzeciego pasażu nadają się do eksperymentów in vitro i in vivo w celu zbadania biologii śródbłonka.
Kluczowe uwagi zawarte w niniejszym Protokole
W procedurze je.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie jest wspierane przez American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 oraz National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). Dziękujemy Roberto Mendezowi z Wayne State University za pomoc w przygotowaniu manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4- lub 6-tygodniowe myszy | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Sterylne 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Sterylna 1x PBS zawierająca 1,000 U/ml heparyny | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (Dulbeccos' Zmodyfikowany orzeł" s Średni [DMEM] z 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], uzupełniony o 100 μ g/mL suplement na wzrost komórek śródbłonka z bydlęcej tkanki nerwowej [ECGS, Sigma, #2759], 10% płodowa surowica bydlęca [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparyny [Sigma Aldrich, H3149], 10 000 U/ml penicyliny i 10 mg / ml streptomycyna [Gibco, #15140-122]) | |||
| Matryca zredukowana czynnikiem wzrostu | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutralna proteinaza (Pipeza, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) i pożywka D-Val (D-walina, 0,034 g/L, Sigma, #1255), w Dulbeccos' Zmodyfikowany orzeł" s Średni, niski poziom glukozy (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylino-carbocyano-perchloran acetylowany LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| Znakowana FITC Ulex europaeus aglutynina (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Przeciwciało sprzężone anty-mysie CD31-FITC | BD Biosciences | 553372 | |
| Przeciwciało przeciw receptorowi 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyń myszy | Sygnalizacja komórkowa | 9698 | |
| Anty-mysia śródbłonek syntazy tlenku azotu | Abcam | ab5589 | |
| Anty-mysi śródbłonek naczyniowy-kadheryna | Abcam | 33168 | |
| Kalponina przeciw myszom | Abcam | 700 | |
| Strzykawka anty-królicza IgG | Sigma | F6005 | |
| ml wyposażona w igłę 25 G | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| Szalki Peri 100 mm | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Sześciodołkowe płytki do hodowli komórkowych | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 kolba | hodowlana Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Nożyczki, kleszcze, nożyczki i kleszcze do mikrodysekcji, ostrze skalpela | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Aparat anestezjologiczny z izofluranem | Webster Zasilanie weterynaryjne | 07-806-3204 | |
| lampa | |||
| Wirówka | |||
| odwróconym kontrastem fazowym | |||
| Odwrócony mikroskop |
Bibliografia
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
