Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53214

⸱

4 grudnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University School of Medicine, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum. Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Streszczenie

Odmiana genetyczna odpowiedzialna za allel sierpowatokrwinkowy (HbS) umożliwia erytrocytom odporność na zakażenie pasożytem malarii, P. falciparum. Molekularne podstawy tej oporności, o której wiadomo, że jest wieloczynnikowa, pozostają nie w pełni poznane. Ostatnie badania wykazały, że zróżnicowana ekspresja mikroRNA erytrocytów, po przemieszczeniu się w pasożyty malarii, wpływa zarówno na regulację genów, jak i wzrost pasożytów. Później wykazano, że te miRNA hamują translację mRNA poprzez tworzenie chimerycznego transkryptu RNA poprzez fuzję 5' RNA z dyskretnymi podzbiorami mRNA pasożytów. W tym miejscu szczegółowo omówione zostaną techniki, które zostały wykorzystane do zbadania funkcjonalnej roli i przypuszczalnego mechanizmu leżącego u podstaw mikroRNA erytrocytów w odniesieniu do regulacji genów i potencjału translacyjnego P. falciparum, w tym transfekcji zmodyfikowanych syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza. Wreszcie, metoda gradientu polisomów jest stosowana w celu określenia zakresu translacji tych transkryptów. Razem techniki te pozwoliły nam wykazać, że rozregulowane poziomy mikroRNA erytrocytów przyczyniają się do wewnętrznej odporności erytrocytów sierpowatych na malarię.

Wprowadzenie

Malaria, wywoływana przez pasożyty apicomplexan z rodzaju Plasmodium, jest najpowszechniejszą chorobą pasożytniczą człowieka, globalnie infekującą około 200 milionów ludzi każdego roku i powodującą około 600 000 zgonów1. Spośród pięciu gatunków Plasmodium, które zakażają ludzi, najbardziej istotnymi dla chorób u ludzi są P. falciparum i P. vivax, ze względu na ich szerokie rozmieszczenie i możliwość poważnych powikłań malarii. Cykl życiowy pasożyta malarii wymaga zakażenia zarówno komarów, jak i ludzi. Kiedy zakażony komar gryzie człowieka, pasożyty przemieszczają się przez krwiobieg do wątroby, gdzie następuje początkowa runda replikacji. Po oderwaniu się merozoitów od hepatocytów gospodarza infekują pobliskie czerwone krwinki, inicjując replikację bezpłciową lub płciową. Bezpłciowy etap replikacji, który trwa 48 godzin u P. falciparum, jest przedmiotem tego badania, ponieważ jest zarówno źródłem większości objawów malarii, jak i można go łatwo podsumować in vitro.

Podczas gdy wiele inicjatyw zdrowia publicznego, w tym ulepszone terapie przeciwmalaryczne, nieco zmniejszyło obciążenie malarią na całym świecie, ciągłe pojawianie się pasożytów opornych na leki stanowi problem dla wysiłków na rzecz kontroli malarii. Jednym z obszarów, który może sugerować nowe podejścia terapeutyczne, jest badanie nad tym, w jaki sposób różne warianty genetyczne nadają odporność na malarię. W regionach endemicznych malarii dość powszechne są różne polimorfizmy erytrocytarne2,3. Mutacje te, z niedokrwistością sierpowatokrwinkową jako prawdopodobnie najbardziej widoczną, są często związane ze znaczną odpornością na wystąpienie objawowego zakażenia malarią4. Podstawowe mechanizmy, dzięki którym powodują one odporność erytrocytów na zakażenie malarią, nie są w pełni poznane. Spasożytowane erytrocyty z mutacjami hemoglobiny podlegają zwiększonej fagocytozie poprzez zwiększoną sztywność komórek i odwodnienie, co wiąże się ze zmniejszoną inwazją P. falciparum5. Allel HbC wpływa również na ekspresję białka na powierzchni erytrocytów i wraz z przebudową cytoszkieletu, dodatkowo hamując rozwój pasożyta6,7. Wreszcie, P. falciparum słabo rośnie w homozygotycznych erytrocytach sierpowatych (HbSS)8,9 in vitro, co sugeruje wewnętrzne czynniki erytrocytarne oporności na malarię. Jednak, chociaż wszystkie te mechanizmy wydają się odgrywać pewną rolę, nie wyjaśniają one w pełni mechanizmów stojących za odpornością sierpowatokrwinkową na malarię.

Jednym z potencjalnych czynników erytrocytarnych, które pozostają słabo poznane, jest duża pula miRNA obecna w dojrzałych erytrocytach. MikroRNA to małe niekodujące RNA o wielkości 19-25 nt, które pośredniczą w translacji i / lub stabilności docelowych mRNA poprzez parowanie zasad w obrębie 3' UTR. Są one zaangażowane w kontrolę odpowiedzi immunologicznej ssaków, w tym w tłumienie replikacji wirusa10, i wykazano, że nadają odporność na wirusy u roślin Wykazano również, że regulują kilka procesów erytrocytarnych, w tym erytropoezę11,12 i metabolizm żelaza13. Wcześniejsze badania zidentyfikowały liczną i zróżnicowaną populację erytrocytarnych miRNA, których ekspresja była dramatycznie zmieniona w erytrocytach HbSS14,15. Ponieważ dojrzałe erytrocyty nie mają aktywnej transkrypcji i translacji, funkcjonalna rola tych miRNA erytrocytów pozostaje niejasna. Ponieważ znaczna wymiana materiału zachodzi między komórką gospodarza a P. falciparum podczas wewnątrzerytrocytarnego cyklu rozwojowego (IDC)16, spekulowano, że zmieniony profil miRNA w erytrocytach HbS może bezpośrednio przyczyniać się do wewnętrznej odporności komórek na malarię.

Te badania ostatecznie doprowadziły do opracowania procesu izolacji, identyfikacji i funkcjonalnego badania roli ludzkiego miRNA w pasożytze malarii, P. falciparum, co wykazało, że te miRNA gospodarza/człowieka ostatecznie kowalencyjnie łączą, a następnie translacyjnie tłumią transkrypty mRNA pasożyta17. Dostarczyło to przykładu pierwszych międzygatunkowych chimerycznych transkryptów utworzonych przez trans-splicing i sugeruje, że ta fuzja miRNA-mRNA może zachodzić u innych gatunków, w tym innych pasożytów. Wszystkie mRNA trypanosomów są transsplicing za pomocą lidera splicingu (SL) w celu regulacji separacji transkryptów policistronicznych18. Ponieważ P. falciparum nie ma ortologów dla Dicer/Ago19,20, możliwe jest, że miRNA erytrocytów przejmują podobną maszynerię SL u P. falciparum, aby zintegrować się z genami docelowymi. Ostatnie badania nad P. falciparum w rzeczywistości wykazały obecność sekwencji prowadzących 5' splicingu21. Badanie to szczegółowo opisuje metody, które doprowadziły do odkrycia transkryptów fuzji miRNA-mRNA człowiek-pasożyt, w tym zarówno techniki regulacji transkryptomicznej, jak i translacyjnej. Ogólnym celem tych metod jest zbadanie wpływu małych RNA na regulację genów, fenotypy i potencjał translacyjny transkryptów P. falciparum.

Początkowa identyfikacja chimerycznych transkryptów ludzko-pasożytniczych opierała się na użyciu technik analizy RNA, takich jak PCR w czasie rzeczywistym, sekwencjonowanie transkryptomu i przechwytywanie biblioteki EST, które obejmowały zarówno całkowite, jak i małe RNA, a nie na użyciu technik, które izolowały tylko małe RNA. Wyizolowanie całego RNA razem w jednej dużej puli, a nie osobno, pozwoliło na identyfikację zarówno translokowanych ludzkich małych RNA w pasożytze, jak i obecności tych małych sekwencji RNA jako części większej sekwencji. Wymagało to analizy stanu translacji tych mRNA fuzyjnych w celu określenia funkcjonalnych konsekwencji tych fuzji.

Podczas gdy szeroko zakrojone prace nad charakterystyką genomu i transkryptomu pasożyta przyczyniły się do lepszego zrozumienia biologii pasożyta22-25, znacznie mniej wiadomo o translacyjnej regulacji transkryptomu mRNA w całym cyklu życia P. falciparum26. Ta ograniczona wiedza na temat proteomu pasożyta utrudniła zarówno zrozumienie biologii pasożyta, jak i możliwość zidentyfikowania nowych celów dla następnej generacji leków przeciwmalarycznych. Ta luka w zrozumieniu biologii komórkowej pasożyta utrzymuje się głównie z powodu braku odpowiednich technik do badania regulacji translacyjnej u P. falciparum. Jedna z ostatnich prac opisywała zastosowanie śladu rybosomalnego P. falciparum do określenia globalnego statusu translacji21. Jednym z dobrze ugruntowanych pomiarów potencjału translacyjnego transkryptów jest liczba powiązanych rybosomów określona za pomocą profilowania polisomów. Jednakże, gdy technika ta jest stosowana do P. falciparum, nie jest w stanie odzyskać większości polisomów i wychwytuje głównie monosomy. Ostatnio kilka grup27,28 zoptymalizowało techniki polisomów P. falciparum poprzez jednoczesną lizę erytrocytów i pasożyta w celu zachowania polisomów i scharakteryzowania zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego tych pasożytów malarii podczas ich bezpłciowego rozwoju w krwinkach czerwonych gospodarza28.

Łącznie, te metody pokazują, że obserwowana fuzja ludzkich mRNA i pasożytniczych mRNA moduluje translację białek pasożytniczych tych fuzji mRNA, co zostało wykazane przy użyciu wcześniej opisanych metod27, i jest głównym wyznacznikiem odporności na malarię w erytrocytach HbAS i HbSS17. Metody te byłyby przydatne w każdym systemie, który chce identyfikować i funkcjonalnie badać zdarzenia splicingu RNA, niezależnie od tego, czy te fuzyjne RNA znajdują się w obrębie P. falciparum, czy innych systemów eukariotycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1: Izolacja małych rozmiarów RNA z P. falciparum podczas IDC

  1. Pozyskaj pasożyty malarii w kulturze bezpłciowej29.
    UWAGA: Wymagana wielkość kultury będzie się różnić w zależności od pożądanego zastosowania; jednak 10 ml hodowli przy 3-5% parazytemii i 5% hematokrycie zapewnia wystarczającą ilość RNA do PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (RT-PCR). Technika ta została początkowo zoptymalizowana pod kątem kultur asynchronicznych, ale gdy pożądane są określone punkty czasowe podczas cyklu infekcji, pasożyty w stadium pierścieniowym mogą być synchronizowane przez synchronizację sorbitolu nie później niż 10-12 godzin po inwazji. Synchronizację należy powtórzyć po jednym cyklu (około 48 godzin)29 .
  2. Połącz zainfekowane komórki razem (~5 x 109 erytrocytów przy 3-5% parazytemii) i napełnij zimny PBS do górnej części probówki i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut bez przerwy, aby osadzać czerwone krwinki.
  3. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety zasysającej, podłączonej do próżni, ponieważ osad erytrocytarny jest łatwy do usunięcia. Umyj granulkę jeszcze raz zimnym 1x PBS.
  4. Zawiesić osad komórkowy w zimnej 0,15% saponinie (w 1x PBS) i umieścić na lodzie na 30 minut.
  5. Odwirować komórki w temperaturze 1 500 x g przez 12 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant (który będzie miał ciemnoczerwony kolor) i ponownie zawiesić osad w zimnym PBS. Powtórz ten krok jeszcze raz.
    UWAGA: W celu upewnienia się, że obecne mikroRNA odzwierciedlały mikroRNA w pasożytach, a nie zanieczyszczenie erytrocytarne, przetestowano szereg warunków izolacji pasożytów: 1) liza saponin, 2) liza saponin połączona z traktowaniem RNazy miRNA komórek gospodarza i 3) leczenie metylo-beta-cyklodekstryną w celu usunięcia pasożyta z erytrocytów gospodarza. Wszystkie zabiegi dały podobne efekty.
  6. Poddać lizie wyizolowany osad pasożyta przy użyciu zalecanych 600 μl buforu do lizy. Ta objętość buforu do lizy jest wystarczająca dla kultur do ~30 ml przy 2% hematokrycie i 5% parazytemii.
    UWAGA: W przypadku większych kultur pasożytów objętość ta może być zwiększana. Ważne jest, aby zapewnić całkowitą lizę osadu pasożyta poprzez dokładne wirowanie przez co najmniej 1 minutę. Ponadto, aby ułatwić ekstrakcję, zlizowane próbki można przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  7. Dodać 60 μl lub 1/10 objętości buforu do lizy użytego w kroku 6 dodatku homogenatycznego (2 M octan sodu, pH 4).
  8. Próbki należy pozostawić na lodzie na 10 minut.
  9. Do każdej próbki dodać 600 μl lub objętość równą ilości buforu do lizy dodanego w kroku 6 kwaśnego choloroformu fenolowego i wirować przez 1 minutę.
  10. Oddzielić fazę wodną i organiczną, odwirowując próbki przy 10 000 x g przez 5 minut. Ten wir jest dłuższy niż sugerowany w zestawie, aby upewnić się, że cała hemoglobina/hemoina jest w fazie organicznej.
  11. Zbierz górną (wodną) warstwę i przenieś ją do świeżej probówki. Powtórz kroki 9 i 10, jeśli faza wodna ma biały lub (bardziej prawdopodobny) brązowy kolor, co sugeruje zanieczyszczenie białkami.
  12. Oznaczyć objętość powstałego supernatantu za pomocą pipety, a następnie dodać 1,25 objętości 100% etanolu (~800 μl) i wymieszać, odwracając 1,7 ml probówki mikrowirówkowej 5 razy.
  13. Przepuścić każdą próbkę przez dostarczony wkład filtrujący wiążący RNA (kilka różnych z nich jest dostępnych na rynku) przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 1 minutę lub za pomocą kolektora próżniowego.
  14. Przemyć wkład filtra 700 μl buforu do płukania miRNA 1 za pomocą mikrowirówki, wirując z prędkością 14 000 x g przez 1 min.
  15. Umyć wkład filtra 500 μl buforu płuczącego 2/3 dwukrotnie, odwirowując przy 14 000 x g przez 1 minutę każdy.
  16. Eluować RNA za pomocą 100 μl wody DEPC, która została wstępnie podgrzana do 95 ºC, w dwóch płukaniach po 50 μl, wirując przy 14 000 x g przez 1 minutę każde. Zmierz stężenie RNA za pomocą absorbancji UV przy 260nm.
    UWAGA: Żel RNA (akryloamid TBE-mocznik lub denaturujący żel agarozowy formaldehydowy) może być użyty do oceny rozkładu wielkości wyizolowanych RNA.
    UWAGA: Ten RNA nadaje się do analizy za pomocą mikromacierzy, sekwencjonowania RNA, testu ochrony przed rybonukleazą.

2: Kwantyfikacja małych rozmiarów RNA z P. falciparum podczas IDC

  1. Oznaczyć stężenie poszczególnych próbek wyizolowanych w kroku 1 przy użyciu spektrofotometrii UV przy długości fali 260 nm.
  2. Generuj startery PCR w czasie rzeczywistym dla pożądanych gatunków RNA. W przypadku samego miRNA użyliśmy gotowych testów qPCR miRNA, podczas gdy w przypadku mRNA lub fuzji miRNA-mRNA zaprojektowaliśmy startery dla SYBR green. W przypadku fuzyjnych RNA starterem do przodu była sama sekwencja miRNA (miR-451: AAACCGTTACCATTACTGAGTT), podczas gdy odwrotnym był starter specyficzny dla genu ~100 pz za miRNA w sekwencji mRNA (PKA-R: ATCGAACATGCTGTGAACAT).
  3. Wykonaj cDNA z próbek RNA za pomocą samego startera spinki do włosów dla miRNA (użyj 20-40 ng RNA) lub losowych heksamerów dla mRNA i / lub form fuzji miRNA-mRNA (przy użyciu 1 μg RNA). Mieszać RNA i startery przez 5 minut w temperaturze 65 °C, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej. Następnie dodaj mieszaninę odwrotnej transkryptazy (0,5 μl odwrotnej transkryptazy, 0,5 μl inhibitora RNazy, 1 μl dNTP (po 2,5 mM), 4 μl buforu 5x, 2 μl 0,1M DTT, 1 μl H2O).
    1. Uruchom próbki na termocyklerze zdolnym do wykrywania sond SYBR green lub TaqMan. Zielony ilościowy PCR30 SYBR dla określonych genów przeprowadzono jako 3-etapowy PCR, 95 °C przez 15 sekund, najniższa temperatura wyżarzania startera minus 5 °C przez 30 sekund i 68 °C przez 30 sekund, przez 40 cykli, przy użyciu komercyjnej zielonej mieszanki wzorcowej SYBR. PCR w czasie rzeczywistym miRNA przeprowadzono jako dwuetapowy PCR, 95 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę, przez 40 cykli.
    2. Określ ilościowo testy za pomocą metody ΔΔCt i znormalizuj je względem GTPazy Rab (PF08_0110) lub 18S rRNA 31.

3: Wprowadzenie małych RNA do pasożytów malarii

  1. Osad 300 μl czerwonych krwinek na transfekcję (ostatecznie zostanie użyte 250 μl krwinek czerwonych, około 1,5 x 109 komórek) w kompletnej pożywce malarycznej przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut przy hamulcu 1.
  2. Przemyć erytrocyty dwukrotnie RPMI i ponownie zamieszać w kompletnym cytomiksie (120 mM KCl; 0,15 mM CaCl2; 10 mM K2HPO4 / KH2PO4, pH 7,6; 25 mM HEPES, pH 7,6; 2 mM EGTA, pH 7,6; 5 mM MgCl2; pH dostosowane za pomocą KOH) przy 50% hematokrycie po odwirowaniu przy 800 x g przez 5 min przy hamulcu 1.
  3. Przenieś ogniwa do kuwety do elektroporacji o średnicy 0,2 cm.
  4. Dodać 10 μg lub odpowiednią ilość niestandardowych syntetycznych oligonukleotydów do kuwet i ponownie zawiesić kultury.
  5. Ustaw elektroporator na 310 V/950 μF i dostarcz impuls do każdej kuwety.
  6. Zawiesić 300 μl erytrocytów w kuwecie we wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywce przeciwmalarycznej i umieścić je na 24-dołkowych płytkach, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C w hermetycznym pojemniku z gazometrią malarii (3%O2, 5% CO2).
  7. Po 4 godzinach zainfekować transfekowane erytrocyty zsynchronizowanymi późnymi trofozoitami do przybliżonej końcowej parazytemii wynoszącej 1%.
  8. Dodawaj świeżo transfekowane erytrocyty co 4-6 dni do zakażonych kultur i oznaczaj % parazytemii za pomocą FACS za pomocą barwienia YoYo-1, jak wskazano w sekcji 4.

4: Określenie wpływu mikroRNA erytrocytów na wskaźnik infekcji pasożytami

  1. Pobrać 100 μl zawieszonej kultury za pomocą mikropipetora i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Przemyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS i odwirować w mikrowirówce stołowej przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut.
  2. Zawiesić osad w 1 ml 0,025% aldehydu glutarowego. Próbki inkubować przez 20 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: próbki mogą być przechowywane w tym miejscu przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C. Następnie zainfekowane erytrocyty należy granulować przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut. Przemyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS.
  3. Zawiesić osad w 1 ml 0,015% saponiny. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Erytrocyty zakażone osadem przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 min. Przemyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS. Powtórz.4.3. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1x PBS zawierającym 1 μl (1,000X) barwnika DNA.
  4. Określ stopnie parazytemii na cytometrze przepływowym, przy wzbudzeniu 488 nM i emisji ~530 nM (FL-1).
  5. Najpierw przesuń cytometr przepływowy oparty na FSC i SSC, aby skupić się na RBC. Następnie zmierz stopnie parazytemii (zakażonych erytrocytów) w bramkowanym RBC przez fluorescencję w kanale FL-1.
    UWAGA: pasożyty w późniejszym stadium są 10 razy bardziej fluorescencyjne niż pasożyty we wcześniejszym stadium i ~ 100 razy więcej niż niezakażone erytrocyty. Ponadto zbieranie z niską prędkością ma tendencję do zmniejszania hałasu. Wreszcie, podejście to porównano z inkorporacją 3H-hipoksantyny i barwieniem Giemsy, jak opisano wcześniej13, a wszystkie techniki dały podobne wyniki.

5: Znakowanie biotyną i elucja produktów fuzji miRNA-mRNA

  1. Bezpośrednio zamów niestandardowe syntetyczne oligonukleotydy RNA z destiobiotyną (Db-) kowalencyjnie połączoną z końcem 5'.
  2. Transfekować niezakażone erytrocyty miRNA sprzężonym z destiobiotyną (Db-) i niezmodyfikowanym miRNA (kontrola ujemna), jak wskazano w kroku 3.
  3. Zakażenie transfekowanych erytrocytów pasożytami P. falciparum do początkowej parazytemii 0,5% (krok 1.1).
  4. Wyodrębnij RNA pasożyta 4 dni (96 godzin) później, jak opisano powyżej w kroku 1.
  5. Inkubować 10 μg RNA pasożyta z 50 μl wypełnionymi kulkami streptawidyny, dodanymi za pomocą mikropipety i obracać na rotatorze probówek mikrowirówek przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  6. Granuluj kulki w 800 x g przez 30 sekund i umyj 20 mM KCl i inhibitorem 1/1,000 RNazy.
  7. Elutować RNA z kulek przez konkurencję z 2 mM biotyną i 200 μl buforem elucyjnym wychwytującym RNA (20 mM KCl, 1/1 000 inhibitora RNazy i 2 mM biotyny) w temperaturze 4 °C przez noc z rotacją.
  8. Określić stopień wzbogacenia wskazanych transkryptów P. falciparum za pomocą SYBR green qRT-PCR i wzbogacenia mikroRNA (kontrola pozytywna) za pomocą TaqMan qPCR, jak wskazano w kroku 2.

6: Separacja polisomów w celu określenia obecności rybosomów P. falciparum

  1. Umieścić 5 ml 15% roztworu sacharozy (400 mM octanu potasu, 25 mM HEPES-u potasu, pH 7,2, 15 mM octanu magnezu, 200 μM cykloheksymidu, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U/ml inhibitora RNazy i 15% sacharozy) w probówce ultrawirówki SW41 (14 x 89 mm).
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml dodaj 5 ml 50% roztworu sacharozy (400 mM octanu potasu, 25 mM HEPES, pH 7,2, 15 mM octanu magnezu, 200 μM cykloheksymidu, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U/ml inhibitora RNazy i 50% sacharozy) pod 15% sacharozą za pomocą długiej stalowej igły, a następnie wyjmij igłę.
  3. Uszczelnij górną część rurki gradientowej za pomocą Parafilm, powoli przechyl rurkę na bok, w stabilnej pozycji, aby zapobiec toczeniu się, tak aby leżała poziomo na blacie. Trzymaj probówkę na boku przez co najmniej 2 godziny. Czekając, zacznij od kroku 6.5.
  4. Po 2 godzinach powoli przechyl probówkę z powrotem do pozycji pionowej i przenieś probówkę do lodu, pozwalając jej ostygnąć przez co najmniej 15 minut przed załadowaniem próbki (krok 14).
  5. Zbierz wystarczającą ilość kultury krwi zakażonej zarodźcem, aby wygenerować 100-500 μg całkowitego RNA lub około 100 ml asynchronicznej hodowli przy 3-5% parazytemii. Dodać 1/10tej objętości pożywki zawierającej 10x (2 mM) cykloheksymidu (CHX) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    1. Kultury osadów przez odwirowanie przy 500 x g przez 7 minut za pomocą wirówki (hamulec 1), następnie przemyć dwukrotnie w temperaturze pokojowej 1x PBS zawierający 200 μM CHX. Zawiesić kultury pasożytów w 1x PBS zawierającym 200 μM CHX i przechowywać na lodzie.
  6. Oszacuj objętość osadu RBC. Dodać bufor do lizy (400 mM octanu potasu, 25 mM HEPES-u potasu, pH 7,2, 15 mM octanu magnezu, 200 μM CHX, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U/ml inhibitora RNazy, 1% (v/v) IGEPAL CA-630 i 0,5% (w/v) DOC) do osadu RBC do końcowej objętości 4,25 ml. Inkubować lizat w temperaturze 4 °C przez 10 minut, obracając się.
  7. Przenieść lizat do probówek do mikrowirówek, a następnie odwirować próbki w mikrowirówce przy 16 000 x g i 4 °C przez 10 minut.
  8. Przygotować poduszki sacharozy, pipetując 1,25 ml zimnego 0,5 M roztworu poduszki sacharozy (400 mM octanu potasu, 25 mM potasu HEPES, pH 7,2, 15 mM octanu magnezu, 200 μM cykloheksymidu, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U/ml inhibitora RNazy i 0,5 M sacharozy) do probówki ultrawirówkowej SW55 (13 x 51 mm).
  9. Ostrożnie nałożyć 3,75 ml supernatantu lizatu (z kroku 7) na wierzch poduszki sacharozy za pomocą strzykawki i małej (~27) igły. Przechowuj pozostały lizat (~500 μl) w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji całkowitego poziomu RNA, jak wskazano w sekcji 1.
  10. Załadować próbki do wirnika ultrawirówki, wstępnie schłodzonego do temperatury 4 °C, który może pomieścić probówki o pojemności 13,2 ml. Odwirować próbki w temperaturze 366 000 x g i temperaturze 4 °C przez 146 minut.
  11. Za pomocą pipety przenieś supernatant do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C w celu wyizolowania RNA z wolnych (niezwiązanych przez rybosomy) RNA.
  12. Zawiesić osad rybosomu w 500 μl buforu do sporządzania zawiesiny rybosomów (400 mM octanu potasu, 25 mM HEPES, pH 7,2, 15 mM octanu magnezu, 200 μM cykloheksymidu, 1 mM DTT, 1 mM PMSF i 40 U/ml inhibitora RNazy) pipetując przez 5 min.
  13. Odwirować próbki w mikrowirówce przy 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  14. Zachowując gradient z kroku #4 na lodzie, usuń Parafilm, a następnie ostrożnie ułóż zawiesinę rybosomu na wierzchu gradientu za pomocą strzykawki i małej (~27) igły.
  15. Załadować probówkę do wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki i odwirować załadowane gradienty przy 200 000 x g i 4 °C przez 180 minut. Po zakończeniu wirowania należy przechowywać odwirowane gradienty w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do załadowania do frakcjonatora.
  16. Załaduj pustą probówkę ultrawirówki do frakcjonatora gradientowego (może to być probówka używana w poprzednim przebiegu), a następnie myj wodą bez RNAse przez 5 minut z prędkością 100 x 10.
  17. Podczas prania w kroku 6.16 ustaw czułość detektora absorbancji UV. Dobra czułość początkowa wynosi 0,2, ale może być konieczne dostosowanie jej w późniejszych przebiegach w zależności od sygnału A254 (który różni się w zależności od liczby pasożytów itp.).
  18. Po ustawieniu czułości detektora ustaw sygnał linii bazowej na zero, gdy woda przepływa przez detektor.
  19. Po umyciu kolektora frakcji należy odwrócić przepływ płynu, aż przewody będą puste, a następnie wyjąć pustą probówkę ultrawirówki.
  20. Przepuścić 60% roztwór sacharozy przez frakcjonator, aż opuści on aparat igłowy.
  21. Włóż rurkę zawierającą pierwszy gradient w górnej części komory załadowczej i dokręć uszczelkę, uważając, aby nie dokręcić zbyt mocno. Następnie przekłuj igłą dno tubki.
  22. Zresetuj prędkość przepływu płynu do 12,5 x 10 (kontrolowaną za pomocą pokrętła regulacji prędkości przepływu z przodu pompy), a następnie ustaw automatyczny kolektor frakcji tak, aby zbierał 18-sekundowe frakcje (~330 μl/frakcję) w probówkach mikrowirówek.
  23. Rozpocznij przepływ 60% roztworu sacharozy.
  24. Gdy pierwsza kropla roztworu gradientowego wpadnie do probówki mikrowirówki, natychmiast rozpocznij zarówno zbieranie frakcji, jak i nagrywanie na żywo sygnału A254.
  25. Po zaobserwowaniu gwałtownego spadku sygnału A254, odpowiadającego granicy faz między 50% i 60% roztworami sacharozy, należy zatrzymać zarówno przepływ płynu, jak i zapis A254.
  26. Frakcje gradientowe należy przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  27. Odwróć przepływ płynu z prędkością 100 x 10, aż 60% roztwór sacharozy opróżni się z probówki ultrawirówki.
  28. Jeśli do frakcjonowania występują dodatkowe gradienty, wyjmij pustą probówkę ultrawirówki z komory załadowczej i uruchom ponownie od kroku 6.21. Jeżeli wszystkie próbki są kompletne, umyć aparaturę w sposób opisany w krokach 6.16 i 6.19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Globalne profilowanie ludzkiego mikroRNA w P. falciparum

Techniki przedstawione w niniejszej pracy zostały wykorzystane do ekstrakcji mikroRNA z pasożytów w różnych warunkach. Należy zaznaczyć, że ekstrakcje RNA z niezinfekowanych erytrocytów przeprowadzono zgodnie z opisem w 32, co często służyło jako punkt odniesienia dla danych dotyczących mikroRNA przedstawionych zarówno w tym artykule, jak i w oryginalnym badaniu29. Wspomniane wcześniejsze badania wykazały r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

HbS jest jednym z najczęstszych wariantów hemoglobiny na obszarach endemicznych malarii, głównie dlatego, że zapewnia ochronę przed ciężką malarią wywołaną przez P. falciparum. Techniki potrzebne do scharakteryzowania roli ludzkiego mikroRNA w regulacji genów P. falciparum są szczegółowo opisane w tym manuskrypcie. Poprzez ekstrakcję całkowitego RNA w taki sposób, aby objąć wszystkie małe RNA i przeprowadzając stosunkowo prostą procedurę lizy pasożytów, te fuzyjne RNA były w stanie zidentyfikować za pom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

Te badania były finansowane przez Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, fundusz projektów pilotażowych Duke'a Chancellora, Roche Foundation for Anemia Research oraz Fundację Billa i Melindy Gatesów. G.L. jest wspierany przez Duke's UPGG i NIH (Grant # 5R01AI090141-03), a K.A.W. przez NSF Graduate Research Fellowship Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< ODCZYNNIKI > SILNE - Wszystkie odczynniki muszą być wolne od RNAzy.
Pirowęglan dietyluSigmaD5758DEPC
Woda uzdatniona DEPC (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
Barwnik fluorescencyjny Yoyo-1 DNAElektroporator Thermo Fisher
Gene Pulser IIBio-Rad
0,2 cm Kuwety
4 M octan potasuMallinckrodt6700
2 M potas HEPESSigmaH0527pH 7,2
1 M octan magnezuSigmaM-2545
1 M ditiotreitolResearch Products InternationalD11000DTT
100 mM fluorek fenylometylosulfonianuSigmaP7626PMSF, rozpuszczony w izopropanolu
10% (v/v) Igepal CA-630Sigma-AldrichI3021
10% (w/v) deoksycholan soduSigmaD-6750DOC
CykloheksymidSigmaC-7698
CHX SacharozaMallinckrodt8360-04
RNAseOUT (Invitrogen, nr kat. 100000840)Invitrogen
RPMI-1640 z L-glutaminąCellgro10-040-CV
10% AlbuMAX IInvitrogen11020-039w/v w sterylnej wodzie
GentamycynaGibco15750-060
suplement HT (100x) (Invitrogen, nr kat. 11067030)
45% (w/v) sacharoza (Sigma, nr kat. G8769)
1 M bufor HEPES (Gibco, nr kat. 15630-080)
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; Cellgro, kat. nr 2109310CV)
Termos Corning 500 ml (VWR, nr kat. 430769)
Szkiełka podstawowe (VWR, nr kat. 48311-702)
Barwnik Giemsa (50X) (VWR, nr kat. m708-01)
Zestaw do izolacji miRNA mirVana (Ambion, ThermoFisher Scientific).
5' Dojrzałe miRNA sprzężone z biotyną (sekwencja różni się w zależności od interesującego miRNA) (Dharmacon)
Biotyna w proszku (Sigma-Aldrich)
1 M Chlorek
Streptawidyna Sefaroza Wysokowydajne kulki (GE Healthcare)
Bufor do reprodukcji rybosomów (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
Bufor do lizy (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
15% (w/v) roztwór gradientu sacharozy (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
50% (w/v) roztwór gradientu sacharozy (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
0,5 M poduszka sacharozy (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
60% (w/v) roztwór sacharozy (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
Pożywka do hodowli komórek plazmodium (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
Bufor płuczący do wychwytywania RNA (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA)
Bufor do elucji RNA (patrz KONFIGURACJA ODCZYNNIKA
KONFIGURACJA ODCZYNNIKA
Roztwory
Pożywka do hodowli komórek Plasmodium
500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamina
0,5 ml gentamycyna
5 ml suplement
2,5 ml 45% glukozy
25 ml 10% AlbuMAX I
12,5 ml 1 M ODPYLACZE
Sterylny filtr z próżniową kolbą filtracyjną 0,2 mm.
Pożywka do hodowli komórek Plasmodium zawierająca 10x CHX
Ta sama receptura, co pożywka do hodowli komórek Plasmodium powyżej, z dodatkiem:
2 mM pożywki cykloheksymidu
przygotowuje się normalnie, następnie dodaje CHX do końcowego stężenia 2 mM i filtruje. 
1x PBS zawierający cykloheksymid
Cykloheksymid dodaje się świeży do 1x PBS do końcowego stężenia 200 mM i utrzymuje w temperaturze 4 OC do momentu użycia.
Bufor do sporządzania zawiesiny rybosomów
400 mM octan
25 mM HEPES, pH 7,2
15 mM octan
200 mM cykloheksymid (dodać świeży)
1 mM DTT (dodać świeży)
1 mM PMSF (dodać świeży)
40 U/ml RNaseOUT (dodać świeży)
Bufor do lizy
sam przepis co powyższy bufor do resuspensji rybosomów, z dodatkiem:
1% (v/v) Igepal CA-630
0,5% (w/v) DOC
Sacharoza roztwory
sama receptura, co powyższy bufor do resusomów rybosomów, z dodatkiem różnych ilości sacharozy:
15% (w/v) sacharozy w celu uzyskania 15% roztworu
gradientu sacharozy50% (w/v) sacharoza do wytworzenia 50% roztworu
0,5 M sacharoza do 0,5 M poduszki
Jak powyżej, cykloheksymid, DTT, PMSF i RNaseOUT należy dodawać na świeżo.
60% roztwór sacharozy wymaga tylko sacharozy i wody, żadnych innych składników
60% (w/v) sacharozy w wodzie uzdatnionej DEPC, aby uzyskać 60% roztwór
RNA Capture Wash Buffer
20 mM  KCl
5 jednostek/ml Rnazy Out (Invitrogen)
RNA Capture Elution Buffer
Taka sama receptura jak RNA Capture Wash Buffer, z dodatkiem:
2 mM Biotyny
EQUIPMENT
SW55 Wirnik ultrawirówki Ti (Beckman, nr kat. 342194)
Wirnik ultrawirówki SW41 Ti (Beckman, nr kat. 331362)
Ultra-ClearTM ½ x 2 cale (13 x 51 mm) probówki ultrawirówkowe do SW55 (Beckman, nr kat. 344057)
Poliallomer 9/16 x 3 i frac12; w probówkach ultrawirówek (14 x 89 mm) do SW41 (Beckman, nr kat. 331372)
Ultrawirówka L8-80M (Beckman)
Stalowa igła strzykawkowa, 4 cale, 16 G (Aldrich, nr kat. Z261378)
Strzykawka 1 ml z igłą 27 G½ (Becton Dickinson, nr kat. 309623)
Strzykawka 5 ml (Becton Dickinson, nr kat. 309646)
Parafilm
Rotator probówkowy, mikrowirówka typu end-over-end
, chłodzony
System frakcjonowania w gradimencie gęstości (Teledyne Isco, nr kat. 69-3873-179)
TracerDAQ (Measurement Computing)
Wirówka Eppendorf 5810R
Wirnik Eppendorf A-4-81 (Eppendorf, nr kat. 022638807)
do elektroporacji100000840potasuHTpotasumagnezuTen Ta gradientu sacharozysacharozy sacharozy

Bibliografia

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Livincstone, F. B. Malaria and human polymorphisms. Annu Rev Genet. 5, 33-64 (1971).
  3. Nagel, R. L., Roth, E. F. Malaria and red cell genetic defects. Blood. 74, 1213-1221 (1989).
  4. Aidoo, M., et al. Protective effects of the sickle cell gene against malaria morbidity and mortality. Lancet. 359, 1311-1312 (2002).
  5. Tiffert, T., et al. The hydration state of human red blood cells and their susceptibility to invasion by Plasmodium falciparum. Blood. 105, 4853-4860 (2005).
  6. Fairhurst, R. M., et al. Abnormal display of PfEMP-1 on erythrocytes carrying haemoglobin C may protect against malaria. Nature. 435, 1117-1121 (2005).
  7. Cyrklaff, M., et al. Hemoglobins S and C interfere with actin remodeling in Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Science. 334, 1283-1286 (2011).
  8. Friedman, M. J. Erythrocytic mechanism of sickle cell resistance to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75, 1994-1997 (1978).
  9. Pasvol, G., Weatherall, D. J., Wilson, R. J. Cellular mechanism for the protective effect of haemoglobin S against P. falciparum malaria. Nature. 274, 701-703 (1978).
  10. Lecellier, C. H., et al. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science. 308, 557-560 (2005).
  11. Niu, Q. W., et al. Expression of artificial miroRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature biotechnology. 24, 1420-1428 (2006).
  12. Zhao, G., Yu, D., Weiss, M. J. MicroRNAs in erythropoiesis. Curr Opin Hematol. 17, 155-162 (2010).
  13. Lee, Y. T., et al. LIN28B-mediated expression of fetal hemoglobin and production of fetal-like erythrocytes from adult human erythroblasts ex vivo. Blood. 122, 1034-1041 (2013).
  14. Sangokoya, C., Doss, J. F., Chi, J. T. Iron-responsive miR-485-3p regulates cellular iron homeostasis by targeting ferroportin. PLoS genetics. 9, e1003408(2013).
  15. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS ONE. 3, e2360(2008).
  16. Sangokoya, C., Telen, M. J., Chi, J. T. microRNA miR-144 modulates oxidative stress tolerance and associates with anemia severity in sickle cell disease. Blood. 116, 4338-4348 (2010).
  17. Deitsch, K., Driskill, C., Wellems, T. Transformation of malaria parasites by the spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes. Nucleic acids research. 29, 850-853 (2001).
  18. Liang, X. H., Haritan, A., Uliel, S., Michaeli, S. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic cell. 2, 830-840 (2003).
  19. Baum, J., et al. Molecular genetics and comparative genomics reveal RNAi is not functional in malaria parasites. Nucleic acids research. 37, 3788-3798 (2009).
  20. Hall, N., et al. A comprehensive survey of the Plasmodium life cycle by genomic, transcriptomic, and proteomic analyses. Science. 307, 82-86 (2005).
  21. Caro, F., Ahyong, V., Betegon, M., DeRisi, J. L. Genome-wide regulatory dynamics of translation in the asexual blood stages. eLife. 3, (2014).
  22. Oehring, S. C., et al. Organellar proteomics reveals hundreds of novel nuclear proteins in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 13, R108(2012).
  23. Lasonder, E., et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 419, 537-542 (2002).
  24. Bozdech, Z., et al. The transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum. PLoS biology. 1, E5(2003).
  25. Gardner, M. J., et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature. 419, 498-511 (2002).
  26. Zhang, M., Joyce, B. R., Sullivan, W. J. Jr., Nussenzweig, V. Translational control in Plasmodium and toxoplasma parasites. Eukaryotic cell. 12, 161-167 (2013).
  27. Lacsina, J. R., LaMonte, G., Nicchitta, C. V., Chi, J. T. Polysome profiling of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular and biochemical parasitology. 179, 42-62 (2011).
  28. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome biology. 14, R128(2013).
  29. LaMonte, G., et al. Translocation of sickle cell erythrocyte microRNAs into Plasmodium falciparum inhibits parasite translation and contributes to malaria resistance. Cell host & microbe. 12, 187-199 (2012).
  30. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65, 418-420 (1979).
  31. Bourgeois, N., et al. Comparison of three real-time PCR methods with blood smears and rapid diagnostic test in Plasmodium sp. infection. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 16, 1305-1311 (2010).
  32. Abruzzo, L. V., et al. Validation of oligonucleotide microarray data using microfluidic low-density arrays: a new statistical method to normalize real-time RT-PCR data. Biotechniques. 38, 785-792 (2005).
  33. Sangokoya, C., LaMonte, G., Chi, J. T. Isolation and characterization of microRNAs of human mature erythrocytes. Methods in molecular biology. 667, 193-203 (2010).
  34. Rathjen, T., Nicol, C., McConkey, G., Dalmay, T. Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host. FEBS Lett. 580, 5185-5188 (2006).
  35. Xue, X., Zhang, Q., Huang, Y., Feng, L., Pan, W. No miRNA were found in Plasmodium and the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection. Malar J. 7, 47(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroRNA erytrocytówprofilowanie polisomówtransfekcja RNAanaliza małych RNAdetekcja transkryptów fuzyjnychbadanie regulacji genówmechanizm odporności na malarięmetoda wzbogacania RNA
Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.