Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53290

⸱

12 maja 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Physics, University of California, San Diego, 3Section of Neurobiology, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do tworzenia komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFERs) do optycznego wykrywania wolumetrycznego uwalniania neuroprzekaźników.

Streszczenie

Komórkowe neuroprzekaźniki fluorescencyjne (CNiFERs) dostarczają neurobiologom nowego narzędzia do optycznego wykrywania uwalniania neuroprzekaźników w mózgu in vivo. Specyficzny CNiFER jest tworzony z ludzkiej embrionalnej komórki nerkowej, która stabilnie wyraża specyficzny receptor sprzężony z białkiem G, który łączy się z białkami Gq / 11 G, oraz detektor Ca2 + oparty na FRET, TN-XXL. Aktywacja receptora prowadzi do wzrostu sygnału FRET. CNiFER mają czułość nM i czasową reakcję wynoszącą sekundy, ponieważ klon CNiFER wykorzystuje natywny receptor dla określonego neuroprzekaźnika, np. D2R dla dopaminy. CNiGFER są bezpośrednio wszczepiane do mózgu, co umożliwia im wykrywanie uwalniania neuroprzekaźników z rozdzielczością przestrzenną mniejszą niż sto μm, co czyni je idealnymi do pomiaru transmisji objętościowej in vivo. CNiGFER mogą być również wykorzystywane do badań przesiewowych innych leków pod kątem potencjalnej reaktywności krzyżowej in vivo. Niedawno rozszerzyliśmy rodzinę CNiGFER o GPCR, które łączą się z białkami Gi/o G. CNiFER są dostępne do wykrywania acetylocholiny (ACh), dopaminy (DA) i noradrenaliny (NE). Biorąc pod uwagę, że każdy GPCR może być użyty do stworzenia nowego CNiFER i że w ludzkim genomie znajduje się około 800 GPCR, opisujemy tutaj ogólną procedurę projektowania, realizacji i testowania dowolnego typu CNiFER.

Wprowadzenie

Aby w pełni zrozumieć, jak neurony komunikują się w mózgu, konieczne jest posiadanie metody pomiaru uwalniania neuroprzekaźników in vivo. Istnieje kilka dobrze znanych technik pomiaru neuroprzekaźników in vivo. Jedną z powszechnie stosowanych technik jest mikrodializa, w której kaniulę wprowadza się do mózgu, a niewielką objętość płynu mózgowo-rdzeniowego pobiera się i analizuje za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i detekcji elektrochemicznej1. Mikrodializa posiada rozdzielczość przestrzenną rzędu kilku średnic sondy, np. ~0,5 mm dla mikrosondy o średnicy 200 μm. Rozdzielczość czasowa tej techniki jest jednak powolna ze względu na interwały próbkowania, które zwykle trwają ~5 minut lub dłużej1. Co więcej, analizy nie są wykonywane w czasie rzeczywistym. Inną techniką jest szybka skaningowa woltamperometria cykliczna (FSCV), która wykorzystuje sondę z włókna węglowego, która jest wprowadzana do mózgu. FSCV charakteryzuje się doskonałą rozdzielczością czasową (subsekunda), wysoką czułością (nanomolowa) i rozdzielczością przestrzenną przy średnicach sondy od 5 do 30 μm. Jednak FSCV jest ograniczony do przetworników, które wytwarzają charakterystyczny profil utleniania i redukcji z napięciem na węglowej sondzie potencjometrycznej2.

Trzecią techniką pomiaru neuroprzekaźników jest bezpośrednio za pomocą genetycznie kodowanych biosensorów neuroprzekaźników (NT)3. Dzięki tej metodzie tworzy się białko fuzyjne, które zawiera domenę wiążącą ligand dla nadajnika sprzężonego z parą fluoroforów4 opartą na rezonansie fluorescencyjnym (FRET) lub permutowanym GFP5. W przeciwieństwie do poprzednich dwóch metod, te bioczujniki są genetycznie kodowane i ulegają ekspresji na powierzchni komórki gospodarza, takiej jak neuron, poprzez produkcję zwierząt transgenicznych lub w ostrym stopniu przy użyciu czynników wirusowych do infekowania komórek. Do tej pory genetycznie kodowane bioczujniki zostały opracowane tylko do wykrywania glutaminianu i GABA3-5. Ograniczeniami w stosowaniu tych technik była niska czułość w zakresie nM oraz niemożność rozszerzenia detekcji na dużą liczbę przekaźników, np. klasycznych neuroprzekaźników, neuropeptydów i neuromodulatorów, które sygnalizują za pośrednictwem receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). W rzeczywistości w ludzkim genomie znajduje się prawie 800 GPCR.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy innowacyjne narzędzie do optycznego pomiaru uwalniania każdego neuroprzekaźnika, który wysyła sygnał przez GPCR. CNiFER (cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters) to klonalne komórki HEK293 zaprojektowane do ekspresji specyficznego GPCR, który po stymulacji wyzwala wzrost wewnątrzkomórkowego [Ca2 +], który jest wykrywany przez genetycznie kodowany czujnik Ca2 + oparty na FRET, TN-XXL. W ten sposób CNiFER przekształcają wiązanie receptora neuroprzekaźnika w zmianę fluorescencji, zapewniając bezpośredni i optyczny odczyt w czasie rzeczywistym lokalnej aktywności neuroprzekaźników. Wykorzystując natywny receptor dla danego neuroprzekaźnika, CNiFER zachowują specyficzność chemiczną, powinowactwo i dynamikę czasową endogennie wyrażanych receptorów. Do tej pory stworzyliśmy trzy rodzaje CNiFER, jeden do wykrywania acetylocholiny za pomocą receptora M1, jeden do wykrywania dopaminy za pomocą receptora D2 i jeden do wykrywania noradrenaliny za pomocą receptora α1a6,7. Technologia CNiFER jest łatwo rozbudowywalna i skalowalna, dzięki czemu jest kompatybilna z każdym typem GPCR. W tym artykule JoVE opisujemy i ilustrujemy metodologię projektowania, realizacji i testowania CNiFER in vivo dla dowolnego zastosowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt przeprowadzone w niniejszym badaniu są zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) i zostały zatwierdzone przez komitety IACUC w Icahn School of Medicine at Mount Sinai oraz University of California, San Diego.

1. Generowanie lentiwirusa wykazującego ekspresję GPCR do transformacji komórek HEK293

  1. Pozyskaj cDNA dla konkretnego GPCR z źródła komercyjnego, np. cdna.org. Alternatywnie amplifikuj gen GPCR z biblioteki cDNA za pomocą PCR. Pozyskaj wektor ekspresyjny lentiwirusowy, taki jak pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Wykorzystaj ten wektor do propagacji DNA oraz do generowania lentiwirusa.
  2. Sklonuj cDNA GPCR do wektora ekspresyjnego lentiwirusowego za pomocą PCR. Szczegóły dotyczące subklonowania PCR znajdują się u Lorenza8.
  3. Namnoż i oczyść DNA GPCR-pCDH, używając zestawu do „maxi” preparatyki pozbawionej endotoksyn, zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdź za pomocą sekwencjonowania DNA, że subklonowane do pCDH cDNA GPCR jest wolne od mutacji.
    Uwaga: Przed przekazaniem DNA do produkcji wirusa, poddaj alikwot trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym, aby potwierdzić wielkość wkładu oraz czystość DNA.
  4. Wygeneruj lentiwirusa w jednostce centralnej produkcji wirusów, takiej jak w The Salk Institute, University of Penn. lub University of North Carolina itp., lub wytwórz go samodzielnie w laboratorium9. Użyj około 25 μg (>1 μg/μl) DNA wolnego od endotoksyn do transfekcji komórek HEK w kolbie T75. Upewnij się, że DNA charakteryzuje się wysoką czystością, z wynikiem stosunku absorbancji (A260/A280) około 1,8.
    Uwaga: Miana wirusa rzędu ~1011-1012 GC/ml są optymalne dla transdukcji komórek HEK293.

2. Wybór linii komórkowej HEK293/TN-XXL jako szkieletu do hodowli in vitro

Uwaga: Należy określić swoistość sprzęgania białek G, np. białek Gi/o, Gq/11 lub Gs, danego GPCR, ponieważ determinuje to, czy do zastosowania CNiFER wymagana jest chimera białka G. Dla receptorów sprzęganych z Gq, np. muskarynowego receptora M1, jako bazowy typ komórek HEK293 należy wybrać HEK293/TN-XXL(#3g8) . Dla receptorów sprzęganych z Gi/o wymagane jest chimeryczne białko G Gqi510. Dla receptora sprzęganego z Gs wymagana jest chimera Gqs510. W niniejszym protokole jako przykład wykorzystano konstrukcję CNiFER dla D2R. D2R sygnalizuje poprzez białka G Gi/o i wymaga komórek HEK293 stabilnie eksponujących chimeryczne białko G, Gqi5, np. HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6.

  1. Pozyskać klonalne komórki HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6 z laboratorium badawczego. Uwaga: Następujące linie klonalne: HEK293/TN-XXL(#3g8) dla receptorów sprzężonych z białkiem Gq, HEK293/TN-XXL/Gqi5 (#qi5.6) dla receptorów sprzężonych z białkami Gi/o oraz HEK293/TN-XXL/Gqs5 (#qs5.47) dla receptorów sprzężonych z białkiem Gs są bezpłatnie dostępne na zapytanie6,7.
  2. Hodować i namnażać komórki HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6 do osiągnięcia ok. 90% konfluencji w kolbie T25 zawierającej 5 ml pożywki wzrostowej dla HEK293 (Tabela 1). Hodować komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przy 5% (v/v) CO2.
    Uwaga: Wszystkie prace związane z hodowlą komórek HEK293 należy prowadzić zgodnie ze standardowymi, sterylnymi technikami hodowli tkankowej.
  3. Zebrać komórki HEK293, najpierw odsysając pożywkę z kolby T25. Delikatnie opłukać komórki, dodając 5 ml PBS i kołysząc kolbą.
  4. Usunąć PBS i dodać 1 ml 0,05% (w/v) trypsyny/EDTA (Tabela 2). Inkubować od 1 do 2 min w temperaturze 37°C przy 5% (v/v) CO2.
  5. Zebrać komórki i przenieść je do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 min przy 1 000 x g w wirówce do hodowli komórkowych. Odsysać supernatant.
  6. Resuspendować osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej dla HEK293. Policzyć komórki w hemocytometrze przy użyciu błękitu trypanu. Obliczyć gęstość komórek i przejść do kroku 3.

3. Transdukcja lentiwirusowa komórek HEK293/TN-XXL/Gqi5

  1. Zasiać do kolby T25 0,7 x 10^66 HEK293/TN-XXL/Gqi5 komórki. Hodować komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 do osiągnięcia konfluencji na poziomie ok. 50%, po około 1 dniu. Zamrozić pozostałe komórki (kroki 8.2–8.3). Komórki te będą służyć jako kontrola CNiFER, t. j., CNiFER pozbawiony GPCR.
  2. W dniu infekcji rozcieńczyć lentiwirusa wykazującego ekspresję GPCR (krok 1.4) do stężenia końcowego wynoszącego ok. 109 GC/ml w całkowitej objętości 2 ml pożywki do hodowli komórek HEK293 (Tabela 1). Na przykład, dodaj 20 μ1 z 1011 GC/ml wirusa do 2 ml pożywki w kolbie T25.
    Uwaga: Informacje dotyczące miana wirusa powinny zostać dostarczone przez jednostkę centralną ds. wirusów (virus core facility). Połączyć lentiwirusa z medium w probówce do wirówki i delikatnie zhomogenizować poprzez triturację. Wysokie miana lentiwirusa odpowiadają 2. poziomowi bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).
  3. Odssać medium z kolby T25. Dodać 2 ml mieszaniny wirusa z medium z kroku 3.2. Inkubować kolbę T25 przez noc w temperaturze 37°C. °C z 5% (v/v) CO2.
  4. Po jednym dniu od infekcji odessać mieszaninę wirusa z medium i zastąpić ją medium wzrostowym dla komórek HEK293 zawierającym puromycynę (2 μg/ml; Tabela 1). Puromycyna służy do selekcji komórek po transdukcji. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 do osiągnięcia około 90% konfluencji, po około 1–2 dniach.
  5. Przygotować płytkę 96-dołkową (czarną z przezroczystym dnem), powleczoną fibronektyną, do wygenerowania 10-punktowej krzywej agonizmu/aktywacji w kroku 4.1. W sterylnej komorze przepływu laminarnego dodać 50 μfibonektyna (5 μg/ml) na każdą studienkę w rzędach A i B płytki 96-dołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 h. Przepłukać dwukrotnie w celu 5 min przepłukać PBS. Dodać 50 μl pożywki do hodowli komórek HEK293 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2.
    Uwaga: Płytki pokryte fibronektyną są dostępne w sprzedaży.
  6. Zabierz komórki z kolby T25 zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.6 (Tabela 2).
  7. Resuspender osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej dla komórek HEK293. Przenieść 1,5 ml zawiesiny komórkowej do kolby T25 w celu przeprowadzenia analizy FACS. Dodatkowo przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do kolby T75 w celu zamrożenia i przechowywania (patrz kroki 8.2-8.3).
  8. W celu otrzymania 10-punktowej krzywej dla agonisty, w dwóch pierwszych rzędach (A i B) płytki 96-dołkowej pokrytej fibronektyną (z kroku 3.5) wysiej 100 μl zawiesiny komórkowej na dołek.
  9. Inkubować komórki HEK293 hodowane w kolbie T25, kolbie T75 oraz płytce 96-dołkowej do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 90% w temperaturze 37°C °C z 5% (v/v) CO2, po około 1–2 dniach.

4. FACS i izolacja pojedynczych klonów CNiFER

  1. Użyć płytki 96-dołkowej do wygenerowania 10-punktowej krzywej aktywacji agonistycznej.
    Uwaga: Przed rozpoczęciem analizy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) ważne jest potwierdzenie ekspresji GPCR poprzez przetestowanie odpowiedzi agonistycznej komórek transdukowanych (10-punktowa krzywa agonistyczna). Test ten wykonuje się przy użyciu fluorometrycznego czytnika płytek.
    1. Przygotować płytkę z lekiem do 10-punktowej krzywej aktywacji agonistycznej. Wybrać 10 różnych stężeń agonisty, które obejmują przewidywane EC50, które można określić na podstawie literatury.
      Uwaga: Płytka z lekiem zawiera 3-krotne stężenie każdej dawki (w dubletach), aby skorygować rozcieńczenie 1:3 w płytce CNiFER. Na przykład płytka z lekiem do testowania D2 CNiFER zawiera 10 różnych stężeń dopaminy w stężeniach 3-krotnych: 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 i 1 000 nM. W płytce CNiFER końcowe stężenia dopaminy wynoszą zatem odpowiednio 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7 i 333 nM.
    2. Przygotować roztwory agonisty, używając sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) (Tabela 1). Wykorzystać dwa dołki dla „ACSF”, np. A1 i A2, oraz dwa dołki dla „braku komórek”, np. B1 i B2.
      Uwaga: Różne stężenia leków przygotować metodą rozcieńczeń seryjnych. Stworzyć szablon do monitorowania klonów CNiFER i stężeń leków (Rysunek 3).
    3. Użyć oprogramowania do zaprogramowania 96-dołkowego fluorometrycznego czytnika płytek w celu pomiaru FRET i przenoszenia roztworów.
      1. Ustawić temperaturę czytnika płytek na 37 °C.
      2. Do pomiaru FRET z użyciem TN-XXL ustawić długość fali wzbudzenia na 436 ± 4,5 nm (centrum ± HWHM). Ustawić filtry emisyjne na 485 ± 7,5 nm dla eCFP oraz 527 ± 7,5 nm dla Cytryny. Ustawić filtry odcinające odpowiednio na 475 i 515 nm dla eCFP i Cytryny.
      3. Zaprogramować czytnik płytek tak, aby mierzył emisję przy 485 nm i 527 nm co 4 sek przez łącznie 180 sek. Wybrać opcję podania 50 µl z 3-krotnej płytki z lekiem do 100 μl w płytce CNiFER po zebraniu 30 sek fluorescencji bazowej.
    4. Odssać medium z rzędów A i B i dodać 100 µl ACSF do 96-dołkowej płytki CNiFER, która jest konfluencyjna w ok. 90% (krok 3.9).
    5. Włożyć 96-dołkową płytkę CNiFER oraz 3-krotną płytkę z lekiem do czytnika. Odczekać ok. 30 min na wyrównanie temperatury płytek do 37 °C. Następnie uruchomić program.
    6. Aby przeanalizować dane z czytnika płytek, wyeksportować wartości fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego. Stworzyć formułę do odjęcia pomiarów tła (wykonanych dla każdego sygnału z dołków bez komórek) od dołków z CNiFERami. Znormalizować intensywności fluorescencji do linii bazowych sprzed stymulacji, FCitrine(t)/FCitrine(baseline), i obliczyć stosunek FRET (ΔR/R; równ. 1), używając odpowiedzi szczytowych dla emisji przy 527 nm i 485 nm (patrz krok 11).
      Uwaga: Jeśli wystąpi znacząca zmiana ΔR/R pod wpływem agonisty, wskazuje to na ekspresję GPCR i można przystąpić do analizy FACS (krok 4.2). Jeśli nie wystąpi odpowiedź FRET na agonistę, przeprowadzić rozwiązywanie problemów, używając jonofora Ca2+, np. A21387, aby sprawdzić odpowiedź na Ca2+ i potwierdzić działanie sensora opartego na FRET. Jeśli jonofor zadziała, prawdopodobnie receptor nie został wyeksponowany.
  2. W dniu poprzedzającym FACS przygotować cztery płytki 96-dołkowe pokryte fibronektyną (patrz krok 3.5) do zbierania posortowanych komórek. Dodać 50 μl medium wzrostowego HEK293 i inkubować przez noc (O/N) w 37 °C przy 5% (v/v) CO2.
  3. Przygotować 5% (w/v) BSA w PBS (5 g/100 ml) i przefiltrować (0,2 μm) do sterylnej butelki.
  4. Zebrać komórki hodowane w kolbie T25 (patrz kroki 2.3-2.5, Tabela 2). Resuspendować osad komórkowy w 4 ml 5% (w/v) BSA w PBS. Centryfugować komórki przy 1 000 x g przez 5 min.
  5. Odssać medium i resuspendować osad komórkowy w ok. 5 ml 5% (w/v) BSA w PBS, aby uzyskać końcowe stężenie ok. 5 x 106 komórek/ml.
    Uwaga: Skonsultować specyficzne wymagania dotyczące gęstości komórek i warunków sortowania z jednostką FACS.
  6. Przefiltrować resuspendowane komórki przez sitko komórkowe 40 μm, aby usunąć grudki. Przenieść komórki do polipropylenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Umieścić probówkę na lodzie do czasu transportu do laboratorium FACS.
  7. Posortować transdukowane komórki HEK293 w laboratorium FACS. Zaprogramować parametry w cytometrze przepływowym FACS w następujący sposób: ustawić 4 °C dla uchwytu na próbki, 100 μm dla dyszy i 20 p.s.i. Na podstawie analizy poprzedzającej sortowanie wybrać komórki, tzn. wybrać „bramkę” (gate), które wykazują dużą fluorescencję eCFP (wzbudzenie eCFP, emisja eCFP) i dużą fluorescencję FRET (wzbudzenie eCFP, emisja Cytryny) (patrz Wyniki poniżej, Rysunek 2).
  8. Zdeponować poszczególne posortowane komórki do płytki 96-dołkowej przygotowanej w kroku 4.2, z jednym klonem na dołek zawierający 50 μl medium wzrostowego HEK293 z puromycyną. Dodać 50 μl medium wzrostowego HEK293 z puromycyną (Tabela 1), aby uzyskać łącznie 100 μl na dołek. Hodować komórki przez noc (O/N) w 37 °C przy 5% (v/v) CO2.
    Uwaga: Medium wzrostowe HEK293 zawiera puromycynę do selekcji komórek transdukowanych.

5. Hodowla i ekspansja posortowanych, klonalnych komórek CNiFER

  1. Utrzymuj CNiFERs w płytkach 96-dołkowych, usuwając 50 μl starej pożywki z każdego dołka i zastępując ją 50 μl świeżej pożywki wzrostowej dla HEK293 zawierającej puromycynę (Tabela 1). Powtarzaj tę czynność co 5 do 7 dni, aż do osiągnięcia konfluencji ok. 90%, po 2-3 tygodniach.
  2. Zbierz komórki CNiFER, delikatnie aspirując pożywkę i płucząc raz łagodnie PBS. Usuń PBS i dodaj 20 μl 0,05% (w/v) trypsyny/EDTA. Inkubuj od 1 do 2 min w temperaturze 37° C przy 5% (v/v) CO2.
  3. Dodaj 100 μl pożywki wzrostowej dla HEK293 do komórek traktowanych trypsyną i resuspenduj komórki. Przenieś zawartość do płytki 24-dołkowej zawierającej 400 μl świeżej pożywki wzrostowej dla HEK293 z puromycyną. W płytce 24-dołkowej utrzymuj komórki, wymieniając 250 μl pożywki wzrostowej dla HEK293 co 5-7 dni, aż do osiągnięcia konfluencji dołków na poziomie ok. 90%.

6. Identyfikacja potencjalnych CNiFER-ów na podstawie odpowiedzi FRET przy użyciu fluorometrycznego czytnika płytek

Uwaga: Przy czterech płytkach 96-dołkowych po FACS powinno być >100 klonów nadających się do testowania, które przeżyją i namnożą się do etapu płytki 24-dołkowej, ponieważ wiele z pierwotnych klonów nie wykazuje wzrostu. Aby zidentyfikować potencjalnych kandydatów na CNiFERy, należy zastosować analizę 3-punktową odpowiedzi FRET z odpowiednim agonistą, np. dopaminą dla D2R.

  1. Gdy komórki osiągną ~90% konfluencji w płytce 24-dołkowej, delikatnie odessaj pożywkę. Dodaj ~100 μl 0,05 % (w/v) trypsyny/EDTA i inkubuj przez 1-2 min w temperaturze 37 °C przy 5% (v/v) CO2. Dodaj 400 μl pożywki wzrostowej dla HEK293 do komórek traktowanych trypsyną i wymieszaj komórki poprzez delikatną tryturację.
  2. Przygotuj 3-punktową krzywą agonisty do wstępnego przesiewu klonów. Dla każdego klonu CNiFER, t.j., jednego z dołków w płytce 24-dołkowej, odnieś 100 μl zawiesiny komórkowej (~4 x 103 komórek/dołek) do każdego z trzech dołków, np., A1, A2, A3, w płytce 96-dołkowej pokrytej fibronektyną (czarna z przezroczystym dnem) (patrz krok 3.5).
  3. Przenieś pozostałe ~200 μl zawiesiny komórkowej do płytki 12-dołkowej zawierającej 1 000 μl pożywki wzrostowej HEK293 (objętość końcowa 1,2 ml). Inkubuj obie płytki w 37 °C przy 5% (v/v) CO2, aż do uzyskania ~90% konfluencji. Płytka 96-dołkowa służy do analizy fluorometrycznej, a płytka 12-dołkowa do hodowli i ekspansji klonów.
  4. Dla analizy 3-punktowej wyznacz trzy różne stężenia agonisty, które wynoszą odpowiednio 0,1-, 1,0- i 10-krotność EC50 dla konkretnego GPCR. Przygotuj stężenia agonisty w płytce do leków zgodnie z opisem w krokach 4.1.1-4.1.2. Przeprowadź analizę za pomocą fluorometrycznego czytnika płytek zgodnie z opisem w krokach 4.1.3-4.1.5.
  5. Oblicz stosunek FRET (ΔR/R) zgodnie z opisem w kroku 4.1.6. Wybierz klony CNiFER o odpowiedniej czułości i największej odpowiedzi FRET w celu ich ekspansji, zamrożenia oraz przeprowadzenia bardziej kompleksowych analiz (krok 7).
  6. W przypadku klonów wybranych w kroku 6.5, które rosną w płytce 12-dołkowej, usuń i wymień 600 μl pożywki wzrostowej HEK293 co 5 do 7 dni, aż do osiągnięcia ~90% konfluencji.
  7. Stopniowo zwiększaj skalę hodowli klonów z płytki 12-dołkowej do płytki 6-dołkowej, a następnie do kolby T25 (kroki 2.3 - 2.6 i Tabela 2). Gdy w kolbie T25 osiągnięta zostanie ~90% konfluencja, zbierz komórki zgodnie z opisem (kroki 2.3-2.5). Resuspenduj osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej HEK293.
  8. Dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej do kolby T75 z 9 ml pożywki wzrostowej HEK293. Pozostałe 4 ml zawiesiny komórkowej wykorzystaj do krio-ochrony i przechowywania w ciekłym N2 (kroki 8.2-8.3). Przygotuj osiem krio-probówek o pojemności 1,5 ml i umieść je na lodzie.
  9. W kolbie T75 utrzymuj komórki, wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę wzrostową HEK293, np., 10 ml co 3-5 dni, aż do osiągnięcia 70-80% konfluencji po około 1-2 tygodniach.

7. Końcowy wybór klonów CNiFER przy użyciu fluorometrycznego czytnika płytek

  1. W dniu poprzedzającym analizę w czytniku płytek:
    1. Zebrać komórki z kolby T75 z konfluencją ok. 90% (patrz kroki 2.3-2.6, Tabela 2). Wysiać płytkę 96-dołkową pokrytą fibronektyną (czarna z przezroczystym dnem) w zagęszczeniu 5 x 104/dołek, używając ok. 100 μl zawiesiny komórkowej. Uwaga: Jeden klon jest rozmieszczany na pojedynczej płytce 96-dołkowej.
  2. Przygotować płytkę z lekiem do kompleksowego przesiewania klonów CNiFER w celu odróżnienia specyficznych odpowiedzi na agonistę od niespecyficznych odpowiedzi CNiFER.
    1. Aby wygenerować pełną krzywą odpowiedź-dawka, wybrać 10 różnych stężeń agonisty w okolicy przewidywanego EC50. Wykorzystać dwa dołki jako „bez komórek” oraz dwa dołki dla „ACSF”.
    2. W celu wyznaczenia odpowiedzi niespecyficznych wybrać trzy stężenia dla 12 różnych neuroprzekaźników lub modulatorów (72 dołki) (Rysunek 3). Podobnie jak w przypadku agonisty, płytka z lekiem zawiera trzykrotne stężenia w duplikacie. Na przykład do 96-dołkowej płytki z lekiem nanosi się 100 μl trzech różnych stężeń acetylocholiny, glutaminianu, oreksyny, VIP, adenyzyny, serotoniny, norepinefryny, GABA, substancji P, melatoniny, somatostatyny i histaminy, każdorazowo w trzykrotnych stężeniach 50, 1 000 i 3 000 nM.
  3. Ustawić parametry w fluorometrycznym czytniku płytek do pomiaru FRET oraz przeprowadzenia transferów roztworów zgodnie z opisem w krokach 4.1.3-4.1.5.
  4. Do analizy pełnej krzywej odpowiedź-dawka obliczyć szczytowy stosunek FRET (ΔR/R) (krok 4.1.6), wykreślić go jako funkcję logarytmu stężenia agonisty i dopasować za pomocą równania Hilla (krok 11.4). Wyznaczyć EC50, współczynnik Hilla oraz maksymalny stosunek FRET. Dla 12 pozostałych neuroprzekaźników/modulatorów wykreślić szczytowe ΔR/R jako funkcję stężenia leku.
  5. Wybrać ok. 10 klonów CNiFER, które wykazują wysoki stosunek FRET, odpowiednie EC50 dla pokrewnego agonisty oraz niewielkie lub żadne odpowiedzi tła na inne agonisty neuroprzekaźników (odpowiedź niespecyficzna).

8. Zamrażanie wybranych klonów CNiFER

  1. Użyj kolba T75 z pojedynczym klonem CNiFER, zросłymi w ok. 90%. Zebrać komórki zgodnie z opisem (kroki 2.3-2.5, Tabela 2). W celu zamrożenia komórek, resuspendować osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej dla komórek HEK293. Oznakować dziesięć probówek kriogenicznych o pojemności 1,5 ml i umieścić je w lodu.
  2. W celu krioprotekcji należy zmieszać komórki w stosunku 1:1 z 20% (v/v) DMSO w pożywce wzrostowej dla komórek HEK293, np.5 ml mieszaniny 20% (v/v) DMSO z pożywką delikatnie mieszamy z 5 ml zawiesiny komórkowej (końcowe stężenie DMSO wynosi 10%).
  3. Przenieś po 1 ml do każdej z probówek kriogenicznych. Zamroź probówki z komórkami w temperaturze -80°C. °zamrażarka w temperaturze -80°C przez noc, w pojemniku z izolacją piankową (patrz Materiały). Przenieść krioprobowki do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.

9. Implantacja CNiFER do kory mózgu myszy

  1. Sterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie przed zabiegiem operacyjnym. Przygotować półsterylne pole operacyjne, przecierając powierzchnię 70% etanolem i rozkładając czystą pieluchę laboratoryjną.
  2. Przygotować pipetę wtryskową CNiFER, wyciągając kapilarę szklaną (o średnicy wewnętrznej 0,53 mm) w pionowym wyciągaczu elektrod. Za pomocą pęsety precyzyjnej nr 5 należy złamać końcówkę elektrody, aby uzyskać średnicę ok. 40 µm. μm.
    Uwaga: najlepiej wykonać tę czynność pod stereo-mikroskopem z zoomem i siatką pomiarową.
  3. Zpodaj środek znieczulający dorosłemu zwierzęciu (dzień postnatalny 60-90) mysz C57BL/6 z izofluranem: 4% (v/v) do indukcji i od 1,5 do 2,0% (v/v) do podtrzymania znieczulenia. Aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona, należy zastosować ucisk ogona lub palca u nogi.
    Uwaga: Należy okresowo powtarzać ucisk palcami i oceniać drgania wibrysów podczas całej operacji w celu ponownej oceny głębokości znieczulenia.
  4. Przesmarować oczy maścią oftalmiczną, aby zapobiec ich wysychaniu. Umieścić mysz w uchwycie stereotaktycznym za pomocą przymocować uchwyty do uszu. Utrzymywać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C z zastosowaniem podkładki grzewczej regulowanej za pomocą sondy rektalnej.
  5. Ogolić obszar o wymiarach około 5 mm na 12 mm za pomocą elektrycznej maszynki do golenia zwierząt. Nanieść Betadine, a następnie 70% (v/v) izopropanol. Za pomocą ostrza skalpela należy naciąć i usunąć skórę z powierzchni czaszki. Za pomocą ostrza skalpela należy usunąć okostną z powierzchni czaszki. Odsłonić i oczyścić powierzchnię czaszki zgodnie z opisem dla zabiegu stereotaktycznego11.
  6. Opuść pustą pipetę szklaną do punktu bregma i zapisz współrzędne przednio-tylne (A/P) oraz boczno-przyśrodkowe (M/L). Na podstawie atlasu mózgu myszy oblicz położenie miejsca iniekcji. Przesuń pipetę do miejsca docelowego i zaznacz czaszkę w celu późniejszego wykonania okna. Patrz: Cetin i wsp. w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat wstrzykiwań stereotaktycznych u gryzoni11.
    Uwaga: miejsce wstrzyknięcia i okno zależą od badanego regionu oraz rozkładu projekcji uwalniających neuroprzekaźniki lub peptydy w korze mózgu. Na przykład w niedawnej publikacji7wykorzystano współrzędne stereotaktyczne od +1,0 do +2,0 mm A/P oraz od +1,0 do +2,0 mm M/L do wstrzyknięcia komórek CNiFER do kory czołowej w celu in vivo obrazowanie uwalniania dopaminy podczas warunkowania klasycznego.
  7. Wyciąć okno w cieńszej czaszce o wymiarach 2 mm x 3 mm zgodnie z wcześniej opisaną procedurą12,13.
    Uwaga: kość w okienku powinna mieć rozmiar 15-20 μm grubości. Małe białe plamki w kości nie powinny być widoczne po zwilżeniu powierzchni czaszki, jeżeli kość została wystarczająco odcieniona.12,13.
  8. Umieść na okienku gąbkę nasączoną ACSF, aby utrzymać wilgotność podczas przygotowywania komórek do iniekcji.
  9. Zmieć klon CNiFER hodowany w kolbie T75 do około 80% konfluencji. Odessać pożywkę i przemyć komórki sterylnym PBS.
    Uwaga: W tych etapach pominięto trypsynę.
  10. Usunąć PBS i użyć 10 ml ACSF w celu odseparowania komórek od dna kolby. Przetrzeć komórki w celu rozbicia skupisk komórkowych. Odwirować i resuspender osad w 100 μl ACSF. Wirować przez 30 s przy 1 400 x g i usunąć supernatant, pozostawiając osad pokryty ACSF. Na tym etapie w zawiesinie pozostaje skupisko komórek.
  11. Napełnij pipetę iniekcyjną przygotowaną w kroku 9.2 olejem mineralnym, zamocuj pipetę w nanoiniektorze i przesuń tłok, aby wypchnąć małą kroplę oleju. Pobierz 5 μ... l zawiesiny komórek CNiFER na pasek plastikowej folii parafinowej w pobliżu preparatu myszy. Nabrać komórki CNiFER lub kontrolne komórki CNiFER do dociągniętej pipety.
  12. Przenieś pipetę do docelowych współrzędnych X i Y, tj., A/P i M/L odnotowane w kroku 9.5. Obniżyć pipetę, przebijając wcienioną czaszkę i kontynuować do ~200-400 μponiżej powierzchni czaszki, aby zdeponować komórki CNiFER w warstwach 2/3 kory mózgowej.
  13. Wstrzyknij ok. 4,6 nl komórek CNiFER w najgłębszym punkcie za pomocą nanowtryskiwacza, zaobserwuj ruch na granicy fazy olejowej i komórkowej, a następnie odczekaj 5 min. aby komórki zostały wydzielone. Odessać pipetą ok. 100 μi wstrzyknij kolejne ~4,6 nl komórek CNiFER, odczekaj 5 min. Następnie powoli i ostrożnie wycofać pipetę, aby zapobiec cofaniu się CNiFERs. Powtórzyć iniekcję w jednym lub kilku sąsiednich miejscach.
  14. Powtórz etapy wstrzykiwania od 9.8 do 9.12 z kontrolnymi komórkami HEK293 (t. j., HEK293/TN-XXL/Gqi5 klon pozbawiony GPCR). Oddzielić miejsca iniekcji komórek CNiFER i komórek kontrolnych w odległości ok. 200 μm.
  15. Po zakończeniu implantacji komórek przepłucz okno w miejscu cienkiej czaszki za pomocą ACSF i poczekaj, aż czaszka wyschnie. Nałóż kroplę kleju cyjanoakrylanowego (patrz Materiały) nad okienkiem i szybko nałóż na klej wcześniej docięte, sterylne szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko do czaszki przez kilka sekund. Pozostaw klej do wyschnięcia na 2 min.12,13.
  16. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem dentystycznym i utwórz wokół okienka wgłębienie, które będzie utrzymywać wodę dla obiektywu imersyjnego.
  17. Aby unieruchomić głowę myszy podczas obrazowania, należy przymocować specjalnie wykonany uchwyt głowy (head-bar), używając małej kropli kleju cyjanoakrylowego za oknem (patrz14 (szczegóły dotyczące wymiarów i materiałów). Pozostawić klej do całkowitego wyschnięcia, a następnie dodać dodatkowy cement dentystyczny w celu dalszego wzmocnienia wykonanego na zamówienie pręta głowowego.
  18. Pokryj pozostałą powierzchnię czaszki, z wyjątkiem okna, warstwą cementu dentystycznego. Upewnij się, że krawędzie skóry są przykryte cementem, i pozostaw go do wyschnięcia na 20 min.
  19. Po zakończeniu zabiegu należy zaprzestać podawania izofluranu i pozostawić mysz na podgrzewajce w klatce do czasu pełnego wybudzenia z anestezji. W celu nawodnienia należy podać podskórnie (s.c.) 5% (w/v) glukozę w soli fizjologicznej, a w celu przeciwbólowego działania pooperacyjnego podać doszprycowo (i.p.) buprenorfinę w dawce od 0,05 do 0,1 mg/kg (forma o natychmiastowym uwalnianiu).
    Uwaga: Aby zminimalizować potencjalną reakcję immunologiczną na ludzkie CNiFERy, wstrzykuj myszy codziennie 20 μl/100 g cyklosporyny (i.p.) rozpoczynając w dniu poprzedzającym wstrzyknięcie CNiFERs.
  20. Przenieś mysz z powrotem do klatki macierzystej, aby miała dostęp do pokarmu i wody.

10. Obrazowanie klonów CNiFER in vivo 

Uwaga: Obrazowanie na żywo jest przeprowadzane u myszy z wykorzystaniem mikroskopu dwufotonowego oraz aparatu do stabilizacji głowy. Podczas sesji obrazowania nie jest wymagane podawanie znieczulenia. Podczas obrazowania zwierząt w stanie czuwania należy ograniczyć unieruchomienie głowy do zaledwie kilku godzin jednorazowo, aby zredukować poziom stresu. Pomiędzy sesjami obrazowania należy umieścić zwierzę z powrotem w jego klatce domowej, aby miało dostęp do pokarmu i wody. Potencjalny stres minimalizuje się poprzez przygaszenie świateł w pomieszczeniu oraz osłonięcie części ciała myszy za pomocą obudowy.

  1. Dzień po operacji zamocuj mysz na platformie obrazowej, przykręcając wszczepiony do czaszki metalowy pręt głowowy do ramy stabilizującej głowę.
    Uwaga: Podczas obrazowania budzących się myszy sesja obrazowania nie powinna trwać dłużej niż kilka godzin ze względu na potencjalny stres wywołany przez urządzenie do stabilizacji głowy.
  2. Umieść platformę obrazową z myszą o unieruchomionej głowie w mikroskopie dwufotonowym wyposażonym w obiektywy immersyjne wodne 10X (NA 0,30) oraz 40X (NA 0,80).
  3. Włóż kostkę filtracyjną do obrazowania FRET (eCFP i Citrine), która posiada lustro dichroiczne o długości fali 505 nm oraz filtry przepustowe w zakresie od 460 nm do 500 nm do pomiaru eCFP oraz od 520 nm do 560 nm do pomiaru Citrine.
  4. Do dołka zawierającego okno z pocienioną czaszką należy dodać ACSF, a następnie wprowadzić obiektyw immersyjny do ACSF. Przy użyciu okularu, lampy rtęciowej oraz kostki filtrującej GFP należy zlokalizować powierzchnię kory oraz naczynia krwionośne znajdujące się pod oknem.
    Uwaga: Układ naczyń krwionośnych pomaga zlokalizować i zobrazować ten sam obszar podczas wielodniowych, powtarzalnych sesji obrazowania. Przełącz na obiektyw imersyjny wodny 40X, aby zlokalizować CNiFERy, ustawiając ostrość ręcznie na powierzchni kory nad komórkami przy użyciu kostki filtru GFP i lampy rtęciowej.
  5. Konfiguracja obrazowania dwufotonowego. Wybrać odpowiednią drogę optyczną dla obrazowania dwufotonowego. W przypadku typowego systemu komercyjnego należy użyć oprogramowania, aby przełączyć się w tryb obrazowania dwufotonowego i przekierować światło do fotopowielaczy (PMT) w detektorach niedeskanowanych. Włączyć laser femtosekundowy impulsowy z bliskiej podczerwieni, wybrać długość fali 820 nm oraz ustawienie mocy 5-15%. Uwaga: moc 5% zazwyczaj zapewnia moc ok. 25 mW w miejscu próbki.
  6. Ustaw PMT1 & napięcie PMT2 bliskie wartości maksymalnej, zazwyczaj 700-1000 V w zależności od PMT. Ustaw wzmocnienie (gain) na 1 dla każdego kanału następnie wyzeruj pozycję z obiektywu.
  7. Obniżyć obiektyw do poziomu ~100–200 μod powierzchni kory i rozpocznij skanowanie w płaszczyźnie x-y. Dostosuj moc lasera, wzmocnienie oraz napięcie PMT dla każdego kanału, tj., eCFP i Citrine, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu fluorescencji CNiFER.
  8. Użyj funkcji powiększania w oprogramowaniu, aby ograniczyć obraz do obszaru zawierającego komórki CNiFER oraz obszaru tła. Zastosuj częstotliwość skanowania nie mniejszą niż jedna klatka co 2 s (0,5 Hz) przy 4 μna piksel. Dostosuj uśrednianie linii w celu uzyskania odpowiedniego stosunku sygnału do szumu, np., uśrednianie dwóch linii Kalmanem.
  9. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół komórek z barwnikiem CNiFER, obejmując około 3 do 4 komórek na płaszczyznę. Skonfiguruj analizę średnich intensywności ROI w czasie rzeczywistym. Rozpocznij akwizycję w celu monitorowania fluorescencji CNiFER w czasie.
  10. Rejestruj fluorescencję z CNiFER-ów przed manipulacjami eksperymentalnymi oraz w ich trakcie, np.stymulacja elektryczna, stymulacja ChR2, zachowanie, zgodnie z decyzją użytkownika.
  11. Po zakończeniu eksperymentu obrazowego należy umieścić mysz z powrotem w jej klatce domowej. Obrazowanie można powtarzać w kolejnych dniach, zgodnie z potrzebami. Podczas ponownego obrazowania komórek należy odnieść się do wcześniej wykonanego obrazu unaczynienia przy niskim powiększeniu, aby powrócić do tego samego pola widzenia (krok 10.4).
    Uwaga: Implantowane sensory CNiFER mogą być obrazowane przez co najmniej 7 dni.

11. Analiza danych

  1. Otwórz plik obrazowania i wybierz obszary zainteresowania (ROI) dla CNiFERs oraz jeden ROI dla tła. Wybierz opcję „series analysis” dla obu kanałów każdego ROI. Eksportuj średnią intensywność fluorescencji dla każdego ROI do pliku z rozdzielaczem tabulatorów.
  2. Użyj programu do obliczeń matematycznych (patrz Materiały), aby przeanalizować wartości fluorescencji. Zastosuj filtr dolnoprzepustowy (0,3 Hz) dla każdego sygnału, a następnie odejmij fluorescencję tła w każdym ROI od intensywności fluorescencji eCFP i Citrine.
  3. Oblicz średnią fluorescencję dla linii bazowej i oblicz stosunki zgodnie z Równaniem 1, aby zmierzyć stosunek FRET ΔR(t)/R.
  4. Aby określić czułość CNiFERs, wykreśl stosunek FRET jako funkcję logarytmu stężenia agonisty. Dopasuj dane za pomocą równania Hilla, aby wyznaczyć EC50 oraz współczynnik Hilla (n), wykorzystując statystyczne oprogramowanie naukowe i Równanie Hilla (Równanie 2).

figure-protocol-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

CNiFER jest pochodną ludzkiej komórki nerki zarodkowej (HEK293), która została zmodyfikowana tak, aby stabilnie ekspresować co najmniej dwa białka: specyficzny receptor sprzężony z białkiem G (GPCR) oraz genetycznie kodowany sensor [Ca2+], TN-XXL. TN-XXL ulega transferowi energii fluorescencji (FRET) pomiędzy cyjanową a żółtą białkami fluorescencyjnymi, odpowiednio eCFP i Citrine, w odpowiedzi na jony Ca2+6,15. Aktywacja receptorów GPCR sprzężonych z endog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stworzenie CNiFERs zapewnia innowacyjną i unikalną strategię optycznego pomiaru uwalniania neuroprzekaźników w mózgu in vivo. CNiFER idealnie nadają się do pomiaru uwalniania pozasynaptycznego, tj. przewodzenia objętościowego dla neuroprzekaźników. Co ważne, każdy CNiFER posiada właściwości natywnego GPCR, zapewniając fizjologiczny optyczny pomiar zmian poziomu neuroprzekaźników w mózgu. Do tej pory stworzono CNiFER do wykrywania acetylocholiny (M1-CNiFER)6, dopaminy (D2-CNiFER)7 i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy B. Conklinowi (University of California, San Francisco) za dostarczenie cDNA Gqi5 i Gqs5, A. Schweitzerowi za pomoc w elektronice, N. Taylorowi za pomoc w badaniach przesiewowych klonów, Ianowi Glaaserowi i Robertowi Rifkinowi za korektę oraz Olivierowi Griesbeckowi za TN-XXL. Prace te były wspierane przez granty badawcze za pośrednictwem amerykańskiego Narodowego Instytutu ds. Nadużywania Narkotyków (NIDA) (DA029706; DA037170), Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) oraz grant szkoleniowy "Neuroscience Related to Drugs of Abuse" za pośrednictwem NIDA (DA007315).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro System BiosciencesCD510B-1Klonowanie: do generowania lentiwirusa
12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polipropylenowa probówka z okrągłym dnemBD Biosciences352063FACS
BD 40 um Sitka do komórek FalconaBD Biosciences352340FACS
0,05% Trypsyna EDTA Invitrogen25200056FACS
96, płaska denna, przezroczysta Corning 3596FACS
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych Corning CLS3997Flexstation
Optilux przezroczysty spód Corning 3603Flexstation
Końcówki do pipet FlexstationUrządzenia molekularne9000-0911Flexstation
Chlorek acetylocholiny   Sigma-AldrichA2661Flexstation
Noradrenalina   Sigma-AldrichA7256Flexstation
Chlorowodorek dopaminy   Sigma-AldrichPHR1090Flexstation
GABA   Sigma-AldrichA2129Flexstation
Histamina   Sigma-AldrichH7125Flexstation
Glutaminian    Sigma-Aldrich49621Flexstation
Epinefryna   Sigma-AldrichE4642
Somatostatyna Flexstation     Sigma-AldrichS1763Flexstation
5HT     Sigma-AldrichH9523Flexstation
VIP Alpha Diagnostics Inc.     SP-69627Flexstation
Orexin AAlpha Diagnostics Inc.     12-p-01Substancja Flexstation
P   Sigma-AldrichS6883Flexstation
AdenozynaSigma-AldrichA4036Flexstation
Melatonina Sigma-AldrichM5250CFlexstation
Czytnik i oprogramowanie płytek fluorescencyjnychUrządzenia molekularneFlexstation 3Flexstation
  DMEM (wysoka glukoza) z Glutamax   Life Technologies10569-010Hodowla tkankowa
  Surowica bydlęca płoduLife Technologies10082-139Hodowla tkankowa
  Długopis/paciorkowiec  antybiotykiLife Technologies15140-122Hodowla tkankowa
  Puromycyna   InvivoGenant-pr-1Hodowla tkankowa
  Fibronektyna Sigma-AldrichF0895Hodowla tkankowa
CoolCell LX Bezalkoholowe pudełko do zamrażania komórek o kontrolowanej dawceBioexpressD-3508)do hodowli tkankowych
 LoctiteLoctite nr 495chirurgia i stereotaksja iniekcyjna folia
parafinowa z tworzywa sztucznego VWRParafilm®chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
NanowtryskiwaczDrummond3-000-204chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Elektrody szklaneDrummond3-000-203Gchirurgia i iniekcja stereotaktyczna
wiertarka ręcznaOSADAExl-M40chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Frezy do wiertarkiFine Scientific19007-05; 19007-07)chirurgia i iniekcja
stereotaktycznaKąpiel sterylizującaFST18000-45, sterylizator gorących kulekchirurgia i stereotaktyczny
wtrysk komora/maska izofluranowaMedical Equipment564-0427, HME 109 Stołowa maszyna anestezjologiczna z parownikiem izofluranu, przepływomierzem O2, zaworem gangowym; 564-0852, Komora indukcyjna Chirurgia 16X7X7,5cmi iniekcja stereotaktyczna
Luneta 3D z ramieniemOperacja Zeissi iniekcja stereotaktyczna
światłowodowymi iniekcja stereotaktyczna
Betadine chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
70 % (v/v) chirurgia alkoholemi iniekcja stereotaktyczna Podkładki
przygotowawcze powidonowo-jodowedynarex1108i iniekcja stereotaktyczna
NaCl 0,9% (wstrzyknięcie, USP, 918610)chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
CYKLOSPORYNA (INIEKCJA, USP)chirurgia i stereotaktyczne wstrzyknięcie
Buprenex (wstrzyknięcie) buprenorfina (0,03 μ g za g gryzonia)Chirurgia Sigma-Aldrichai iniekcja stereotaktyczna
Maść okulistyczna AkornNDC 17478-235-35chirurgia i iniekcja stereotaktyczna Chirurgia
SurgifoamEthiconi iniekcja stereotaktyczna
Cement dentystyczny GripDentsply#675571,chirurgia 675572 i iniekcja stereotaktyczna
Instant SuperGlue NDindustrieschirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Chirurgia LOCTITE 4041i iniekcja stereotaktyczna
METABONDC& Bchirurgia i iniekcja stereotaktyczna
nr 0 szkło nakrywkoweChirurgia Fisherai stereotaktyczny zastrzyk stereotaktyczny
rama Chirurgia Kopfi wstrzyknięcie stereotaktyczne
Sonda doodbytnicza i poduszka grzewczaFHC40-90-8D, regulator temperatury DC, 40-90-2-06, podkładka grzewcza 6,5X9,5 cm40-90-5D-02, termistor doodbytniczyOperacja sondy i stereotaktyczny wtrysk
optyczna płytka stykowa do obrazowaniaChirurgia Thorlabsi iniekcja stereotaktyczna
Olej mineralnyFisherS55667chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Kwik-Cast (elastomer silikonowy)World Precision Instrumentsi iniekcja stereotaktyczna
Szew   Etyka18' ', 1667, 4-0chirurgia i stereotaktyczne
nożyczkiiniekcyjne Fine Scientific Tools91500-09, 15018-10chirurgia i stereotaktyczne iniekcje
ForceptsFine Scientific Tools11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10chirurgia i wstrzyknięcie stereotaktyczne
Student Halsted-Mosquito HemostatsFine Scientific Tools91308-12chirurgia i wstrzyknięcie stereotaktyczne
Zestaw kauteryzatora małych naczyńFine Scientific Tools18000-00chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Sterylizatory z gorącymi kulkamiFine Scientific Tools18000-45chirurgia i iniekcja
stereotaktycznaFuterał na instrumenty z matą silikonowąFine Scientific Tools20311-21chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Plastikowe pojemniki do sterylizacji z matą silikonowąFine Scientific Tools20810-01chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Zakres fluorescencji 2P o stałym stopniu do obrazowania in vivoOlympusFV1200 MPEObrazowanie in vivo
LaserwielofotonowySpectraPhysicsMai Tai DeepSeeObrazowanie in vivo
Zielony laserOlympus473 nm Laseroweobrazowanie in vivo
baza translacyjna xyScientificaMMBPdo obrazowania in vivo
Fret do YFP i CFPOlympus do obrazowania in vivo
obrazowania in vivo
Obrazowanie in vivoNewport
zamówienie Światłoszczelna klatkaThorlabobrazowanie in vivo
Płytka studzienkowa Klej cyjanoakrylowy Highland chirurgia światłem izopropylowym Chirurgia Chirurgia Obiektywy zanurzeniowe 10x i 40x Olympus Stół powietrzny do zbudowane na

Bibliografia

  1. Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
  2. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
  3. Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
  4. Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
  5. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
  6. Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
  7. Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998(2012).
  9. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
  10. Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
  11. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
  12. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
  13. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
  14. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
  15. Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519(2011).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  17. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
  18. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  19. Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Detekcja neurotransmiterówreceptory GPCRczujnik wapnia FRETkomórki HEK293infekcja lentiwirusemanaliza FACSkrzywa zależności dawka-odpowiedźiniekcja in vivoobrazowanie dwufotonowe
Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.