Method Article

Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo

DOI:

10.3791/53290

⸱

May 12th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Physics, University of California, San Diego, 3Section of Neurobiology, University of California, San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do tworzenia komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFERs) do optycznego wykrywania wolumetrycznego uwalniania neuroprzekaźników.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórkowe neuroprzekaźniki fluorescencyjne (CNiFERs) dostarczają neurobiologom nowego narzędzia do optycznego wykrywania uwalniania neuroprzekaźników w mózgu in vivo. Specyficzny CNiFER jest tworzony z ludzkiej embrionalnej komórki nerkowej, która stabilnie wyraża specyficzny receptor sprzężony z białkiem G, który łączy się z białkami Gq / 11 G, oraz detektor Ca2 + oparty na FRET, TN-XXL. Aktywacja receptora prowadzi do wzrostu sygnału FRET. CNiFER mają czułość nM i czasową reakcję wynoszącą sekundy, ponieważ klon CNiFER wykorzystuje natywny receptor dla określonego neuroprzekaźnika, np. D2R dla dopaminy. CNiGFER są bezpośrednio wszczepiane do mózgu, co umożliwia im wykrywanie uwalniania neuroprzekaźników z rozdzielczością przestrzenną mniejszą niż sto μm, co czyni je idealnymi do pomiaru transmisji objętościowej in vivo. CNiGFER mogą być również wykorzystywane do badań przesiewowych innych leków pod kątem potencjalnej reaktywności krzyżowej in vivo. Niedawno rozszerzyliśmy rodzinę CNiGFER o GPCR, które łączą się z białkami Gi/o G. CNiFER są dostępne do wykrywania acetylocholiny (ACh), dopaminy (DA) i noradrenaliny (NE). Biorąc pod uwagę, że każdy GPCR może być użyty do stworzenia nowego CNiFER i że w ludzkim genomie znajduje się około 800 GPCR, opisujemy tutaj ogólną procedurę projektowania, realizacji i testowania dowolnego typu CNiFER.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby w pełni zrozumieć, jak neurony komunikują się w mózgu, konieczne jest posiadanie metody pomiaru uwalniania neuroprzekaźników in vivo. Istnieje kilka dobrze znanych technik pomiaru neuroprzekaźników in vivo. Jedną z powszechnie stosowanych technik jest mikrodializa, w której kaniulę wprowadza się do mózgu, a niewielką objętość płynu mózgowo-rdzeniowego pobiera się i analizuje za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i detekcji elektrochemicznej1. Mikrodializa posiada rozdzielczość przestrzenną rzędu kilku średnic sondy, np. ~0,5 mm dla mikrosondy o średnicy 200 μm. Rozdzielczość czasowa tej techniki jest jednak powolna ze względu na interwały próbkowania, które zwykle trwają ~5 minut lub dłużej1. Co więcej, analizy nie są wykonywane w czasie rzeczywistym. Inną techniką jest szybka skaningowa woltamperometria cykliczna (FSCV), która wykorzystuje sondę z włókna węglowego, która jest wprowadzana do mózgu. FSCV charakteryzuje się doskonałą rozdzielczością czasową (subsekunda), wysoką czułością (nanomolowa) i rozdzielczością przestrzenną przy średnicach sondy od 5 do 30 μm. Jednak FSCV jest ograniczony do przetworników, które wytwarzają charakterystyczny profil utleniania i redukcji z napięciem na węglowej sondzie potencjometrycznej2.

Trzecią techniką pomiaru neuroprzekaźników jest bezpośrednio za pomocą genetycznie kodowanych biosensorów neuroprzekaźników (NT)3. Dzięki tej metodzie tworzy się białko fuzyjne, które zawiera domenę wiążącą ligand dla nadajnika sprzężonego z parą fluoroforów4 opartą na rezonansie fluorescencyjnym (FRET) lub permutowanym GFP5. W przeciwieństwie do poprzednich dwóch metod, te bioczujniki są genetycznie kodowane i ulegają ekspresji na powierzchni komórki gospodarza, takiej jak neuron, poprzez produkcję zwierząt transgenicznych lub w ostrym stopniu przy użyciu czynników wirusowych do infekowania komórek. Do tej pory genetycznie kodowane bioczujniki zostały opracowane tylko do wykrywania glutaminianu i GABA3-5. Ograniczeniami w stosowaniu tych technik była niska czułość w zakresie nM oraz niemożność rozszerzenia detekcji na dużą liczbę przekaźników, np. klasycznych neuroprzekaźników, neuropeptydów i neuromodulatorów, które sygnalizują za pośrednictwem receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). W rzeczywistości w ludzkim genomie znajduje się prawie 800 GPCR.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy innowacyjne narzędzie do optycznego pomiaru uwalniania każdego neuroprzekaźnika, który wysyła sygnał przez GPCR. CNiFER (cell-based neurotransmitter fluorescent engineered reporters) to klonalne komórki HEK293 zaprojektowane do ekspresji specyficznego GPCR, który po stymulacji wyzwala wzrost wewnątrzkomórkowego [Ca2 +], który jest wykrywany przez genetycznie kodowany czujnik Ca2 + oparty na FRET, TN-XXL. W ten sposób CNiFER przekształcają wiązanie receptora neuroprzekaźnika w zmianę fluorescencji, zapewniając bezpośredni i optyczny odczyt w czasie rzeczywistym lokalnej aktywności neuroprzekaźników. Wykorzystując natywny receptor dla danego neuroprzekaźnika, CNiFER zachowują specyficzność chemiczną, powinowactwo i dynamikę czasową endogennie wyrażanych receptorów. Do tej pory stworzyliśmy trzy rodzaje CNiFER, jeden do wykrywania acetylocholiny za pomocą receptora M1, jeden do wykrywania dopaminy za pomocą receptora D2 i jeden do wykrywania noradrenaliny za pomocą receptora α1a6,7. Technologia CNiFER jest łatwo rozbudowywalna i skalowalna, dzięki czemu jest kompatybilna z każdym typem GPCR. W tym artykule JoVE opisujemy i ilustrujemy metodologię projektowania, realizacji i testowania CNiFER in vivo dla dowolnego zastosowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu są zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) i zostały zatwierdzone przez IACUC w Icahn School of Medicine w Mount Sinai i Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego.

1. Generuj lentiwirusa z ekspresją GPCR do transformacji komórek HEK293

  1. Uzyskać cDNA dla określonego GPCR ze źródła komercyjnego, np. cdna.org. Alternatywnie, amplifikacja genu GPCR z biblioteki cDNA za pomocą PCR. Uzyskaj wektor wykazujący ekspresję lentiwirusa, taki jak pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Użyj tego wektora do rozmnażania DNA, a także do generowania lentiwirusa.
  2. Sklonuj cDNA GPCR do wektora eksprymującego lentiwirusa metodą PCR. Zobacz Lorenz8, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat subklonowania PCR.
  3. Rozszerz i oczyść DNA GPCR-pCDH za pomocą wolnego od endotoksyn zestawu przygotowawczego "maxi" zgodnie z instrukcjami producenta. Potwierdź, że cDNA GPCR sklonowane do pCDH jest wolne od mutacji przez sekwencjonowanie DNA.
    Uwaga: Przed przekazaniem DNA do produkcji wirusa należy strawić podwielokrotność za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, aby potwierdzić wielkość wstawki i czystość DNA.
  4. Wygeneruj lentiwirusa za pomocą głównego obiektu wirusowego, takiego jak jeden w The Salk Institute, University of Penn., University of Penn., University of North Carolina itp., lub wygeneruj we własnym zakresie9. Użyć około 25 μg (>1 μg/μl) DNA wolnego od endotoksyn do transfekcji komórek HEK w kolbie T75. Upewnij się, że DNA jest o wysokiej czystości, o współczynniku absorbancji (A260/A280) ~1,8,
    Uwaga: Miana wirusa ~1011-10 12 GC/ml są optymalne do transdukcji komórek HEK293.

2. Wybór typu komórki szkieletowej HEK293/TN-XXL do hodowli in vitro

Uwaga: Należy określić specyficzność sprzężenia białka G, np. białka Gi/o, Gq/11 lub Gs G, GPCR, ponieważ decyduje to o tym, czy chimera białka G jest potrzebna dla CNiFER. W przypadku receptorów sprzężonychz G q, np. receptora muskarynowego M1, wybierz HEK293 / TN-XXL(#3g8) jako typ komórek szkieletowych HEK293. W przypadku receptorów sprzężonychz G i/o potrzebne jest chimeryczne białko GQi5 10. W przypadku receptora sprzężonegoz G s potrzebna jest chimera Gqs5 10. W tym protokole jako przykład użyto konstrukcji D2R CNiFER. D2R sygnalizuje przez białka Gi/o G i wymaga komórek HEK293, które stabilnie eksprymują chimeryczne białko G, Gqi5, np. HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6.

  1. Uzyskaj komórki klonalne HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6 z laboratorium badawczego. Uwaga: Następujące komórki klonalne, HEK293 / TN-XXL(#3g8) dla receptorów sprzężonychz G q, HEK293 / TN-XXL / Gqi5 (#qi5.6) dla receptorów sprzężonych Gi / o i HEK293 / TN-XXL / Gqs5 (#qs5.47) dla receptorów sprzężonych z Gs, są swobodnie dostępne na żądanie6,7.
  2. Hoduj i rozszerzaj HEK293/TN-XXL/Gqi5_#qi5.6 do ~90% konfluencji w kolbie T25 z 5 ml pożywki wzrostowej HEK293 (Tabela 1). Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2,
    Uwaga: Wszystkie prace z hodowlą komórek HEK293 powinny być wykonywane przy użyciu standardowych sterylnych technik hodowli tkankowych.
  3. Zebrać komórki HEK293 przez pierwsze zasysanie pożywki z kolby T25. Delikatnie przemyć komórki, dodając 5 ml PBS i kolbę kołyszącą.
  4. Usunąć PBS i dodać 1 ml 0,05% (w/v) trypsyny/EDTA (Tabela 2). Inkubować przez 1 do 2 minut w temperaturze 37°C z 5% (v/v) CO2 .
  5. Zebrać komórki i przenieść do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 1 000 x g w wirówce do hodowli komórkowych. Odessać supernatant.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej HEK293. Policz komórki w hemocytometrze za pomocą błękitu trypanowego. Oblicz gęstość komórek i przejdź do kroku 3.

3. Transdukcja wirusowa komórek HEK293/TN-XXL/Gqi5

  1. Wysiewaj kolbę T25 z0,7 x 10 6 komórkami HEK293 / TN-XXL / Gqi5. Hoduj komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 aż do ~50% konfluencji, po około 1 dniu. Zamroź pozostałe komórki (kroki 8.2-8.3). Ogniwa te będą służyć jako kontrola CNiFER, tj. CNiFER, który nie ma GPCR.
  2. W dniu zakażenia rozcieńczyć GPCR wykazujący ekspresję lentiwirusa (krok 1.4) do końcowego stężenia ~109 GC/ml w całkowitej objętości 2 ml pożywki wzrostowej HEK293 (Tabela 1). Na przykład, dodać 20 μl 1011 GC/ml wirusa do 2 ml pożywki w kolbie T25.
    Uwaga: Informacje o mianie wirusa powinny być dostarczone przez główny ośrodek wirusa. Połączyć lentiwirusa i pożywkę w probówce wirówkowej i delikatnie rozcierać. Wysokie miana lentiwirusa to poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
  3. Odessać pożywkę z kolby T25. Dodać 2 ml mieszaniny wirusa/pożywki z kroku 3.2. Inkubować kolbę T25 O/N w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 .
  4. Po jednym dniu zakażenia odessać mieszaninę wirus/pożywka i zastąpić ją pożywką wzrostową HEK293 zawierającą puromycynę (2 μg/ml; Tabela 1). Puromycyna dokonuje selekcji dla transdukowanych komórek. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 do około 90% konfluencji, po ~1-2 dniach.
  5. Przygotować 96-dołkową płytkę (czarną z przezroczystym dnem) pokrytą fibronektyną w celu wygenerowania 10-punktowej krzywej agonisty/aktywacji w kroku 4.1. W sterylnym kapturze dodać 50 μl fibronektyny (5 μg/ml) na studzienkę w rzędach A i B płytki 96-dołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Płukać dwa razy przez 5 minut na płukanie za pomocą PBS. Dodać 50 μl pożywki wzrostowej HEK293 i inkubować O/N w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 .
    Uwaga: Płytki nasączone fibronektyną są dostępne w handlu.
  6. Pobrać komórki z kolby T25 zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.6 (Tabela 2).
  7. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej HEK293. Wysiewać kolbę T25 z 1,5 ml komórek do analizy FACS. Również wysiać kolbę T75 z 1 ml komórek do zamrażania i przechowywania (patrz kroki 8.2-8.3)
  8. W przypadku 10-punktowej krzywej agonisty wysiewaj pierwsze dwa rzędy (A i B) 96-dołkowej płytki pokrytej fibronektyną (od kroku 3.5) ze 100 μl zawiesiny komórek na basenik.
  9. Inkubować komórki HEK293 rosnące w kolbie T25, kolbie T75 i 96-dołkowej płytce do około ~90% konfluencji w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2, po ~1-2 dniach.

4. FACS i izolacja pojedynczych klonów CNiFER

  1. Użyj płytki 96-dołkowej do wygenerowania 10-punktowej krzywej aktywacji agonisty.
    Uwaga: Przed rozpoczęciem analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) ważne jest, aby potwierdzić ekspresję GPCR poprzez testowanie transdukowanych komórek pod kątem odpowiedzi agonistycznej (10-punktowa krzywa agonistyczna). Test ten przeprowadza się za pomocą czytnika płytek fluorometrycznych.
    1. Przygotuj płytkę leku dla 10-punktowej krzywej aktywacji agonisty. Wybierz 10 różnych stężeń agonistów, które mieszczą się w przewidywanym EC50, które można określić na podstawie literatury.
      Uwaga: Tabliczka leku zawiera 3-krotność każdego stężenia (w dwóch egzemplarzach) w celu dostosowania do rozcieńczenia 1:3 na płytce CNiFER. Na przykład płytka lekowa do badania D2 CNiFER zawiera 10 różnych stężeń dopaminy w 3-krotnych stężeniach; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 i 1,000 nM. W płytce CNiFER końcowe stężenia dopaminy wynoszą zatem 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7 i 333 nM.
    2. Przygotować roztwory agonistów przy użyciu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) (Tabela 1). Użyj dwóch studzienek dla "ACSF", np. A1 i A2, oraz dwóch dołków dla "bez komórek", np. B1 i B2.
      Uwaga: Przygotuj różne stężenia leków metodą seryjnego rozcieńczania. Utwórz szablon do śledzenia klonów CNiFER i stężeń leków (rysunek 3).
    3. Użyj oprogramowania, aby zaprogramować 96-dołkowy czytnik płytek fluorometrycznych do pomiaru FRET i wykonywania transferów roztworu.
      1. Ustawić temperaturę czytnika płytek na 37 °C.
      2. Do pomiaru FRET za pomocą TN-XXL należy ustawić długość fali wzbudzenia na 436 ± 4,5 nm (środek ± HWHM). Ustaw filtry emisji na 485 ± 7,5 nm dla eCFP i na 527 ± 7,5 nm dla cytrynu. Ustaw filtr odcinający na 475 i 515 nm odpowiednio dla eCFP i cytrynu.
      3. Zaprogramuj czytnik płytek tak, aby mierzył emisję przy 485 nm i 527 nm co 4 sekundy, co daje łącznie 180 sekund. Wybierz opcję dostarczania 50 μl z 3-krotnej płytki leku do 100 μl na płytce CNiFER, po zebraniu 30 sekund fluorescencji wyjściowej.
    4. Odessać pożywkę z rzędów A i B i dodać 100 μl ACSF do 96-dołkowej płytki CNiFER, która jest w ~90% zlewająca się (krok 3.9).
    5. Załadować 96-dołkową płytkę CNiFER i "3-krotną" płytkę leku do czytnika płytek. Odczekać ~30 minut, aby zrównoważyć płytki w temperaturze 37 °C. Następnie uruchom program.
    6. Aby przeanalizować dane czytnika płytek, wyeksportuj wartości fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego. Utwórz wzór na odjęcie pomiarów tła (wykonanych dla każdego sygnału ze studni bez komórek) od studni z CNiFER. Znormalizuj intensywność fluorescencji do linii podstawowych przed bodźcem, FCytryn(t)/FCytryn(linia podstawowa) i oblicz stosunek FRET (ΔR/R; Równanie 1) przy użyciu odpowiedzi szczytowych przy emisjach 527 nm i 485 nm (patrz krok 11).
      Uwaga: Jeśli nastąpi znacząca zmiana ΔR/R z agonistą, oznacza to ekspresję GPCR i można przejść do analizy FACS (krok 4.2). Jeśli nie ma odpowiedzi FRET z agonistą, rozwiąż problem za pomocą jonoforu Ca2+, np. A21387, aby przetestować odpowiedź Ca2+ i potwierdzić, że czujnik oparty na FRET działa. Jeśli jonofor działa, oznacza to, że receptor prawdopodobnie nie uległ ekspresji.
  2. W dniu poprzedzającym FACS należy przygotować cztery 96-dołkowe płytki pokryte fibronektyną (patrz krok 3.5) w celu zebrania posortowanych komórek. Dodać 50 μl pożywki wzrostowej HEK293 i inkubować O/N w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 .
  3. Przygotować 5% (w/v) BSA w PBS (5 g/100 ml) i przefiltrować (0,2 μm) do sterylnej butelki.
  4. Zebrać komórki wyhodowane w kolbie T25 (patrz kroki 2.3-2.5, Tabela 2). Zawiesić osad komórkowy w 4 ml 5% (w/v) BSA w PBS. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut.
  5. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w ~5 ml 5% (w/v) BSA w PBS, aby uzyskać końcowe stężenie ~5 x 106 komórek/ml.
    Uwaga: Skontaktuj się z głównym obiektem FACS, aby uzyskać szczegółowe wymagania dotyczące gęstości komórek i warunków sortowania.
  6. Przefiltruj zawieszone komórki za pomocą sitka o wielkości 40 μm, aby usunąć grudki. Przenieść komórki do probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polipropylenu. Umieść probówkę na lodzie w celu transportu do placówki FACS.
  7. Posortuj transdukowane komórki HEK293 w placówce FACS. Zaprogramuj parametry na cytometrze przepływowym FACS w następujący sposób: ustaw 4 °C dla uchwytu próbki, 100 μm dla dyszy i 20 psi. Na podstawie analizy wstępnego sortowania wybierz komórki, tj. wybierz "bramkę", która ma dużą fluorescencję eCFP (wzbudzenie eCFP, emisja eCFP) i dużą fluorescencję FRET (wzbudzenie eCFP, emisja cytrynu) (patrz wyniki poniżej, rysunek 2).
  8. Umieść pojedyncze, posortowane komórki na 96-dołkowej płytce przygotowanej w kroku 4.2, z jednym klonem na studzienkę zawierającą 50 μl pożywki wzrostowej HEK293 z puromycyną. Dodać 50 μl pożywki wzrostowej HEK293 z puromycyną (Tabela 1), co daje w sumie 100 μl na studzienkę. Utrzymywać komórki w temperaturze O/N na poziomie 37 °C przy 5 % (v/v) CO2,
    Uwaga: Pożywka wzrostowa HEK293 zawiera puromycynę do selekcji transdukowanych komórek.

5. Hodowla i ekspansja sortowanych, klonalnych CNiFER

  1. Utrzymuj CNiFER w 96-dołkowych płytkach, usuwając 50 μl starych pożywek z każdej studzienki i zastępując je 50 μl świeżych pożywek wzrostowych HEK293 zawierających puromycynę (Tabela 1). Powtarzaj to co 5 do 7 dni, aż do ~90% zlewu, po 2-3 tygodniach.
  2. Komórki CNiFER należy pobrać poprzez delikatne zasysanie pożywki i jednokrotne delikatne płukanie za pomocą PBS. Usunąć PBS i dodać 20 μl 0,05% (w/v) trypsyny/EDTA. Inkubować przez 1 do 2 minut w temperaturze 37°C z 5% (v/v) CO2 .
  3. Dodaj 100 μl pożywki wzrostowej HEK293 do komórek potraktowanych trypsyną i ponownie zawieś komórki. Przenieść zawartość na 24-dołkową płytkę zawierającą 400 μl świeżej pożywki wzrostowej HEK293 z puromycyną. Na 24-dołkowej płytce utrzymuj komórki, wymieniając 250 μl pożywki wzrostowej HEK293 co 5-7 dni, aż studzienki będą zlewać się w ~90%.

6. Identyfikacja potencjalnych CNiFER na podstawie odpowiedzi FRET za pomocą czytnika płytek fluorometrycznych

Uwaga: Z czterema 96-dołkowymi płytkami po FACS, powinno być >100 testowalnych klonów, które przetrwają i rozwiną się do etapu płytki 24-dołkowej, ponieważ wiele oryginalnych klonów nie rośnie. Aby zidentyfikować potencjalne CNiFER, należy zastosować 3-punktową analizę odpowiedzi FRET z pokrewnym agonistą, np. dopaminą dla D2R.

  1. Gdy komórki są w ~90% zlewające się z 24-dołkową płytką, delikatnie zassaj pożywkę. Dodać ~100 μl 0,05% (w/v) trypsyny/EDTA i inkubować przez 1-2 minuty w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 . Dodaj 400 μl pożywki wzrostowej HEK293 do komórek potraktowanych trypsyną i wymieszaj komórki przez delikatne rozcieranie.
  2. Ustaw 3-punktową krzywą agonistyczną do wstępnego badania przesiewowego klonów. Dla każdego klonu CNiFER, tj. jednego z dołków z płytki 24-dołkowej, należy podwielokrotność 100 μl zawiesiny komórek (~4 x 103 komórek/basenik) do każdej z trzech studzienek, np. A1, A2, A3, z 96-dołkowej płytki pokrytej fibronektyną (czarnej z przezroczystym dnem) (patrz krok 3.5).
  3. Przenieś pozostałe ~200 μl zawiesiny komórek na 12-dołkową płytkę zawierającą 1,000 μl pożywki wzrostowej HEK293 (1,2 ml końcowej objętości). Inkubować obie płytki w temperaturze 37 °C z 5% (v/v) CO2 , aż do ~90% konfluencji. Płytka 96-dołkowa służy do testu fluorometrycznego, a płytka 12-dołkowa służy do hodowli i ekspansji klonów.
  4. W przypadku analizy 3-punktowej należy określić trzy różne stężenia agonisty, które są 0,1-, 1,0- i 10-krotnie wyższe niż EC50 dla określonego GPCR. Przygotować stężenia agonistów na płytce leku, jak opisano w krokach 4.1.1-4.1.2. Wykonać test z czytnikiem płytek fluorometrycznych zgodnie z opisem w krokach 4.1.3-4.1.5.
  5. Obliczyć współczynnik BRET (ΔR/R) zgodnie z opisem w kroku 4.1.6. Wybierz CNiFER, które mają odpowiednią czułość i największą odpowiedź FRET dla rozszerzania, zamrażania wstecznego i bardziej kompleksowych analiz (krok 7).
  6. W przypadku klonów, które zostały wybrane w kroku 6.5 i rosną na 12-dołkowej płytce, należy usunąć i zastąpić 600 μl pożywki wzrostowej HEK293 co 5 do 7 dni, aż do uzyskania ~90% konfluencji.
  7. Stopniowo rozszerzać klony z płytki 12-dołkowej do płytki 6-dołkowej, a następnie do kolby T25 (kroki 2.3 - 2.6 i Tabela 2). Gdy kolba T25 jest w ~90% zlewana, zbierz komórki zgodnie z opisem (kroki 2.3-2.5). Zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej HEK293.
  8. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do kolby T75 z 9 ml pożywki wzrostowej HEK293. Pozostałe 4 ml zawiesiny komórkowej należy wykorzystać do krioprotekcji i przechowywania w płynieN2 (kroki 8.2-8.3). Przygotuj osiem krioprobówek o pojemności 1,5 ml i umieść je na lodzie.
  9. W kolbie T75 utrzymuj komórki, zastępując pożywkę świeżą pożywką wzrostową HEK293, np. 10 ml co 3-5 dni do uzyskania 70-80% konfluencji, po ~1-2 tygodniach.

7. Ostateczny wybór klonów CNiFER za pomocą czytnika płytek fluorometrycznych

  1. W dniu poprzedzającym test z czytnika płytek:
    1. Zbierz komórki z kolby T75 o sile ~90% konfluentnej (patrz kroki 2.3-2.6, Tabela 2). Wysiewaj 96-dołkową płytkę pokrytą fibronektyną (czarną z przezroczystym dnem) w 5 x 104 / dołek z ~100 μl zawiesiny komórek. Uwaga: Jeden klon jest umieszczany na pojedynczej 96-dołkowej płytce.
  2. Przygotuj płytkę lekową do kompleksowego badania przesiewowego klonów CNiFER, odróżniając specyficzne odpowiedzi agonistyczne od niespecyficznych odpowiedzi CNiFER.
    1. Aby wygenerować pełną krzywą dawka-odpowiedź, należy wybrać 10 różnych stężeń agonistów wokół przewidywanego EC50. Użyj dwóch studzienek dla "braku komórek" i dwóch studzienek dla "ACSF".
    2. Aby określić odpowiedzi niespecyficzne, wybierz trzy stężenia 12 różnych neuroprzekaźników lub modulatorów (72 dołki) (ryc. 3). Podobnie jak agonista, płytka leku zawiera 3-krotne stężenia w dwóch egzemplarzach. Na przykład 100 μl trzech różnych stężeń acetylocholiny, glutaminianu, oreksyny, VIP, adenozyny, serotoniny, noradrenaliny, GABA, substancji P, melatoniny, somatostatyny i histaminy, każdy w 3-krotnym stężeniu 50, 1000 i 3000 nM, jest ładowane do 96-dołkowej płytki leku.
  3. Ustaw parametry na czytniku płytek fluorometrycznych do pomiaru FRET i wykonywania transferów roztworu zgodnie z opisem w krokach 4.1.3-4.1.5.
  4. W celu analizy pełnej krzywej odpowiedzi na dawkę należy obliczyć szczytowy stosunek BRET (ΔR/R) (krok 4.1.6), wykreślić jako funkcję stężenia logarytmu agonisty i dopasować do równania Hilla (krok 11.4). Określ EC50, współczynnik Hilla i maksymalny współczynnik FRET. Dla pozostałych 12 neuroprzekaźników/modulatorów należy wykreślić szczyt ΔR/R w funkcji stężenia leku.
  5. Wybierz ~10 klonów CNiFER, które mają duży współczynnik FRET, odpowiedni EC50 dla pokrewnego agonisty i niewielką lub żadną odpowiedź tła na innych agonistów neuroprzekaźników (odpowiedź niespecyficzna).

8. Zamroź wybrane klony CNiFER

  1. Użyj ~90% zlewającej się kolby T75 z pojedynczego klonu CNiFER. Zbierz komórki zgodnie z opisem (kroki 2.3-2.5, Tabela 2). W przypadku zamrażania komórek należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki wzrostowej HEK293. Oznacz dziesięć krioprobówek o pojemności 1,5 ml i umieść na lodzie.
  2. W celu krioprotekcji należy wymieszać komórki 1:1 z 20% (v/v) DMSO w pożywce wzrostowej HEK293, np. 5 ml mieszaniny 20% (v/v) DMSO/pożywka delikatnie miesza się z 5 ml zawiesiny komórek (końcowe stężenie DMSO wynosi 10%).
  3. Podwielokrotność 1 ml do każdej z krioprobówek. Probówki do zamrażania z komórkami w zamrażarce o temperaturze -80 °C O/N, w pudełku izolowanym pianką (patrz Materiały). Przenieś krioprobówki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

9. Implantacja CNiFER do kory myszy

  1. Przed zabiegiem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Przygotuj półsterylne pole do operacji, przecierając je 70% etanolem i kładąc czystą pieluchę laboratoryjną.
  2. Przygotować pipetę iniekcyjną CNiFER, pociągając szklaną kapilarnę (średnica wewnętrzna 0,53 mm) na pionowym ściągaczu elektrod. Użyj pary kleszczyków z cienką końcówką nr 5, aby złamać końcówkę elektrody do średnicy ~40 μm.
    Uwaga: Najlepiej osiągnąć to pod mikroskopem stereoskopowym z siatką.
  3. Znieczulić dorosłą (60-90 dzień po urodzeniu) mysz C57BL/6 izofluranem: 4% (v/v) w celu indukcji i 1,5 do 2,0% (v/v) w celu leczenia podtrzymującego. Użyj szczypania ogona lub palców, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
    Uwaga: Okresowo ponownie szczypaj i oceniaj drganie wąsów podczas operacji, aby ponownie ocenić głębokość znieczulenia.
  4. Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Zamontuj mysz w stereotaktycznej ramce z nausznikami. Utrzymuj temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej regulowanej sondą doodbytniczą.
  5. Ogol obszar o wymiarach około 5 mm na 12 mm za pomocą golarki elektrycznej dla zwierząt. Nałóż Betadynę, a następnie 70% (v/v) izopropanol. Użyj ostrza skalpela, aby przeciąć i usunąć skórę z powierzchni czaszki. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć okostną z powierzchni czaszki. Odsłoń i oczyść powierzchnię czaszki, zgodnie z opisem dla chirurgii stereotaktycznej11.
  6. Opuść pustą szklaną pipetę do bregmy i zapisz współrzędne przednio-tylne (A/P) i środkowo-boczne (M/L). Odwołując się do atlasu mózgu myszy, oblicz położenie miejsca wstrzyknięcia. Przesunąć pipetę do miejsca docelowego i oznaczyć czaszkę w celu późniejszego uformowania okienka. Patrz Cetin et al., aby uzyskać szczegółowe informacje na temat stereotaktycznych iniekcji gryzoniom11.
    Uwaga: Miejsce wstrzyknięcia i okienko zależą od badanego regionu i rozkładu wypustek uwalniających neuroprzekaźniki lub peptydy w korze mózgowej. Na przykład, w niedawnej publikacji7, współrzędne stereotaktyczne +1,0 do +2,0 mm A/P i +1,0 do +2,0 mm M/L zostały wykorzystane do wstrzyknięcia komórek CNiFER do kory czołowej w celu obrazowania in vivo uwalniania dopaminy podczas warunkowania klasycznego.
  7. Uformuj okienko z porzedzoną czaszką o wymiarach 2 mm x 3 mm, jak opisano wcześniej12,13.
    Uwaga: Kość w oknie powinna mieć grubość 15-20 μm. Małe białe plamki na kości nie powinny być widoczne, gdy powierzchnia czaszki jest zwilżona, jeśli kość jest wystarczająco cieńsza12,13.
  8. Umieść gąbkę nasączoną ACSF na oknie, aby utrzymać ją wilgotną podczas przygotowywania komórek do wstrzyknięcia.
  9. Zbierz klon CNiFER, który był hodowany w kolbie T75 do ~80% konfluencji. Odessać pożywkę i przemyć komórki sterylnym PBS.
    Uwaga: Trypsyna jest pomijana w tych krokach.
  10. Usunąć PBS i użyć 10 ml ACSF w celu usunięcia komórek z dna kolby. Dziel komórki, aby zdysocjować grudki komórek. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 100 μl ACSF. Wirować przez 30 sekund przy 1,400 x g i usunąć supernatant, pozostawiając osad pokryty ACSF. Ten krok pozostawia skupisko komórek w zawiesinie.
  11. Napełnij pipetę iniekcyjną przygotowaną w kroku 9.2 olejem mineralnym, załaduj pipetę do nanowtryskiwacza i przesuń tłok, aby wyrzucić małą kulkę oleju. Umieść 5 μl zawiesiny komórek CNiFER na pasku plastikowej folii parafinowej w pobliżu preparatu myszy. Pobrać komórki CNiFER lub kontrolne CNiFER do wyciągniętej pipety.
  12. Przesuń pipetę do docelowych współrzędnych X i Y, tj. A/P i M/L zanotowanych w kroku 9.5. Opuść pipetę, przebijając przerzedzoną czaszkę i kontynuuj do ~200-400 μm poniżej powierzchni czaszki, aby zdeponować komórki CNiFER w warstwach 2/3 kory.
  13. Wstrzyknąć ~4,6 nl komórek CNiFER w najgłębsze miejsce za pomocą nanoiniektora, zauważyć ruch na granicy faz oleju i komórki, a następnie odczekać 5 minut, aż komórki się rozdzą. Pobrać pipetę ~100 μm i wstrzyknąć kolejne ~4,6 nl komórek CNiFER, odczekać 5 min. Następnie powoli i delikatnie wyjmować pipetę, aby zapobiec cofaniu się CNiFER. Powtórzyć wstrzyknięcie w jedno lub więcej sąsiednich miejsc.
  14. Powtórz kroki iniekcji 9.8-9.12 z kontrolnymi komórkami HEK293 (tj. klonem HEK293 / TN-XXL / Gqi5 bez GPCR). Oddzielić miejsca iniekcji CNiFER i komórek kontrolnych o ~200 μm.
  15. Po zakończeniu implantacji komórek przepłucz okienko cienkiej czaszki za pomocą ACSF i poczekaj, aż czaszka wyschnie. Nałóż kroplę kleju cyjanoakrylowego (patrz Materiały) na okno i szybko umieść wstępnie przyciętą sterylną szklankę nakrywkową na kleju. Delikatnie dociśnij szkło nakrywkowe do czaszki przez kilka sekund. Pozostaw klej do wyschnięcia na 2 minuty12,13.
  16. Uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego cementem dentystycznym i uformuj zagłębienie wokół okna, aby zatrzymać wodę do zanurzenia.
  17. Aby unieruchomić głowę myszy podczas obrazowania, przymocuj specjalnie skonstruowaną pałąk na głowę z niewielką kroplą kleju cyjanoakrylowego za oknem (patrz14, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wymiarów i materiałów). Poczekaj, aż klej dokładnie wyschnie, a następnie dodaj dodatkowy cement dentystyczny, aby jeszcze bardziej wzmocnić specjalnie zbudowaną belkę pod głowę.
  18. Przykryj resztę powierzchni czaszki, z wyjątkiem okna, warstwą cementu dentystycznego. Upewnij się, że krawędzie skóry są pokryte cementem i pozostaw do wyschnięcia na 20 minut.
  19. Po zabiegu należy przerwać podawanie izofluranu i pozostawić mysz na poduszce grzewczej w klatce, aż w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu. Wstrzyknąć 5% (w/v) glukozy w soli fizjologicznej (s.c.) w celu nawodnienia i 0,05 do 0,1 mg/kg buprenorfiny (i.p., natychmiastowe uwalnianie) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
    Uwaga: Aby zminimalizować potencjalną reakcję immunologiczną na ludzkie CNiFER, należy wstrzykiwać myszowi codziennie 20 μl/100 g cyklosporyny (i.p.), zaczynając dzień przed wstrzyknięciem CNiFER.
  20. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej na jedzenie i wodę.

10. Obrazowanie in vivo klonów CNiFER

Uwaga: Obrazowanie na żywo przeprowadza się na myszach przy użyciu mikroskopu dwufotonowego i aparatu mocowanego na głowie. Podczas sesji obrazowania nie jest potrzebne znieczulenie. Podczas obrazowania zwierząt w stanie czuwania ogranicz zagłówek do zaledwie kilku godzin, aby zmniejszyć poziom stresu. Umieść zwierzę w klatce domowej między sesjami obrazowania w celu pobrania jedzenia i wody. Potencjalny stres jest minimalizowany poprzez przyciemnienie świateł w pomieszczeniu i otaczającej części myszy w obudowie.

  1. Następnego dnia po zabiegu zamontuj mysz na platformie obrazowania, przykręcając metalowy pałąk na głowę wszczepiony w czaszkę do ramy mocującej głowę.
    Uwaga: Podczas obrazowania obudzonych myszy sesja obrazowania nie powinna trwać dłużej niż kilka godzin ze względu na potencjalny stres wywołany przez zagłówek.
  2. Umieść platformę obrazowania z myszą z ograniczoną głową w mikroskopie obrazowania dwufotonowego wyposażonym w obiektywy zanurzeniowe 10X (0,30 NA) i 40X (0,80 NA).
  3. Wkładka sześcienna filtra do obrazowania FRET (eCFP i cytryn), która ma zwierciadło dichroiczne przy 505 nm i filtry pasmowo-przepustowe o długości fali od 460 nm do 500 nm do pomiaru eCFP i od 520 nm do 560 nm do pomiaru cytrynu.
  4. Dodaj ACSF do studzienki zawierającej okienko z rozrzedzoną czaszką i opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do ACSF. Użyj okularu w połączeniu z lampą rtęciową i kostką filtra GFP, aby zlokalizować powierzchnię kory i układu krwionośnego poniżej okna.
    Uwaga: Wzór układu naczyniowego pomaga zlokalizować i zobrazować ten sam obszar przez wiele dni obrazowania. Przełącz się na obiektyw 40X zanurzenia w wodzie, aby zlokalizować CNiFER, ręcznie skupiając się na powierzchni kory nad komórkami za pomocą kostki filtra GFP i lampy rtęciowej.
  5. Konfiguracja do obrazowania dwufotonowego. Wybierz odpowiednią ścieżkę światła do obrazowania dwufotonowego. W przypadku typowego systemu komercyjnego należy użyć oprogramowania, aby przełączyć się w tryb obrazowania dwufotonowego i przekierować światło do lamp fotopowielacza (PMT) w detektorach bez deskanowania. Włącz femtosekundowy laser impulsowy w bliskiej podczerwieni, wybierz długość fali 820 nm i ustawienie mocy 5-15%. Uwaga: 5% mocy zwykle zapewnia ~25 mW na próbce.
  6. Ustaw napięcie PMT1 i PMT2 zbliżone do wartości maksymalnej, zwykle 700-1,000 V w zależności od PMT. Ustaw wzmocnienie na 1 dla każdego kanału i wyzeruj pozycję z dla celu.
  7. Opuść obiektyw o ~100 do 200 μm od powierzchni kory mózgowej i rozpocznij skanowanie x-y. Dostosuj moc lasera, wzmocnienie i napięcie PMT dla każdego kanału, tj. eCFP i cytrynu, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu fluorescencji CNiFER.
  8. Użyj funkcji powiększania w oprogramowaniu, aby ograniczyć obraz do regionu zawierającego komórki CNiFER, a także region tła. Szybkość skanowania nie może być mniejsza niż jedna klatka co 2 sekundy (0,5 Hz) przy 4 μs na piksel. Dostosuj uśrednianie linii, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu, np. uśrednianie linii Kalman 2.
  9. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół komórek CNiFER, otaczając około 3 do 4 komórek na płaszczyznę. Skonfiguruj analizę średniej intensywności zwrotu z inwestycji w czasie rzeczywistym. Rozpocznij akwizycję w celu monitorowania fluorescencji CNiFER w czasie.
  10. Zbieraj fluorescencję z CNiFER przed i w trakcie manipulacji eksperymentalnych, np. stymulacji elektrycznej, stymulacji ChR2, zachowania, zgodnie z ustaleniami użytkownika.
  11. Po zakończeniu eksperymentu obrazowego przywróć mysz do jej klatki domowej. Powtarzaj obrazowanie przez kilka dni, zgodnie z potrzebami. Podczas ponownego obrazowania komórki odwołują się do wcześniej uzyskanego obrazu naczyń krwionośnych w małym powiększeniu, aby zorientować się z powrotem w tym samym polu obrazowania (krok 10.4).
    Uwaga: Wszczepione CNiFER można obrazować przez co najmniej 7 dni.

11. Analiza danych

  1. Otwórz plik obrazowania i wybierz ROI dla CNiFER i jeden ROI dla tła. Wybierz "analizę serii" dla obu kanałów każdego zwrotu z inwestycji. Eksportuj średnią intensywność fluorescencji dla każdego ROI jako plik rozdzielany tabulatorami.
  2. Użyj programu matematycznego (patrz Materiały) do analizy wartości fluorescencji. Filtr dolnoprzepustowy (0,3 Hz) dla każdego sygnału, a następnie odejmij fluorescencję tła w każdym ROI od intensywności fluorescencji eCFP i cytrynu.
  3. Obliczyć średnią fluorescencję dla linii podstawowej i obliczyć współczynniki zgodnie z opisem w równaniu 1, aby zmierzyć współczynnik FRET ΔR(t)/R.
  4. Aby określić czułość CNiFER, należy wykreślić stosunek FRET jako funkcję stężenia logarytmicznie agonistycznego. Dopasuj równanie Hilla, aby wyznaczyć EC50 i współczynnik Hilla (n), korzystając z naukowego oprogramowania statystycznego i równania Hilla (równanie 2).

Równania fluorescencji do analizy FRET; Wzór na współczynnik ΔR(t)/R i FRET; diagram edukacyjny.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CNiFER pochodzi z ludzkiej komórki embrionalnej nerki (HEK293), która została zaprojektowana tak, aby stabilnie wyrażać co najmniej dwa białka: specyficzny receptor sprzężony z białkiem G (GPCR) i genetycznie kodowany czujnik [Ca2+], TN-XXL. TN-XXL ulega transferowi energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) między cyjanem i żółtym białkiem fluorescencyjnym, odpowiednio eCFP i cytrynem, w odpowiedzi na jony Ca2+ 6,15. Aktywacja GPCR, które łączą się z endo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzenie CNiFERs zapewnia innowacyjną i unikalną strategię optycznego pomiaru uwalniania neuroprzekaźników w mózgu in vivo. CNiFER idealnie nadają się do pomiaru uwalniania pozasynaptycznego, tj. przewodzenia objętościowego dla neuroprzekaźników. Co ważne, każdy CNiFER posiada właściwości natywnego GPCR, zapewniając fizjologiczny optyczny pomiar zmian poziomu neuroprzekaźników w mózgu. Do tej pory stworzono CNiFER do wykrywania acetylocholiny (M1-CNiFER)6, dopaminy (D2-CNiFER)7 i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy B. Conklinowi (University of California, San Francisco) za dostarczenie cDNA Gqi5 i Gqs5, A. Schweitzerowi za pomoc w elektronice, N. Taylorowi za pomoc w badaniach przesiewowych klonów, Ianowi Glaaserowi i Robertowi Rifkinowi za korektę oraz Olivierowi Griesbeckowi za TN-XXL. Prace te były wspierane przez granty badawcze za pośrednictwem amerykańskiego Narodowego Instytutu ds. Nadużywania Narkotyków (NIDA) (DA029706; DA037170), Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) oraz grant szkoleniowy "Neuroscience Related to Drugs of Abuse" za pośrednictwem NIDA (DA007315).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro System BiosciencesCD510B-1Klonowanie: do generowania lentiwirusa
12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polipropylenowa probówka z okrągłym dnemBD Biosciences352063FACS
BD 40 um Sitka do komórek FalconaBD Biosciences352340FACS
0,05% Trypsyna EDTA Invitrogen25200056FACS
96, płaska denna, przezroczysta Corning 3596FACS
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych Corning CLS3997Flexstation
Optilux przezroczysty spód Corning 3603Flexstation
Końcówki do pipet FlexstationUrządzenia molekularne9000-0911Flexstation
Chlorek acetylocholiny   Sigma-AldrichA2661Flexstation
Noradrenalina   Sigma-AldrichA7256Flexstation
Chlorowodorek dopaminy   Sigma-AldrichPHR1090Flexstation
GABA   Sigma-AldrichA2129Flexstation
Histamina   Sigma-AldrichH7125Flexstation
Glutaminian    Sigma-Aldrich49621Flexstation
Epinefryna   Sigma-AldrichE4642
Somatostatyna Flexstation     Sigma-AldrichS1763Flexstation
5HT     Sigma-AldrichH9523Flexstation
VIP Alpha Diagnostics Inc.     SP-69627Flexstation
Orexin AAlpha Diagnostics Inc.     12-p-01Substancja Flexstation
P   Sigma-AldrichS6883Flexstation
AdenozynaSigma-AldrichA4036Flexstation
Melatonina Sigma-AldrichM5250CFlexstation
Czytnik i oprogramowanie płytek fluorescencyjnychUrządzenia molekularneFlexstation 3Flexstation
  DMEM (wysoka glukoza) z Glutamax   Life Technologies10569-010Hodowla tkankowa
  Surowica bydlęca płoduLife Technologies10082-139Hodowla tkankowa
  Długopis/paciorkowiec  antybiotykiLife Technologies15140-122Hodowla tkankowa
  Puromycyna   InvivoGenant-pr-1Hodowla tkankowa
  Fibronektyna Sigma-AldrichF0895Hodowla tkankowa
CoolCell LX Bezalkoholowe pudełko do zamrażania komórek o kontrolowanej dawceBioexpressD-3508)do hodowli tkankowych
 LoctiteLoctite nr 495chirurgia i stereotaksja iniekcyjna folia
parafinowa z tworzywa sztucznego VWRParafilm®chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
NanowtryskiwaczDrummond3-000-204chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Elektrody szklaneDrummond3-000-203Gchirurgia i iniekcja stereotaktyczna
wiertarka ręcznaOSADAExl-M40chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Frezy do wiertarkiFine Scientific19007-05; 19007-07)chirurgia i iniekcja
stereotaktycznaKąpiel sterylizującaFST18000-45, sterylizator gorących kulekchirurgia i stereotaktyczny
wtrysk komora/maska izofluranowaMedical Equipment564-0427, HME 109 Stołowa maszyna anestezjologiczna z parownikiem izofluranu, przepływomierzem O2, zaworem gangowym; 564-0852, Komora indukcyjna Chirurgia 16X7X7,5cmi iniekcja stereotaktyczna
Luneta 3D z ramieniemOperacja Zeissi iniekcja stereotaktyczna
światłowodowymi iniekcja stereotaktyczna
Betadine chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
70 % (v/v) chirurgia alkoholemi iniekcja stereotaktyczna Podkładki
przygotowawcze powidonowo-jodowedynarex1108i iniekcja stereotaktyczna
NaCl 0,9% (wstrzyknięcie, USP, 918610)chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
CYKLOSPORYNA (INIEKCJA, USP)chirurgia i stereotaktyczne wstrzyknięcie
Buprenex (wstrzyknięcie) buprenorfina (0,03 μ g za g gryzonia)Chirurgia Sigma-Aldrichai iniekcja stereotaktyczna
Maść okulistyczna AkornNDC 17478-235-35chirurgia i iniekcja stereotaktyczna Chirurgia
SurgifoamEthiconi iniekcja stereotaktyczna
Cement dentystyczny GripDentsply#675571,chirurgia 675572 i iniekcja stereotaktyczna
Instant SuperGlue NDindustrieschirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Chirurgia LOCTITE 4041i iniekcja stereotaktyczna
METABONDC& Bchirurgia i iniekcja stereotaktyczna
nr 0 szkło nakrywkoweChirurgia Fisherai stereotaktyczny zastrzyk stereotaktyczny
rama Chirurgia Kopfi wstrzyknięcie stereotaktyczne
Sonda doodbytnicza i poduszka grzewczaFHC40-90-8D, regulator temperatury DC, 40-90-2-06, podkładka grzewcza 6,5X9,5 cm40-90-5D-02, termistor doodbytniczyOperacja sondy i stereotaktyczny wtrysk
optyczna płytka stykowa do obrazowaniaChirurgia Thorlabsi iniekcja stereotaktyczna
Olej mineralnyFisherS55667chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Kwik-Cast (elastomer silikonowy)World Precision Instrumentsi iniekcja stereotaktyczna
Szew   Etyka18' ', 1667, 4-0chirurgia i stereotaktyczne
nożyczkiiniekcyjne Fine Scientific Tools91500-09, 15018-10chirurgia i stereotaktyczne iniekcje
ForceptsFine Scientific Tools11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10chirurgia i wstrzyknięcie stereotaktyczne
Student Halsted-Mosquito HemostatsFine Scientific Tools91308-12chirurgia i wstrzyknięcie stereotaktyczne
Zestaw kauteryzatora małych naczyńFine Scientific Tools18000-00chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Sterylizatory z gorącymi kulkamiFine Scientific Tools18000-45chirurgia i iniekcja
stereotaktycznaFuterał na instrumenty z matą silikonowąFine Scientific Tools20311-21chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Plastikowe pojemniki do sterylizacji z matą silikonowąFine Scientific Tools20810-01chirurgia i iniekcja stereotaktyczna
Zakres fluorescencji 2P o stałym stopniu do obrazowania in vivoOlympusFV1200 MPEObrazowanie in vivo
LaserwielofotonowySpectraPhysicsMai Tai DeepSeeObrazowanie in vivo
Zielony laserOlympus473 nm Laseroweobrazowanie in vivo
baza translacyjna xyScientificaMMBPdo obrazowania in vivo
Fret do YFP i CFPOlympus do obrazowania in vivo
obrazowania in vivo
Obrazowanie in vivoNewport
zamówienie Światłoszczelna klatkaThorlabobrazowanie in vivo
Płytka studzienkowa Klej cyjanoakrylowy Highland chirurgia światłem izopropylowym Chirurgia Chirurgia Obiektywy zanurzeniowe 10x i 40x Olympus Stół powietrzny do zbudowane na

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
  2. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
  3. Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
  4. Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
  5. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
  6. Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
  7. Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998(2012).
  9. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
  10. Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
  11. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
  12. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
  13. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
  14. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
  15. Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519(2011).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  17. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
  18. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  19. Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CNiFERsNeurotransmitter DetectionGPCR ReceptorsFRET Calcium SensorHEK293 CellsLentivirus InfectionFACS AnalysisDose Response CurveIn Vivo InjectionTwo Photon Imaging

Related Articles