Artykuł metodologiczny

Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

DOI:

10.3791/53575

⸱

14 marca 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, and Swiss Institute of Bioinformatics, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Li Ka Shing Institute for Virology, University of Alberta, 5Regional Infectious Diseases Unit, University of Edinburgh, 6Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Alberta, 7Infection Biology, Department of Biomedicine, University of Basel, 8Clinical Microbiology, University Hospital Basel

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowane protokoły opisują dwie techniki oparte na enzymatycznym metodzie immunopochłaniania (ELISA) do szybkiego badania interakcji ligand-receptor: Pierwsza metoda pozwala na określenie stałej dysocjacji między ligandem a receptorem. Druga metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie peptydów blokujących interakcje ligand-receptor.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pełne zrozumienie ścieżek sygnałowych wymaga szczegółowej wiedzy dotyczącej interakcji ligand-receptor. W tym artykule opisano dwa szybkie i niezawodne punktowe protokoły enzymowo-związanych testów immunosorbentowych (ELISA) do badania interakcji ligand-receptor: bezpośredni test interakcji ligand-receptor (LRA) oraz konkurencyjny LRA. Jako przypadek studyjny przedstawiono analizę ELISA interakcji między różnymi interferonami lambda (IFNL) a alfa podjednostką ich receptora (IL28RA): bezpośredni LRA stosuje się do wyznaczania stałych dysocjacji (wartości KD) między receptorem a ligandami IFN oraz konkurencyjny LRA do wyznaczania zdolności hamującej oligopeptydu, który został zaprojektowany, aby konkurować z IFNL na ich miejscu wiązania receptorowego. Opisano analityczne kroki służące do oszacowania wartości KD oraz połowowej maksymalnej stężenia hamującego (IC50). Na koniec, w dyskusji podkreślono zalety i wady przedstawionej metody oraz w jaki sposób wyniki umożliwiają lepsze molekularne zrozumienie interakcji ligand-receptor.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pełne zrozumienie szlaków sygnałowych wymaga szczegółowej wiedzy na temat interakcji ligand-receptor. Większość metod oceny interakcji konkretnego ligandu z jego specyficznym receptorem jest droga, czasochłonna, wymagająca dużo pracy i wymaga specyficznego sprzętu i doświadczenia 1.

W tym artykule opisano dwa szybkie i niezawodne punkt po punkcie protokoły do badania interakcji ligand-receptor na podstawie enzymowego testu immunopochłaniania (ELISA): bezpośredni test interakcji ligand-receptor (LRA) i konkurencyjny test LRA. ELISA jest wysoce czułą, specyficzną i dostępną techniką, rutynowo stosowaną w prawie każdym laboratorium. ELISA może być wykonywany i dostosowywany na różne sposoby. Prezentowane protokoły są zoptymalizowane do badania interakcji między różnymi interferonami lambda (INFL) a ich receptorem.

Bezpośredni LRA umożliwia ilościową ocenę wiązania ligand-receptor w odniesieniu do stężenia ligandu, a tym samym daje krzywą wiązania. Stosując odpowiedni model interakcji ligand-receptor, dane można analizować dalej w celu oszacowania stałej dysocjacji (KD).

W przedstawionym protokole zastosowana jest powszechnie stosowana równanie Hilla do modelowania wiązania ligand-receptor. Chociaż inne metody, takie jak technologia rezonansu plazmonowego powierzchniowego 2,3, pozwalają na określenie powinności wiązania między dwoma białkami, ta technologia jest często pracochłonna, droga i wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego.

Konkurencyjny LRA umożliwia przesiewowe badanie peptydów inhibitorowych: wiązanie ligand-receptor jest ilościowo oceniane w odniesieniu do stężenia peptydu. Daje to krzywą dawkowanie-odpowiedź opisującą efekt inhibitorowy peptydu. Dane mogą być analizowane dalej w celu oszacowania połowniczej stężenia inhibitory (IC50) peptydu blokującego.

Oba protokoły ELISA są łatwe w użyciu i mogą być dostosowane do szerokiego zakresu pytań badawczych. Białka rekombinowane dowolnego rodzaju mogą być używane do rzetelnego i szybkiego określenia części interakcji. Ponadto konkurencyjny LRA może być używany do określenia krytycznych miejsc interakcji ligandów i receptorów za pomocą peptydów blokujących, które są zaprojektowane tak, aby naśladować ligand lub receptor. Jeśli peptyd blokujący wykazuje wydajne i specyficzne hamowanie, peptyd zajmuje krytyczne miejsce interakcji ligandu (jeśli peptyd naśladuje receptor) lub ligandu (jeśli peptyd naśladuje ligand).

Pierwszy protokół opisuje oznaczanie wartości KD dla różnych INFL i podjednostki alfa ich receptora, tzn. receptora interleukiny-28 (IL28RA) przy użyciu bezpośredniego LRA. Następnie drugi protokół pokazuje, jak określić zdolność 20-aminokwasowego peptydu do hamowania interakcji INFL-IL28RA. Peptyd jest zaprojektowany tak, aby konkurować z IFNL na ich miejscu wiązania receptorowego, a tym samym umożliwia zrozumienie molekularne interakcji. Ponadto ten peptyd może być użyty do blokowania IL28RA w eksperymentach in vitro w celu określenia wpływu na efekty sygnalizacji poniżej4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. Aby przygotować bufor do powlekania węglanu, rozpuścić 0,36 g Na2CO3 i 0,84 g NaHCO3w 100 ml destylowanej wody; sterylnie przefiltrować bufor za pomocą membranowego filtra polietersulfonowego (PES) o średnicy 0,22 μm napędzanego podciśnieniem i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
  2. Przygotować roztwór do płukania przez dodanie 0,05% v/v Tween 20 w buforze fosforanowym (PBS).
  3. Przygotować 5% roztwór albuminy krążącej byka (BSA) (roztwór blokujący) w roztworze PBS poprzez rozpuszczenie 5 g BSA (≥98%) w 100 ml PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Rekombinowany receptor, ligandy i peptydy blokujące
    1. Zrekonstruować rekombinowany ludzki receptor podjednostki alfa interleukiny (IL28RA) i rekombinowane ligandy z oznaczeniem His ludzkiego IFN (IFNL1-3) zgodnie z instrukcjami producenta i przechowywać w temperaturze -80°C. Syntetyzować peptydy blokujące i używać zgodnie z wcześniejszymi opisami 4. Użyć PBS do przygotowania różnych stężeń ligandów i peptydów do użycia w badaniach.
  5. Aby przygotować przeciwciało pierwotne, rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne mysie 6x His w PBS z 0,1% BSA w rozcieńczeniu 1:1 000. Aby przygotować przeciwciało wtórnego, rozcieńczyć przeciwciało wtórnego koziego przeciwko mysiemu IgG (H+L) sprzężonego z peroksydazą rzodkiewkową (HRP) w PBS z 0,1% BSA w rozcieńczeniu 1:10 000.
  6. Przygotować roztwór TMB przez zmieszany reagenty A i B zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Przygotować roztwór zatrzymania poprzez dodanie 5 N siarczany kwasu (H2SO4) w destylowanej wodzie i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Enzymatyczne testy immunosorbentowe (ELISA)

UWAGA: Przeprowadzić bezpośrednie oddziaływanie ligand-receptor ELISA (bezpośrednie LRA, Rysunek 1) można użyć do zmierzenia stałej dysocjacji receptor-ligand (KD), jako miary powinowactwa receptor-ligand. Konkurencyjne oddziaływania ligand-receptor ELISA (konkurencyjne LRA, Rysunek 2) pozwala na przesiewowe badania peptydów (oraz innych związków blokujących), które działają na zakłócenie interakcji między ligandem a receptorem. Podstawowy protokół, który został wcześniej opublikowany 5, został dodatkowo zoptymalizowany.
UWAGA: W obu metodach ELISA użyć wielociągowej pipety do dodawania roztworów do dołeczków płytki 96-dołęczkowej w każdym kroku. W krokach dekantacji roztworu lub płukania, wyrzucać roztwory bezpośrednio do zlewozmywaka.

  1. Test oddziaływania ligand-receptor (bezpośrednie LRA)
    UWAGA: Do zilustrowania przepływu pracy (patrz Rysunek 1).
    1. Powlekanie płytki z rekombinowanym receptorem
      1. Rozcieńczyć rekombinowany receptor w buforze węglanu do końcowej koncentracji 100 ng/µl. Powlekać dołki płytki mikrotytrowawczej 96-dołęczkowej z fiksowaną koncentracją receptora (100 ng/µl) przez pipetowanie 100 µl do każdego dołka za pomocą wielociągowej pipety. Wykluczyć zewnętrzne ściany płytki, aby uniknąć artefaktu krawędzi dołka. Pokryć płytkę pokrywką i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C O/N.
    2. Blokowanie i dodawanie ligandów
      1. Następnego dnia usunąć roztwór powlekający poprzez pochylenie płytki w kierunku zlewozmywaka i płukać płytkę 3 razy roztworem do płukania (PBS + 0,05% v/v Tween 20).
      2. Zablokować wolne miejsca wiązania receptora na powlekanej płytce za pomocą 200 µl 5% roztworu BSA do każdego dołka za pomocą wielociągowej pipety i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
      3. Wyrzucić roztwór blokujący (patrz krok 2.1.2.1.) i płukać płytkę 3 razy roztworem do płukania.
      4. Przygotować rekombinowane ligandy z oznaczeniem His w różnych stężeniach (np. 8 μg/ml, 4 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml, 0,125 μg/ml, 0,063 μg/ml, 0,031 μg/ml, 0,0 μg/ml) w PBS. Dodać tylko PBS w pustych dołkach.
      5. Dodać 100 µl każdego stężenia ligandu do dołków w dwóch egzemplarzach i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, umożliwiając oddziaływanie ligand-receptor.
    3. Inkubacja z przeciwciałami
      1. Po inkubacji z ligandami, płukać płytkę 3 razy roztworem do płukania.
      2. Pipetować 100 µl roztworu pierwotnego przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciwko His do każdego dołka.
      3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godzin

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stałą dysocjacji pomiędzy INFL1-3 a ich podjednostką receptora IL28RA wyznaczono za pomocą bezpośredniej LRA. Wyniki przedstawiono na Rysunku 3: Ułamek zajętych miejsc wiązania przedstawiono w przeliczeniu na logarytm odpowiedniej koncentracji IFN. Wykres Scatcharda danych przedstawiono w prawym dolnym rogu. Wyniki pokazują, że bezpośrednia LRA daje krzywą wiązania, którą można dalej analizować w celu oszacowania wartości KD. Wartość KD została określona przez dopasowanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ELISA jest standardową i sprawdzoną metodą dla wielu laboratoriów. Zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy wcześniej opublikowaną metodę 5,7. Przedstawiony krok po kroku protokół pokazuje, jak można go wykorzystać w prosty sposób do określania wartości KD interakcji ligand-receptor. Ponadto można wyznaczyć IC50 peptydu blokującego, który interfereuje z interakcją ligand-receptor.

Główne zalety to szybkie przygotowanie, łatwa preparacja odczynników i znajomość obsługi, ponieważ wi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.E. był wspierany przez granty badawcze z programu "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" Uniwersytetu w Bazylei, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel i Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. wyraża wdzięczność za stypendium iPhD inicjatywy SystemsX.ch w programie biologii systemowej (9th call).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy prof. J. Stellingowi (Departament Nauki o Biosystemach i Inżynierii, ETH Zurich oraz Szwajcarski Instytut Bioinformatyki, Basel, Szwajcaria) za krytyczną recenzję manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)Thermo Scientific442404Płytka ELISA
Sodium carbonate (Na2CO3)Merck497-19-8Do bufora powlekającego płytki ELISA
Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3)Merck144-55-8Do bufora powlekającego płytki ELISA
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7030-100G5% BSA w PBS do blokowania
rhIL-28Rα/IFNλR1R&D systems5260-MRRekombinowany ludzki receptor interleukiny-28 alfa
rhIL-29/IFNλ1R&D systems1598-IL/CFRekombinowany ludzki receptor interleukiny-29/Bez nośnika/C-końcowa metka 10-His
rhIL-28A/IFNλ2R&D systems1587-IL/CFRekombinowany ludzki receptor interleukiny-28A/Bez nośnika/C-końcowa metka 6-His
rhIL-28B/IFNλ3R&D systems5259-IL/CFRekombinowany ludzki receptor interleukiny-28B/Bez nośnika/C-końcowa metka 6-His
6x His Monoclonal antibody (Mouse)Clontech631212Pierwotne przeciwciało do uchwytywania ligandów z metką His
Goat anti-Mouse igG (H+L)Jackson Immuno Research115-035-166Przeciwciało wtórnie sprzężone z peroksydazą chrzanu
BDoptEIA TMB reagent setBD Biosciences555214ELISA - roztwór substratu TMB
Sulfuric acid (H2SO4)Fulka847205 N H2SO4 (Roztwór do zatrzymania reakcji enzymatycznej)
Synergy/H1 - Microplate readerBioTeKCzytnik płytek ELISA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
  2. Rossi, G., et al. Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity. Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).
  3. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance. Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).
  4. Egli, A., et al. IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza. PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).
  5. Rosenbluh, J., et al. Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays. Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).
  6. Goutelle, S., et al. The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling. Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).
  7. Levin, A., et al. Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration. PLoS One. 4, e4155(2009).
  8. Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections. Emerging infectious diseases. , e51(2014).
  9. Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. The structure of human interferon lambda and what it has taught us. J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).
  10. Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials. Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).
  11. Yuzlenko, O., Lazaridis, T. Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface. The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).
  12. Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase. Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcja ligand receptorpowinowactwo wi zaniatest konkurencjireceptor cytokinowysta a dysocjacjiwarto IC50interferon lambdapodjednostka alfa receptorapeptyd blokuj cy

Powiązane artykuły