Prezentowane protokoły opisują dwie techniki oparte na enzymatycznym metodzie immunopochłaniania (ELISA) do szybkiego badania interakcji ligand-receptor: Pierwsza metoda pozwala na określenie stałej dysocjacji między ligandem a receptorem. Druga metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie peptydów blokujących interakcje ligand-receptor.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pełne zrozumienie ścieżek sygnałowych wymaga szczegółowej wiedzy dotyczącej interakcji ligand-receptor. W tym artykule opisano dwa szybkie i niezawodne punktowe protokoły enzymowo-związanych testów immunosorbentowych (ELISA) do badania interakcji ligand-receptor: bezpośredni test interakcji ligand-receptor (LRA) oraz konkurencyjny LRA. Jako przypadek studyjny przedstawiono analizę ELISA interakcji między różnymi interferonami lambda (IFNL) a alfa podjednostką ich receptora (IL28RA): bezpośredni LRA stosuje się do wyznaczania stałych dysocjacji (wartości KD) między receptorem a ligandami IFN oraz konkurencyjny LRA do wyznaczania zdolności hamującej oligopeptydu, który został zaprojektowany, aby konkurować z IFNL na ich miejscu wiązania receptorowego. Opisano analityczne kroki służące do oszacowania wartości KD oraz połowowej maksymalnej stężenia hamującego (IC50). Na koniec, w dyskusji podkreślono zalety i wady przedstawionej metody oraz w jaki sposób wyniki umożliwiają lepsze molekularne zrozumienie interakcji ligand-receptor.
Wprowadzenie
W pełne zrozumienie szlaków sygnałowych wymaga szczegółowej wiedzy na temat interakcji ligand-receptor. Większość metod oceny interakcji konkretnego ligandu z jego specyficznym receptorem jest droga, czasochłonna, wymagająca dużo pracy i wymaga specyficznego sprzętu i doświadczenia 1.
W tym artykule opisano dwa szybkie i niezawodne punkt po punkcie protokoły do badania interakcji ligand-receptor na podstawie enzymowego testu immunopochłaniania (ELISA): bezpośredni test interakcji ligand-receptor (LRA) i konkurencyjny test LRA. ELISA jest wysoce czułą, specyficzną i dostępną techniką, rutynowo stosowaną w prawie każdym laboratoriu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Aby przygotować bufor do powlekania węglanu, rozpuścić 0,36 g Na2CO3 i 0,84 g NaHCO3w 100 ml destylowanej wody; sterylnie przefiltrować bufor za pomocą membranowego filtra polietersulfonowego (PES) o średnicy 0,22 μm napędzanego podciśnieniem i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
- Przygotować roztwór do płukania przez dodanie 0,05% v/v Tween 20 w buforze fosforanowym (PBS).
- Przygotować 5% roztwór albuminy krążącej byka (BSA) (roztwór blokujący) w roztworze PBS poprzez rozpuszczenie 5 g BSA (≥98%) w 100 ml PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- R....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stałą dysocjacji pomiędzy INFL1-3 a ich podjednostką receptora IL28RA wyznaczono za pomocą bezpośredniej LRA. Wyniki przedstawiono na Rysunku 3: Ułamek zajętych miejsc wiązania przedstawiono w przeliczeniu na logarytm odpowiedniej koncentracji IFN. Wykres Scatcharda danych przedstawiono w prawym dolnym rogu. Wyniki pokazują, że bezpośrednia LRA daje krzywą wiązania, którą można dalej analizować w celu oszacowania wartości KD. Wartość KD została określona przez dopasowanie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
ELISA jest standardową i sprawdzoną metodą dla wielu laboratoriów. Zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy wcześniej opublikowaną metodę 5,7. Przedstawiony krok po kroku protokół pokazuje, jak można go wykorzystać w prosty sposób do określania wartości KD interakcji ligand-receptor. Ponadto można wyznaczyć IC50 peptydu blokującego, który interfereuje z interakcją ligand-receptor.
Główne zalety to szybkie przygotowanie, łatwa preparacja odczynników i znajomość obsługi, ponieważ wi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
A.E. był wspierany przez granty badawcze z programu "SNSF Ambizione Score" (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" Uniwersytetu w Bazylei, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel i Bangeter Rhyner Stiftung. J.L. wyraża wdzięczność za stypendium iPhD inicjatywy SystemsX.ch w programie biologii systemowej (9th call).
Podziękowania
Dziękujemy prof. J. Stellingowi (Departament Nauki o Biosystemach i Inżynierii, ETH Zurich oraz Szwajcarski Instytut Bioinformatyki, Basel, Szwajcaria) za krytyczną recenzję manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | Płytka ELISA |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | Do bufora powlekającego płytki ELISA |
| Sodium hydrogen carbomnate(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | Do bufora powlekającego płytki ELISA |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA w PBS do blokowania |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-28 alfa |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-29/Bez nośnika/C-końcowa metka 10-His |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-28A/Bez nośnika/C-końcowa metka 6-His |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Rekombinowany ludzki receptor interleukiny-28B/Bez nośnika/C-końcowa metka 6-His |
| 6x His Monoclonal antibody (Mouse) | Clontech | 631212 | Pierwotne przeciwciało do uchwytywania ligandów z metką His |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Przeciwciało wtórnie sprzężone z peroksydazą chrzanu |
| BDoptEIA TMB reagent set | BD Biosciences | 555214 | ELISA - roztwór substratu TMB |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Roztwór do zatrzymania reakcji enzymatycznej) |
| Synergy/H1 - Microplate reader | BioTeK | Czytnik płytek ELISA |
Bibliografia
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
